Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Summary

Geçiş anafaz-teşvik kompleksi (APC / C)-bağımlı ubikuitinasyon ve burada siklin B. sonraki yıkım, biz, darbe-kovalamaca etiketleme sonrasında, bir sistem kurulmuş tüm hücre popülasyonlarında siklin B proteoliz izleme sağlar ve tetiklenir anafaz için metafaz mitotik geçiş noktasından müdahale tespitini kolaylaştırır.

Abstract

Hücre bölünmesi sırasında iki yavru hücre arasında kromozomların eşit dağılımı genetik değişmezlik ¹ garanti için bir ön koşuldur. Kromozom ayrılması sırasında yanlışlıklar malignite bir işaretidir ve ilerleyici bir hastalık ^2-4 ile ilişkilidir. Mili montaj noktası (SAC) her kromozom mitotik iğ ^1. istikrarlı bir bipolar eki kurmuştur kadar geri metafaz hücrelere tutan bir mitoz gözetim mekanizmadır. SAC aktive müdahale ederek işlevini uygular APC / C securin ve siklin B proteoliz ve böylece kromozom ayırma ve mitotik çıkış engellemek için subunit Cdc20. Kromozomların yanlış eki SAC sinyalizasyon susturulmalarını engeller ve problemi kromozom missegregation, anöploidi ve malign büyümeleri ¹ önlemek için çözülünceye kadar APC / C ^Cdc20 arasında devam inhibisyonu neden olur.

I ele çalışmaların çoğuAPC / C-bağımlı proteoliz üzerine uygunsuz kromozomal eki nfluence mikrotübüle kromozomal eki ile etkileşime ilaçlar depolimerizasyon veya mikrotübül-dengeleyici kullanarak mili bozulması yararlandı. Mikrotübül kinetiği müdahale ulaşım ve kritik düzenleyiciler lokalizasyonu etkileyebileceğinden, bu prosedürler suni etkileri ⁵ inducing bir risk taşıyor.

SAC mitoz sırasında APC / siklin B C-bağımlı proteoliz müdahale nasıl çalışma için hücre popülasyonlarının soğukkanlı, biz izin bir histon H2-GFP-tabanlı sistem kurulmuş metafaz mitotik kromozom uyumuna ve siklin B ⁶ proteolizin eşzamanlı izleme .

Proteolitik profilleri tasvir etmek için, bir C-terminal parçası SNAP ⁶ (Şekil 1) ile bir kimerik siklin B raportör molekül üretilir. Kendi kendine etiketleme reaksiyonunda, SNAP-parçası ile kovalent bağ oluşturabilenalkylguanine taşıyıcılar (SNAP substrat) ^7,8 (Şekil 1). SNAP yüzey molekülleri kolayca kullanılabilir ve değişik florokromlar geniş bir yelpaze taşırlar. Kimerik siklin B-SNAP molekülleri büyüme ortamı ⁷ (Şekil 1) zar-SNAP geçirgen alt tabakanın ilavesinden sonra etiketli hale gelir. Etiketleme reaksiyondan sonra, siklin B-SNAP floresans şiddetinin bir darbe-kovalamaca reaksiyon benzeri şekilde ve floresan yoğunlukları siklin B bozulması ⁶ (Şekil 1) düzeylerini yansıtacak düşer. Bizim sisteme paralel hücreleri (veya birkaç hücre popülasyonlarının) çok sayıda mitotik APC / C bağımlı proteolizin izlenmesini kolaylaştırır. Böylece, sistem aracıları / geçiş anafaz için metafaz de proteolitik aktiviteyi bozar edebiliyoruz küçük moleküller belirlemek için değerli bir araç olabilir. Ayrıca, mitoz sırasında siklin B sentezi gibi son zamanlarda önemli bir mechanis olarak öne sürülmüştürstabil siklin B ekspresyon düzeyleri ^9,10 tutarak farelerde ve insanlarda bir mitoz blok teşvik m, bu sistem bize dengeli bir denge ⁶ bir unsuru olarak siklin B proteoliz analiz sağladı.

Protocol

1. Mikroskop Odası Slaytlar üzerindeki U2OS tabanlı Siklin B-SNAP Reporter Hücreleri (Klon 11 Hücreler ⁶⁾ Tohum

1. En az 48 saat süreyle günlük aşamada uyumsuz büyümeye izin verildi subconfluent SNAP muhabiri hücreleri Trypsinize.
2. 8 sıra mikroskop odaları (hücre sabiti dağıtımı) ile çalışma.

Mikroskop bölmesinin bütün yüzey, santrifüj 10,000 hücreler boyunca sabit bir dağıtım az 8 iyi mikroskop odaları üzerine hücre tohumlama ve kırmızı fenol içermeyen normal büyüme ortamının 350 ul (% 10 fetal bovin serumu, penisilin / streptomisin ile takviye içinde tekrar süspansiyon için ve sodyum piruvat). Mikroskop odası (Şekil 2) hücre süspansiyonu aktarın.

8 sıra mikroskop odaları (merkezi maksimum hücre yoğunluğu) ile çalışma.

Mikroskop chamb merkezinde daha yüksek bir yoğunlukta hücreler tohumlanması içiner, fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme orta 300 ul odasına yerleştirin. Mikroskop odası merkezi (Şekil 2) dikkatlice 5.000 hücreleri ekleyin.

96 özel optik levhalar (hücre sabiti dağıtımı) ile çalışma.

De, tüm yüzeyi boyunca sürekli bir dağılımı 96 kuyucuğu üzerine hücrelerin tohumlama için 5.000 hücreler santrifüj ve fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme orta 300 ul tekrar süspansiyon haline getirin. 96 çukurlu bir levha için hücre süspansiyonu aktarın. Gerekli hücre içeren kuyu toplam sayısına bağlı olarak, hücre sayısı ve süspansiyon ortamının toplam hacmi (Şekil 2) ayarlayın.

96 özel optik levhalar (merkezinde maksimum hücre yoğunluğu) ile çalışma.

96 plakalar üzerine hücre ekimi için, dikkatli bir smal fenol red-free normal büyüme orta 15 ul 1.500 hücreleri ekleyiniyi merkezi (Şekil 2) ile hücre büyümesini sınırlandıran elde etmek için her bir kuyucuğa merkezine l damla.

3. Çekirdekli hücreleri standart hücre kültür koşullarında (37 ° C,% 100 nem,% 5 _CO2) altında en az 18 saat süreyle büyümesine izin verin.

2. SNAP Substrat ile Muhabir Hücrelerin boyanması

1. Öncesinde boyama işlemi başına 30 dk fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme orta alikotları 37 kadar ısınmasını bekleyin ° C
2. SNAP yüzey işlemesini kolaylaştırmak için (bizim durumumuzda TMR Star) -20 ° C'de saklanabilir 400 mcM stok solüsyonu, bir konsantrasyon elde etmek DMSO TMR Yıldızlı çözülür
3. Boyamadan önce, 1 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için etiketleme fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C) 200 ul içinde TMR Yıldız stok çözeltinin 0.5 ul seyreltin.
4. Uyumsuz büyüyen hücrelerin normal büyüme ortamı çıkarın ve l inkübestandart kültür koşulları altında 25 dakika boyunca ortam abeling.
5. Fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C) ile orta ve yıkama hücreleri dört kez etiketleme çıkarın. 30 dakika için fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C) 300 ul hücre inkübe edin. Önce mikroskop taşımadan rezidüel ilişkisiz SNAP substrat kaldırmak için taze fenol kırmızısı içermeyen normal büyüme ortamı (37 ° C), orta değiştirin.
6. Bir önceden ısıtılmış bir styrofoam kutu içinde mikroskop için Aktarım hücreleri (37 ° C) sıcaklık değişimi en aza indirgemek için ısı blok.

3. Floresan Yoğunluğu Ölçümü

1. Önceki analiz için iki saat ° C kuru modunda istenilen sıcaklık bütün bileşenleri ile tüm mikroskop getirmek için 37 iklim odasının hava sıcaklığını ayarlamak. Ön ısıtma nem ayarlamadan önce mikroskop yoğuşma ve sonraki hasarı önlemek için önemlidir.
2. Hava nemi t ayarlayıno% 60 ve analiz başlangıç ​​önce CO _2-5%.
3. Tarama ^ R Toplama yazılımını başlatın ve standart ayarlar (bkz. Tablo 1) tanımlayabilirsiniz.
4. Analiz edilecek kuyuların konumlarını tanımlayın.
5. Dt (iktisap çevrim süresi) ve iktisap döngüleri mutlak sayısını tanımlayın.
6. Kuyuların daha yüksek bir dizi analizi istenirse, donanım otofokus seçmek, aksi halde tek başına yazılım otofokus kullanmak için yeterlidir.
7. Edinimi başlatın ve ilk iki satın alma döngüsü için denetleyecek. Filtre değiştirilir ve buna karşılık gelen görüntü TMR Yıldız (Şekil 3) elde edilir önce mikroskop bu kanal içinde bir birinci görüntü sonraki toplama ile, histon H2-GFP sinyali üzerine odaklanacaktır. Bu tekrar sonraki döngüsü tekrarlanmadan önce, iyi içinde ve incelenmesi gereken kuyuların her biri için tüm pozisyonlar için tekrarlanır.

4. Proteolitik Profiller u analiziTarama ^ R şarkı

1. Tarama ^ R Analiz yazılımını başlatın ve hücre çekirdekleri ile görüntüleri analiz olarak sinyal şiddeti ve komşu hücreleri ayıran yardımcı olmak için bir dönüm algoritmasına dayanan bir eşik kullanarak, ana nesne olarak tanımlanan histon H2-GFP, gözlemlenmiştir. Sitoplazma ile bir çekirdek içeren bir subobject TMRstar analiz için oluşturulmalıdır. (Ana nesne Önemli özellikleri X ve Y konumlarını, saat ve maksimum ve ana nesne ve TMRstar altnesnesi için alanına bölünmesiyle toplam yoğunluğunun GFP yoğunluklarını demek.) Bu analiz işlem büyük veri nedeniyle birkaç saat sürebilir miktarları.
2. Analiz ana nesneleri (Şekil 4) atanan zamanla altnesnesi ortalama TMR Yıldızlı floresan yoğunluğu (hücre izleri), görselleştirmek modu iz değiştirin. Incelenmesi gereken hücre sayısı en az 140 devir süren bu ölçümlere gating ile ve H2-GFP yüksek bir maksimum yoğunluğu ile daralmış olabilir. Lookinghücrelerin daha fazla sayıda bir ilk temsilcisi ve objektif bakış (Şekil 4) sağlar.
3. Tek hücre düzeyinde (Şekil 5A) aynı anda histon H2-GFP ve TMR Yıldızlı floresans görselleştirmek için ilgi bir hücre iz seçin.
4. Ilgi bir hücre üzerinde sağ klik kullanarak ve histon H2-GFP ve siklin B-SNAP her zaman noktası için TMR Star illüstrasyon için verilebilir bir resim galerisi oluşturmak.
5. Tarama ^ R Analiz yazılımı ve kapısı ilgi hücresi X vs Y nokta arsa (Şekil 5B) temsil edilmektedir bölgenin nüfusu moduna değiştirin.
6. Geçitli bölgeye yeni bir nokta çizim penceresinde Uygula ve zamanla TMR Yıldızlı floresan yoğunluğu (Şekil 5C) demek görselleştirmek.
7. Daha fazla hesaplama için Microsoft Excel İhracat verileri (zaman ve floresan yoğunluğu).

5. Temsilcisi Sonuçlar

Incirure 5D ve 5E bir hücre bir TMR Yıldız floresans yoğunluk eğrisi ile temsil siklin B kinetiği, Resmedeceğiniz kromozomal kayma belirtileri (Şekil 5E) olmadan normal mitoz yoluyla ilerler. Hücre prometafaz ⁶ girdiğinde izomorf penceresi (diyagramdaki parlak bölge) ulaşılana kadar nükleer zarf dökümü (NEBD gibi kırmızı üçgen ile gösterilir) takiben sitoplazma sıkıştırma üzerine, TMR Yıldızlı floresan yoğunluğu ani bir artış gösterir. Floresan yoğunluğu profaz ve metafaz hücre aracılığıyla ilerledikçe sürece istikrarlı bir düzeyde kalır ve daha sonra tüm kromozomlar (Şekil 5D ve 5E) istikrarlı bir metafaz plakası kurduk sonra hızla düşmeye başlar. Bu düşüş anafaz (eğri üzerinde mavi nokta) sırasında kromozom ayırma önce gelir. Geç mitoz yılında kromatin decondense başlar (mavi çubuk) ve floresan yoğunluğu eğrisi yaklaştığında ise hücre interfaz morfolojisi benimsermitoz (Şekil 5D ve 5E) önce plato daha düşüktür plato.

Tablo 1. Siklin B proteolizin analizi için kullanılan standart olarak ayarlar. Histon H2-GFP siklin B-SNAP floresans yoğunluğunu ölçülmesi için odak düzlem tanımlamak için bir yapı referans olarak kullanılmıştır. Birikimli fototoksisite önlemek için görüntü alma ayarlara göre odaklama işlemi sırasında düşük ışık yoğunluğu vardır.

Şekil 1. Endojen protein benzer çözünme özelliklerine sahip bir kimerik siklin B türevinin ifade yoluyla siklin B proteolizin ölçüm şematik. Darbe-kovalamaca etiketleme sonra floresan yoğunluğunda azalma APC / C-aktivitesinin bir ölçüsüdür.

Şekil 2. 8 kuyu slaytlar veya 96 kuyucuğu üzerindeki hücrelerin analizi. Düzenli dağılımıiyi bir yüzey üzerinde hücreler 300 ul nihai hacim içinde yeniden süspansiyon elde edilir ve tek tek bir veya birkaç sıra el ile analiz için tanımlanan ise tavsiye edilir. Merkezi bölge içinde hücrelerin zenginleştirilmesi önceden doldurulmuş ya da hazneyi merkezine hücrelerin eklenmesi ile elde edilir. Bu tekniği farklı kuyularda otomatik görüntü elde etme durumunda tavsiye edilir.

Şekil 3,. Veri toplama sırası. Histon H2-GFP A) Algılama mitoz sırasında kromozom uyum odak düzlemi tanımı ve izlenmesi için kullanılır. B) TMR Yıldız floresans şiddetinin Floresan yoğunluğu siklin B-SNAP etiketli darbe takibin mutlak miktarı için bir ölçüdür.

Şekil 4. Ortalama TMR Yıldız Temsilcisi Tarama ^ R Analiz yazılım tabanlı tasvirizamanla floresan yoğunlukları (alanına bölünmesiyle toplam TMRstar yoğunluğu). temsili bir hücre trace (mavi) seçimi. Ilgili görüntüleri (sağda gösterildiği gibi) eş zamanlı görselleştirme izin histon H2-GFP (yeşil) ve siklin B-SNAP (kırmızı). büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5. A + B) XY-nokta arsa üzerinde bir ilgi hücre temsil nokta yolluk örneği. C) zamanla ortalama TMRstar floresan yoğunluğu (alan tarafından ayrılan toplam TMRstar yoğunluğu) Görselleştirme nokta arsa kullanarak. D + E), Microsoft Excel'de oluşturulmuş gibi NEBD (nükleer zarf dökümü) ve kromatin yoğunlaşması (mavi bar) arasında izomorf penceresi (diyagramda brigher alanı) siklin B-SNAP Temsilcisi floresans yoğunluk eğrisi. Anafaz t gösterilireğri üzerinde o mavi nokta. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Film 1. tamamlayıcı filmi görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Biz burada siklin B proteoliz ve kromozom uyum eşzamanlı izleme kolaylaştıran bir canlı hücre görüntüleme tabanlı bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yaklaşım mitotik kontrol çalışması tek hücre düzeyinde hücre popülasyonu soğukkanlı sağlar. Siklin B degradasyon eğrileri APC / C aktivitesini doğrudan içten kolaylaştırmak ve böylece dolaylı SAC ⁶ durumunu yansıtmaktadır.

Bu yaklaşım, olsa Tarama ^ R yazılım dayalı kurulan, kolayca herhangi bir karşılaştırılabilir mikroskop istasyonu çoğaltılabilir. Ayrıca, bizim retroviral siklin B-SNAP ifade yapısı kullanılarak, bir muhabir hücre hattı kolaylıkla istenilen hücre hattı içine istikrarlı retroviral entegrasyonu ile kurulabilir. Sistem daha esnek hale getirmek için, kimerik SNAP proteinler çeşitli florokromlar ile lekeli olabilir.

Izleme kromozom hizalama, li kendi ihtiyacı dışında histon H2-GFP, uygulanmasıhızlı ve kolay netleme litates. Otofokus ve yoğunluğu ayarları da hücre türüne bağlıdır ve her bir hücre hattı oluşturulmalıdır. Tarama ^ R teknolojisi kullanılarak hücre bölünmeleri çok sayıda proteolitik profilleri edinimi ayrıca bize kromozom hizalama hatalarını gösterdi tek mitoz için seçmek için izin verdi. Bu bize anormal ve normal bölünmeler ⁶ proteolitik profilleri arasındaki farklılıkları tanımlamak için etkin.

Bu daha az zaman etkili olmakla birlikte kromozomal eksenel sergileyen mitoz aynı zamanda, ham yığın görüntü analizi yolu ile seçilebilir. Siklin B-SNAP floresan yoğunlukları gibi ImageJ gibi görüntü analizi için ücretsiz programlar kullanılarak ölçülebilir. Floresans yoğunluğunu eğrileri mitotik hücre (Wolthuis ve arkadaşları tarafından tarif yöntem. ¹¹⁾ belirleyen bir bölge / kapısı içinde zaman üzerinden elde edilen ortalama piksel şiddeti göre hesaplanabilir. Bir izovolümetrik penceresi içinde, hangi tarif olmuşturd önceden ^6, şekil ve hücre hacmi hemen hemen sabit kalır. Bu elle prometafaz, metafaz ve erken anafaz sırasında siklin B proteoliz tahmin ortalama piksel yoğunlukları ölçmek için erken anafaz kadar nükleer zarfın dökümü arasındaki aynı bölgede / kapısı kullanmak için bir gerekçe sağlar.

Tarama ^ R-temelli bir yaklaşım kullanarak, Microsoft Excel gibi özel bir yazılım kullanarak bozunma eğrileri, daha ileri matematiksel analizleri tek hücre düzeyinde perdeleme gerektirir. Tüm analiz hücrelerin otomatik veri ihracat izin Yenilikçi yolluk stratejileri tüm hücre popülasyonlarının bir kez daha verimli analizi kolaylaştırmak olabilir. Tüm hücre izlerini kapsayan bir tam otomatik bir yaklaşım, daha fazla temsil sonuçlara yol daha bu tekniğin hassasiyeti artırmak ve dolayısıyla mitotik çıkış regülasyonu derinleşmesine vesile kolaylaştırabilir.

Hızlı ve verimli otomatik görüntü elde etme bizim model t sağlaro büyük ölçekli tarama analizlerinde kullanılabilir. Burada, shRNA kütüphaneleri kullanarak ekranlar romanı mitotik düzenleyicilerin tanımlanmasına yol açabilir. Dahası sistem, antimitotik tedavisi için yeni ilaçların belirlenmesi için APC / C bağlı proteoliz ile müdahale kendi güç bakımından küçük moleküllerin de yararlı olacaktır.

Siklin B kinetiği yaygın siklin B-GFP floresan yoğunlukları izlenerek ele alınmıştır. Burada, tam protein ifadesi siklin B proteolizin çizimi kolaylaştırır ve dolayısıyla mitoz alanında ⁶ yaygın olarak dağıtılan teknikleri için değerli bir değişiklik mahiyetinde olan bir sistem sunuyoruz.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz pLPCX-Histon H2-GFP plazmid sağlamak için S. Taylor minnettarız. Biz sürekli destek için R. Mertelsmann ederim. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft tarafından desteklenmiştir.

Materials

Otofokus ayarları	Histon H2-GFP (ana nesne toplama ayarları)	TMR Yıldız ile etiketlenmiş Siklin B-SNAP (Satın alma ayarları)	Toplama döngü süresi Tekrarlar
Kaba otofokus + / -39 mikron 24 Katmanlar Güzel otofokus + / -5.4 Mikron 14 Katmanlar	GFP filtresi ayarlayın: Pozlama süresi: 100 ms Işık yoğunluğu: 25%	TRITC filtre ayarlayın: Pozlama süresi: 150 ms Işık yoğunluğu: 33.3%	2-5 dk.
GFP filtresi ayarlayın: Pozlama süresi: 12 ms Işık yoğunluğu:% 12.5			Yukarı devam analiz 48 saat (% 60 daha az hava nemi ile sınırlı)

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reporter cell line	generated in-house as described 6	clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells)
Retroviral cyclin B-SNAP expression vector	generated in-house as described 6	pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP
Phenolred-free DMEM	Gibco	21063-029	Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required
SNAP-Cell TMR-Star	New England Biolabs	S9105S	Stock solution 400 μM in DMSO
Special Opstics Plate, 96 well	Costar	3720
μ-Slide 8 well, ibiTreat	Ibidi	80826
Microscopy unit	Olympus	IX-81 inverse microscope with climate chamber
Objective	Olympus	UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75)
Acquisition software	Olympus	Scan^R Acquisition software (v.2.2.09)
Analysis software	Olympus	Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6)