Summary
Metafas att anafas övergång utlöses genom anafas-befrämjande komplex (APC / C)-beroende ubikitinering och påföljande destruktion av cyklin B. Här har vi etablerat ett system som, efter puls-chase märkning, medger övervakning cyklin B proteolys i hela cellpopulationer och underlättar detekteringen av störningar av den mitotiska kontrollpunkten.
Abstract
Jämn fördelning av kromosomer mellan de två dotterceller under celldelning är en förutsättning för att garantera genetisk stabilitet 1. Felaktigheter under kromosom separation är ett kännetecken för malignitet och i samband med progressiv sjukdom 2-4. Spindeln montering kontrollpunkten (SAC) är ett mitotiska övervakningsmekanism som håller tillbaka celler vid metafas tills varenda kromosom har etablerat en stabil bipolär anslutning till den mitotiska spindeln 1. SAC utövar sin funktion genom interferens med aktiverande APC / C-subenhet CDC20 att blockera proteolys av Sekurin och cyklin B och därmed kromosom separation och mitotisk avsluta. Felaktig fastsättning av kromosomer förhindrar tysta SAC signalering och orsakar fortsatt hämning av APC / C CDC20 tills problemet är löst för att undvika kromosom missegregation, aneuploidi och elakartade svulster 1.
De flesta studier som riktar den influence på felaktig kromosomal fastsättning på APC / C-beroende proteolysen utnyttjade spindel störningar med depolymerisering eller mikrotubuli-stabiliserande läkemedel för att störa kromosomal anknytning till mikrotubuli. Eftersom störningar mikrotubuli kinetik kan påverka transport och lokalisering av kritiska tillsynsmyndigheter, dessa förfaranden bär en risk för att inducera konstgjorda effekter 5.
Att studera hur SAC stör APC / C-beroende proteolysen av cyklin B under mitos i oberörd cellpopulationer har vi etablerat en histon H2-GFP-baserad system som tillät samtidig övervakning av metafas anpassning av mitotiska kromosomer och proteolys av cyklin B 6 .
Att skildra proteolytiska profiler, genererade vi en chimär cyklin molekyl B reporter med en C-terminal SNAP delen 6 (figur 1). I en egen märkning reaktionen är SNAP-gruppen kan bilda kovalenta bindningar medalkylguanin-bärare (SNAP-substrat) 7,8 (Figur 1). SNAP substratmolekyler är lätt tillgängliga och bär ett brett spektrum av olika fluorokromer. Chimära cyklin B-SNAP molekyler blir märkt vid tillsats av membran-permeabla SNAP substrat till odlingsmediet 7 (figur 1). Efter märkningsreaktionen faller cyklin B-SNAP fluorescensintensitet i en puls-chase reaktion-liknande sätt och fluorescensintensiteter återspeglar nivåerna av cyklin B nedbrytning 6 (figur 1). Vårt system underlättar övervakningen av mitotisk APC / C-beroende proteolys i ett stort antal celler (eller flera cellpopulationer) parallellt. Därigenom kan systemet vara ett värdefullt verktyg för att identifiera ämnen / små molekyler som kan störa proteolytisk aktivitet vid metafas att anafas övergång. Dessutom har som syntes av cyklin B under mitos nyligen föreslagits som en viktig mechanism främja en mitotiskt block i möss och människor genom att hålla cyklin B uttrycksnivåer stabila 9,10, gjorde detta system oss att analysera cyklin B proteolys som en del av en balanserad jämvikt 6.
Protocol
1. Sådd av U2OS-baserade cyklin B-SNAP Reporter celler (klon 11 celler 6) på objektglas Chamber
- Trypsinisera subkonfluenta celler SNAP reporter som tilläts växa asynkront i log-fas minst 48 timmar.
- Att arbeta med 8 väl mikroskop kammare (konstant fördelning av celler).
För ympning av celler på 8 väl mikroskop kammare vid en konstant fördelning över hela ytan av mikroskop kammaren, centrifug 10.000 celler och återsuspendera i 350 pl av fenolrött-fritt normalt tillväxtmedium (kompletterat med 10% fetalt bovint serum, penicillin / streptomycin och natriumpyruvat). Överför cellsuspensionen till mikroskopet kammaren (Figur 2).
Att arbeta med 8 väl mikroskop kammare (maximal celldensitet i mitten).
För ympning av celler vid en högre densitet i mitten av mikroskopets CHAMBer, ladda kammaren med 300 fil fenol röd-fri normalt tillväxtmedium. Lägg 5.000 celler försiktigt till mitten av mikroskopets kammaren (Figur 2).
Att arbeta med 96 väl speciella optik plattor (konstant fördelning av celler).
För ympning av celler på 96 brunnars plattor vid en konstant fördelning över hela ytan av brunnen, centrifugera 5.000 celler och återsuspendera i 300 fil fenol röd-fri normalt tillväxtmedium. Överför cellsuspensionen till en 96-brunnars platta. Beroende på det totala antalet celler som innehåller nödvändiga brunnar, justera cellantalet och den totala volymen av suspensionsmediet (figur 2).
Arbeta med 96 väl speciella optik plattor (maximal celldensitet i mitten).
För ympning av celler på 96 brunnars plattor, tillsätt försiktigt 1.500 celler i 15 | il av fenolrött-fritt normalt tillväxtmedium i en smalL droppe till mitten av varje brunn för att uppnå begränsning av celltillväxt till mitten av brunnen (Figur 2).
- Tillåt sådda celler att växa i minst 18 timmar under standardförhållanden för cellodling (37 ° C, 100% luftfuktighet, 5% CO 2).
2. Färgning av Reporter celler med SNAP Substrat
- 30 min före början av färgningsproceduren tillåter alikvoter av fenolrött-fritt normalt tillväxtmedium värmas upp till 37 ° C.
- För enkel hantering av SNAP substratet (i vårt fall TMR stjärna) upplösa TMR stjärna i DMSO för erhållande av en koncentration i förrådslösning av 400 pM, som kan lagras vid -20 ° C.
- Före färgning, späd 0,5 pl TMR Star stamlösning i 200 fil fenol röd-fri normalt tillväxtmedium (37 ° C) för att erhålla en slutlig märkning koncentration av 1 pM.
- Ta normalt odlingsmedium från asynkront växande celler och inkubera i Labeling mediet under 25 min under standardiserade odlingsbetingelser.
- Avlägsna märkning medium och tvätta celler fyra gånger med fenol röd-fritt normalt tillväxtmedium (37 ° C). Inkubera cellerna i 300 pl fenol röd-fri normalt tillväxtmedium (37 ° C) under 30 minuter. Före transport till mikroskopet ersätta mediet med färskt fenolrött normalt tillväxtmedium (37 ° C) för att avlägsna kvarvarande substrat obundet SNAP.
- Transport celler till mikroskop i en frigolit låda på en förvärmd (37 ° C) värmeblock för att minimera temperaturvariationer.
3. Mätning av fluorescensintensitet
- Två timmar före analysen justera lufttemperatur klimatkammaren till 37 ° C i torr läge för att bringa hela mikroskop med alla dess komponenter till den önskade temperaturen. Förvärmning innan du luftfuktigheten är viktigt att undvika kondens och efterföljande skador på mikroskopet.
- Justera t luftfuktighetO 60% och CO 2 till 5% före starten av analysen.
- Starta Scan ^ R Förvärv programvara och ange standardinställningar (se tabell 1).
- Definiera positionerna för brunnarna som skall analyseras.
- Definiera At (förvärv cykeltid) och det absoluta antalet förvärv cykler.
- Om en analys av ett större antal brunnar önskas, välj hårdvara autofokus, annars är det tillräckligt att använda programvara autofokus ensam.
- Starta förvärv och övervaka de första två förvärv cykler. Mikroskopet kommer att fokusera på histon H2-GFP-signal, med efterföljande förvärv av en första bild på den kanalen innan filtret byts och motsvarande TMR Star bild förvärvas (Figur 3). Detta upprepas sedan för alla positioner inom väl och för varje brunnarna som ska undersökas, innan du upprepar igen nästa cykel.
4. Analys av Proteolytisk profiler usjunga Scan ^ R
- Starta Scan ^ R-analys programvara och analysera bilder med cellkärnan, såsom visualiserades genom histon H2-GFP, definierad som huvudsyftet med användning av en tröskel baserad på signalintensitet och en vattendelare algoritm för att hjälpa till att separera angränsande celler. En subobject bestående av en kärna med cytoplasman bör skapas för TMRstar analys. (Viktiga egenskaper huvudsyfte är X och Y positioner, tid och maximal och genomsnittlig intensitet GFP för huvudsyfte och den totala intensiteten dividerat med område för TMRstar subobject.) Denna analys kan ta flera timmar beroende på stora uppgifter kvantiteter.
- Byt spåra läget för att visualisera subobject medelvärdet TMR Star fluorescensintensiteten över tiden (cell spår), tilldelas de analyserade viktigaste objekten (Figur 4). Antalet celler som skall undersökas kan inskränkas genom gating på dessa mätningar som varar minst 140 cykler och med en hög maximal intensitet av H2-GFP. Sökervid större antal celler kan en första representant och objektiv bild (Figur 4).
- Markera en cell spår av intresse att visualisera histon H2-GFP och TMR-Star fluorescens samtidigt vid en enda cell nivån (figur 5A).
- Använda Högerklicka på en cell av intresse och generera en exporteras bildgalleri för illustration av histon H2-GFP och cyklin B-SNAP TMR Star för varje tidpunkt.
- Byt till befolkningen läge för Scan ^ R Analys programvara och grind den region där cellen av intresse representerad på X vs Y punktdiagram (figur 5B).
- Applicera ett nytt fönster punktdiagram till gated regionen och visualisera innebär TMR Star fluorescensintensiteten över tiden (figur 5C).
- Exportera data (tid och fluorescensintensitet) till Microsoft Excel för vidare beräkningar.
5. Representativa resultat
Fig.ure 5D och 5E visar cyklin B kinetik, representerad av ett TMR Star fluorescensintensitet kurva, en cell som fortskrider genom en vanlig mitos utan tecken på kromosomal felinriktning (figur 5E). Vid packning av cytoplasman efter kärnhöljet uppdelning (NEBD, vilket framgår av den röda triangeln) visar TMR Star fluorescensintensitet en abrupt ökning tills isomorfa fönstret (ljusare område i diagrammet) nås när cellen går prometafas 6. Fluorescensintensitet kvar på en stabil nivå, så länge cellen fortsätter genom profas och metafas och sedan börjar sjunka snabbt när alla kromosomerna har etablerat en stabil metafas platta (figur 5D och 5E). Denna minskning föregår kromosom separation under anafas (blå prick på kurvan). I slutet av mitos kromatinet börjar decondense (blå staplar) och cellen antar interfas morfologi medan fluorescensintensiteten kurvan närmar sig enplatå som är lägre än platån före mitos (figur 5D och 5E).
Autofokus-inställningar | Histon H2-GFP (huvudsyfte förvärv inställningar) | Cyklin B-SNAP märkt med TMR Star (Förvärv inställningar) | Förvärv cykeltid Upprepningar |
Grova autofokus + / -39 nm 24 Lager Fin autofokus + / -5,4 Um 14 Lager | GFP-filter som: Slutartid: 100 msek Ljusintensitet: 25% | TRITC filter som: Slutartid: 150 msek Ljusintensitet: 33,3% | 2 till 5 minuter. |
GFP-filter som: Slutartid: 12 ms Ljusintensitet: 12,5% | Upp till 48 timmar av fortsatt analys (begränsas av minskad luftfuktighet av 60%) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
References
- Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
- Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
- Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
- Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
- Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
- Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
- Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
- Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
- Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).