Summary
Vi beskriver en ny fremgangsmåde til isolering af genomisk DNA fra fuldblod ved plasma / serologi. Efter plasma kollektion er den komprimerede blodet normalt kasseres. Vores hidtil ukendte fremgangsmåde udgør en betydelig forbedring i forhold til eksisterende metoder og gør DNA og plasma fås fra en enkelt samling, uden at anmode om yderligere blod.
Abstract
Laboratorieundersøgelser kan gøres på de cellulære eller flydende dele af blodet. Anvendelsen af forskellige blodopsamlingsrør bestemmer del af blodet, der kan analyseres (fuldblod, plasma eller serum). Laboratorier involveret i at studere den genetiske grundlag af menneskelige lidelser er afhængige af antikoaguleret fuldblod opsamlet i EDTA-holdige Vacutainer som kilde af DNA til genetisk / genomisk analyse. Fordi de fleste kliniske laboratorier udfører biokemiske, serologiske og viral afprøvning som et første skridt i fænotypisk udfald undersøgelse, antikoaguleret blod også opsamlet i heparin-holdige rør (plasma rør). Derfor når DNA og plasma er nødvendige for samtidige og parallelle analyser af både genomiske og proteomiske data, er det almindeligt at samle blod i både EDTA og heparin rør. Hvis blod kan indsamles i et enkelt rør, og tjene som en kilde til både plasma og DNA, ville denne metode blive betragtet som en avancement til eksisterende methods. Brugen af den komprimerede blod efter plasma udvinding repræsenterer en alternativ kilde til genomisk DNA, og dermed minimere mængden af blod behandlede prøver og reducere antallet af nødvendige prøver fra hver patient. Dette ville i sidste ende spare tid og ressourcer.
BD P100 blodtapning system til plasmaprotein konservering blev oprettet som en forbedret metode i forhold til tidligere plasma eller serum samling rør 1, for at stabilisere proteinindholdet i blodet, så bedre protein biomarkør opdagelse og proteomics eksperimenter fra humant blod. BD P100 rør indeholder 15,8 ml spraytørret K2EDTA og en frysetørret proprietære bredspektret cocktail af proteaseinhibitorer for at hindre koagulation og stabilisere plasmaproteiner. De omfatter også en mekanisk separator, som giver en fysisk barriere mellem plasma og cellebundfald efter centrifugering. Kun få metoder er blevet udviklet til at udvinde DNA fra størknet blod samples indsamlet i gamle plasma rør 2-4. Udfordringer fra disse metoder blev primært forbundet med den type separator inde i rørene (gel separator) og omfattede vanskeligt inddrive størknet blod, besværet med fragmentering eller dispergering af blodprop, og obstruktion af blodprop ekstraktion ved separation gelen.
Vi præsenterer den første metode, som trækker og renser genomisk DNA fra blod trukket i de nye BD P100 rør. Vi sammenligne kvaliteten af DNA-prøven fra P100 rør til at fra EDTA-rør. Vores tilgang er enkel og effektiv. Det indebærer fire store trin som følger: 1) brug af et plasma BD P100 (BD Diagnostics, gnister, MD, USA) rør med mekanisk separator for blodprøvetagning, 2) fjernelse af den mekaniske separator ved hjælp af en kombination af saccharose og en steril papirclips metallisk krog, 3) udskillelse af buffy coat lag indeholdende de hvide celler og 4) isolering af genomisk DNA fraBuffy coat hjælp af en almindelig kommerciel DNA ekstraktion kit eller en lignende standard protokol.
Protocol
1.. Sample Collection
- Saml blodprøver fra personer med ordentlig informeret samtykke. For hvert individ, uafgjort 4 til 5 ml blod i en P100 rør (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). Til sammenligningsformål indsamle samtidig blod i et EDTA rør.
- BD P100 rør indeholder 15,8 ml spraytørret K2EDTA og et frysetørret proprietære bredspektret cocktail af proteasehæmmere for at hindre koagulation og stabilisere plasmaproteiner. De indeholder også en mekanisk separator. Efter opsamling af fuldblod, holde begge rør ved stuetemperatur i 60 minutter til natten over, indtil behandlingen opstår.
- Centrifuger BD P100 rør ved 2.500 g i femten minutter ved stuetemperatur. Overfør plasma opsamlet over den mekaniske separator i mikro-centrifugerør.
- Opbevar P100 rør, der indeholder blod, komprimeres under separator, ved -80 ° C, indtil du er klar til at begynde DNA ext-fraktion.
2.1 Fra blod P100 rør (P100_DNA)
- P100 rør opbevaret ved -80 ° C efter plasma ekstraktion. Inden for 3 til 4 måneder, hente P100 røret med komprimerede blod fra fryseren og optø ved 37 ° i et vandbad i 5 min (figur 1A). Fjern eventuelle rester plasma, der sidder over separatoren. Tilsæt 2 ml 17% sucroseopløsning (gradient løsning testet i hus - upublicerede data) i P100 rør over separator (figur 1B). Centrifuger rørene ved stuetemperatur i 20 minutter ved 2.500 g, denne proces skubber den mekaniske separator til toppen af røret og yder tre lag opløsning indeholdende buffy coat (figur 1C). Manuelt udtrække separatoren ved hjælp af en steriled kroget metal papirclips (figur 1D).
- Når du har hentet den mekaniske separator fra hvert rør (figur 1D), fjerne og der ad den øverste saccharose lag. Overfør det midterste lag, der repræsenterer buffy coat (BC) lag, i en steril 15 ml konisk rør. Tilføj phosphatpuffersaltopløsning (PBS) for at øge buffy coat volumen til 3 ml. Uddrag DNA fra fibrinlaget anvendelse af reagenser fra Qiagen Puregene blodsættet som pr fabrikantens anbefaling, undtagen en centrifugering hastighed på 2.500 g (i stedet for 2.000 g).
- At lysere og fjerne de røde blodlegemer (RBC), der tilsættes 9 ml RBC til 3 ml buffy coat. Invert hvert rør flere gange og inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter med lejlighedsvis vende under inkubation. Spin hver blanding nede ved 2.500 g i 5 min, og supernatanten. Rense resterende pellet i hvert rør med 3 ml cellelysis løsning og vortex i 15 sek. Behandl lysatet med 1 ml proteinudfældelse løsning og vortex i 15 sek.
- Centrifugeres ved 2.500 g i 5 min og overføre supernatanten til et rent 15 ml koniske rør indeholdende3 ml 100% isopropanol. Vend de nye rør 10 gange og centrifugeres ved 2.500 g i 3 min. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 1 ml 70% ethanol. Vend de koniske rør et par gange for at fjerne og vaske DNA pellet. Centrifuger ved 2.500 g i 1 min. Tillad pellet tørre i 3 minutter (anbringes glasset på hovedet) ved stuetemperatur og derefter suspendere DNA'et med 250 ml rehydrering opløsning ved 37 ° C i 10 min og overføres til en præ-mærket 1,7 ml mikrorør. Opbevar rør ved -80 ° C indtil anvendelse.
2.2 Fra Blood EDTA Ttube (EDTA_DNA)
- Helblodet til rutinemæssig immunohematology test opsamles i plast vaccutainer rør spray-coatet med 10,8 mg K 2 EDTA og opbevaret ved -80 ° C. Fordi rørene ikke indeholder en mekanisk separator, betyder DNA-ekstraktion ikke omfatter de trin, der involverer den mekaniske separator (2.1.1 og 2.1.2).
- Inden for 3 til 4 måneder af blod opbevaring, DNA er udvundet ved hjælp af KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Det er en automatisering DNA-ekstraktion system baseret på magnetisk partikel teknologi og består af cellelysering / DNA bindende, adskillige vaske trin og DNA eluering.
- Kittet anvendes i DNA-ekstraktion er KingFisher Flex 24 DNA Blood Kit (Qiagen, Tyskland).
3.. DNA mængde og kvalitet Assessment
Den mængde, kvalitet og integritet genomisk DNA blev vurderet ved en kombination af metode, som omfatter PicoGreen, spektroskopi og elektroforese.
- Koncentrationen af det genomiske DNA bestemmes ved NanoDrop og PicoGreen kvantificering.
- Renheden bestemmes ud fra 260/280 til måling på NanoDrop spektrofotometer.
- Prøven (500 ng) er også indlæst på 1% agarosegel for at vurdere integriteten (nedbrydning) af DNA'et.
4.. Genotyping Analyser og kvalitetskontrol
- Fem P100_DNA og deres tilsvarende EDTA_DNA prøver tilfældigt udvalgt til yderligere analyse ved hjælp af brugerdefinerede Immunochip (Immuno DNA Analysis BeadChip). Immunochip er en Infinium genotypebestemmelse chip, der indeholder 196.524 polymorfier og er designet til immunogenetic undersøgelser 5.
- For hver prøve er 200 ng DNA amplificeret, fragmenteret, fældet og resuspenderet i passende hybridiseringspuffer.
- De denaturerede prøver hybridiseret på Immunochips ved 48 ° C i mindst 16 timer.
- Efter hybridisering Immunochips behandles for enkelt-base extension reaktioner og farves.
- De immunochips derefter filmede med Illumina Hiscan Bead vifte læser og de normaliserede perle intensitet data er indlæst i Illumina GenomeStudio software og omdannet til genotyper. Genotyper kaldes vha. autocalling algoritmen af GenomeStudio. Kvalitetskontrollen ivolves udelukkelse af enkelt nukleotid polymorfier (SNP) med en opfordring rate <95%.
- SNP indkrævningssats bruges som et mål for immunochip analysen effektivitet. Den beregnes som den procentdel af det samlede antal af assays på chippen (196.524 SNPs kodet på hver chip) at opnå tilstrækkelig signalintensitet og kvalitet til at modtage en automatiseret genotype opgave. Høj kvalitet DNA (260/280 forholdet 1,8 eller højere og fravær af nedbrydning) forventes at opnå mindst samme takst som HapMap kontrol-DNA indeholdt i immunochip analysen. Kvalitetskontrol indebærer udelukkelse af SNPs med en opfordring rate <95% i hvert datasæt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA kvalitetsvurdering og koncentrationsmåling
Udbytterne af P100_DNAs var betydeligt lavere end EDTA_DNAs (tabel 1 og 2). DNA renheden repræsenteret ved sin 260/280 forholdet værdi er den samme for både P100_DNA og EDTA_DNA prøvesæt (tabel 1 og 2). Kvaliteten af DNA'et er ret ensartet inden for hvert sæt prøve selvom nogle nedbrydning ses i EDTA_DNA prøver, som indikeret af lys smear (figur 2). De EDTA_DNAs der viste flere tegn på nedbrydning viste også reduceret DNA-koncentration.
Genotypebestemmelse
Genotypebestemmelse takst for både EDTA_DNAs og P100_DNAs blev sammenlignet. De gav tilsvarende takster og var begge sammenlignes med den interne HapMap kontrol-DNA (tabel 3).
Figur 1. Buffy coat isolation.
Tabel 1. DNA-prøve udbytte (PicoGreen), og forholdet (NanoDrop).
| DNA Yield | DNA Renhed | |||
| Prøver | P100 | EDTA | P100 | EDTA |
| 1 | 135 | 340 | 1,79 | 1.9 |
| 2 | 119 | 344 | 1.85 | 1,89 |
| 3 | 57 | 129 | 1.88 | 1.88 |
| 4 | 159 | 640 | 1,86 | 1.88 |
| 5 | 140 | 430 | 1,86 | 1.88 |
| 6 | 150 | 673 | 1,86 | 1.9 |
| 7 | 139 | 425 | 1,74 | 1.88 |
| 8 | 118 | 240 | 1,87 | 1,86 |
| 9 | 51 | 86 | 1,87 | 1,83 |
| p-værdi | p = 0,00221 | p = 0,09836 | ||
Tabel 2. Sammenligning af udbytte og renhed (tosidede, parret Sample t-test).
| Genotypebestemmelse Cell Rate | ||
| Prøver | P100 | EDTA |
| 1 | 97,9 | 97,5 |
| 2 | 97,9 | 97,8 |
| 4 | 97,4 | 97,5 |
| 7 | 97,5 | 98,2 |
| 8 | 97,9 | 98 |
| P-værdi | p = 0,67970 | |
Tabel 3. Genotypebestemmelse takst (tosidede, parret Sample t-test).
| Prøver | Lag | Udbytte (ug) | Forholdet (260/280) |
| Buffy coat | 150 | 1,86 | |
| RBC | 4.13 | 1,73 | |
| P100_07 | Buffy coat | 139 | 1,74 |
| RBC | 1.00 | 1,70 | |
| P100_08 | Buffy coat | 118 | 1,87 |
| RBC | 3.72 | 1,78 | |
| P100_09 | Buffy coat | 51 | 1,87 |
| RBC | 0.23 | 0.98 |
Appendiks. Evaluering af mængden af DNA fundet i røde blodlegemer (RBC) lag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange menneskelige sygdomme har genetiske årsager og udforske det genetiske grundlag for sygdomme hos mennesker kræver en stigende høj kvalitet DNA. Den mest almindelige kilde af DNA, der anvendes i genetiske undersøgelser er antikoaguleret fuldblod. Fordi de fleste kliniske laboratorier udfører biokemiske, serologiske og viral afprøvning som et første skridt i fænotypisk udfald undersøgelse, blodet ofte opsamles i et plasma rør. Efter opsamling af plasmaet, er den komprimerede blod ofte kasseres. Derfor, når DNA er nødvendig for at gennemføre genetiske undersøgelser eller afprøvning, er en ekstra blodprøve kræves fra den samme patient. Kasseret komprimerede blod udgør en potentiel kilde til DNA som det indeholder hvide blodlegemer. Derfor bruger komprimeret blod fra plasma rør giver mulighed for at bruge indsamlede blodprøve mere effektivt, uden at det er nødvendigt at trække overskydende blod eller husker patienten for yderligere blod.
Forskellige metoder til at extarmkanalen DNA fra hvide blodlegemer af sammenpresset eller størknet blod er rapporteret 6-10. De fleste af de udfordringer, disse metoder var forbundet med design af plasma kollektionen røret. Tidligere plasma opsamlingsrør indeholdt en separator fremstillet af en gel (gel separator), som, når centrifugeret, dannede en barriere for at adskille blodlegemer (fanget under separatoren) fra plasmaet (placeret over separatoren). For at undgå kontaminering af de blodlegemer, med gel materiale, skal separator først fjernes forsigtigt fra røret 11.. Dette efterfølges af en opsplitning af blodprop at garantere en effektiv DNA-ekstraktion. Fragmenteringen proces ofte resulterer i et betydeligt tab af blodprøve og en reduktion i DNA-udbytte. At minimere prøve tab og forbedre processen blev en lille pore-net anvendes til mekanisk dispergerede blodprop i små stykker 12, men fragmentering stadig påvirket DNA udbytte og kvalitet og eHven udgjorde en sundhedsfare for teknikeren 13..
BD P100 rør fra BD Bioscience er den nyeste generation af plasma opsamlingsrør evalueret i multicenter immunologisk forskningsundersøgelse 14.. Ligesom de tidligere plasma rør, indeholder de antikoagulanter for at forhindre koagulation og proteasehæmmere at stabilisere plasmaproteiner. Den største nyskabelse i BD P100 røret bosat i den mekaniske separator (ikke en gel separator) inde hvert rør. Den mekaniske separator tilvejebringer også en fysisk barriere mellem plasma og cellepelleten efter centrifugering, men i modsætning til gel separator, ingen risiko for kontamination af prøverne ved en gel tilbyder. Protokollen anvendes i denne undersøgelse omfatter ikke en opsplitning, og derfor er der ingen sundhedsfare risiko.
DNA'et blev ekstraheret fra buffy coat, ved hjælp af et kommercielt kit protokollen (se DNA-ekstraktion). Det sammenpressede blod i BD P100 rørene var cryopforbeholdt en periode på 3 til 4 måneder inden DNA-ekstraktion. DNA ekstraheret fra EDTA-rør (EDTA_DNA) blev anvendt som en kontrol i vurderingen af udbyttet og kvaliteten af deres tilsvarende P100_DNA. Fra tidligere undersøgelser 12,13,15, var udbyttet af EDTA_DNA prøver signifikant højere end af DNA fra blod af tidligere plasma rør. I denne undersøgelse, for det samme beløb fuldblod opsamlet fra hver patient buffy coat af den komprimerede blod gav mindre DNA (Tabel 2, p = 0,00221). Under DNA-ekstraktion fra blodet i de nye P100 plasma rør, nogle hvide blodlegemer fra buffy kyst tabt til røde blodlegemer lag (under det), men repræsenterer ubetydelig mængde DNA sammenlignet med dem fra buffy coat (se bilag tabel). Variationen i udbytte set med EDTA_DNAs også efterlignes med P100_DNA tyder på, at det er prøve-afhængig. Prøver med højere volumen normalt ville give mere DNA og prøvermed lavere volumen og / eller lidt forringet DNA ville give mindre DNA.
Analyser på agarosegel (figur 2) viste, at EDTA_DNAs viser tegn på nedbrydning (smear) ikke ses i deres tilsvarende P100_DNAs. Især viser to EDTA_DNA prøver (EDTA_01053 og EDTA_06030) med det laveste udbytte mere smear end andre. I deres undersøgelse rapporteret Wong et al. 11 reduceres DNA udbytte med forøget opbevaringstid. Da alle blodprøver i vores database blev udsat for den samme opbevaringsbetingelser og prøven delmængde anvendt i denne undersøgelse blev tilfældigt udvalgt, opbevaring længde og tilstand er usandsynligt, at redegøre for de forskelle, set på agarosegelen mellem P100_DNAs og EDTA_DNAs. Den kendsgerning, at kun EDTA_DNAs viser nedbrydning kan være forbundet med den manglende proteasehæmmere i EDTA-rør.
Renheden af P100_DNAs og EDTA_DNAs var ikke signifikant forskellige ( De anvendte prøver blev rekrutteret til de genetiske undersøgelser af inflammatorisk tarmsygdom. Derfor, for at sammenligne resultaterne af de udtrukne DNA-prøver blev immunochip 5. valgt som genotypebestemmelse test platform. Den immunochip er blevet anvendt som en fin kortlægning genotypebestemmelse platform for Immunogenetics 16,17. Genomet af naturen af SNP genotypebestemmelse assays blev anvendt som en strengere foranstaltning af DNA ydeevne. De gennemsnitlige genotypebestemmelse takster for alle DNA-test og HapMap kontrolprøver, på tværs af alle chips, var 97,76% og 97,4% henholdsvis viser sammenlignelig fremragende præstation af DNA fra begge blodopsamlingsrør ( Konklusion DNA kan isoleres fra den komprimerede blod BD P100 rør, lette genomisk test fra den samme blodprøve trukket for plasma proteomics undersøgelser. Vores resultater udvider forskningen nytte af P100 rør. Det faktum, at DNA i det cellulære indhold af blod opsamlet i P100 er anvendelig for genomiske analyser kan hjælpe med at forenkle prøveindsamling til undersøgelser, hvor både proteom og genomiske analyser vil blive udført. Derfor er mindre blod behov for fra hvert menneske emne og en tilknyttet omkostninger og indsats besparelser for undersøgelsens sponsorer og personale er forbedret. Der er flere demonstreret fordele:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Paper clip | Office product | ||
| 15 ml tube | Corning | 430052 | |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| Bead array reader | Illumina | NA | |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
- Cortes, A., Brown, M. A. Promise and pitfalls of the Immunochip. Arthritis Research & Therapy. 13, 101 (2011).
- Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
- Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
- Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O'Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
- Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
- Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
- Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
- Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
- Polychronakos, C. Fine points in mapping autoimmunity. Nature. 43, 1173-1174 (2011).
- Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).
