Summary
Nous décrivons une nouvelle méthode d'isolement de l'ADN génomique à partir de sang total prélevé pour plasma / sérologie. Après la collecte de plasma, le sang compacté est habituellement jeté. Notre nouvelle méthode représente une amélioration significative par rapport aux méthodes existantes et rend l'ADN et plasma disponibles à partir d'une collection unique, sans demander de sang supplémentaire.
Abstract
Les tests de laboratoire peuvent être effectués sur les parties cellulaires ou de liquide du sang. L'utilisation de différents tubes de prélèvement de sang détermine la portion du sang pouvant être analysé (sang total, le plasma ou le sérum). Les laboratoires impliqués dans l'étude de la base génétique des maladies humaines s'appuient sur sang total anticoagulant recueillies dans Vacutainer contenant de l'EDTA comme source d'ADN pour analyse génétique / génomique. Parce que la plupart des laboratoires cliniques effectuent des tests biochimiques, sérologiques et virales comme une première étape dans l'enquête de résultat phénotypique, le sang coagulé sont aussi recueillis dans un tube contenant de l'héparine (tube à plasma). Par conséquent, lorsque l'ADN et de plasma sont nécessaires pour des analyses simultanées et parallèles de données à la fois génomiques et protéomiques, il est de coutume pour recueillir le sang dans les deux tubes EDTA et l'héparine. Si le sang peut être recueilli dans un seul tube et servir de source pour le plasma et l'ADN, cette méthode serait considérée comme un avancement à l'existant methSAO. L'utilisation du sang compactée après l'extraction du plasma représente une autre source d'ADN génomique, ce qui réduit la quantité d'échantillons sanguins traitées et de réduire le nombre d'échantillons requis pour chaque patient. Ce serait finalement gagner du temps et des ressources.
Le système de collecte de sang P100 BD pour la préservation de protéines plasmatiques a été créé comme un procédé amélioré au plasma précédente ou la collecte du sérum tubes 1, pour stabiliser la teneur en protéines du sang, ce qui permet une meilleure découverte des biomarqueurs protéiniques et protéomique expérimentation à partir de sang humain. Le P100 tubes BD contiennent 15,8 ml de K2EDTA atomisé et un cocktail à large spectre propriétaire lyophilisée d'inhibiteurs de protéase pour éviter la coagulation et de stabiliser les protéines plasmatiques. Elles comprennent également un séparateur mécanique, ce qui constitue une barrière physique entre le plasma et les culots cellulaires après centrifugation. Peu de méthodes ont été mises au point pour extraire l'ADN à partir de sang coagulé SAmples recueillis dans des tubes de plasma vieux 2-4. Défis de ces méthodes ont été principalement associés avec le type de séparateur à l'intérieur des tubes (séparateur gel) et comprenaient des difficultés à récupérer le sang coagulé, les inconvénients de la fragmentation ou la dispersion du caillot et l'obstruction de l'extraction caillot par le gel de séparation.
Nous présentons la première méthode qui extrait et purifie l'ADN génomique à partir de sang prélevé dans les nouveaux tubes P100 BD. Nous comparons la qualité de l'échantillon d'ADN de P100 tubes à celle des tubes EDTA. Notre approche est simple et efficace. Elle comporte quatre grandes étapes, comme suit: 1) l'utilisation d'un plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tubes avec séparateur mécanique pour la collecte de sang, 2) la suppression du séparateur mécanique à l'aide d'une combinaison de saccharose et un stérile trombone métallique crochet, 3) la séparation de la couche leuco-plaquettaire contenant les globules blancs et 4) l'isolement de l'ADN génomique à partir de l'couche leuco-plaquettaire en utilisant un kit d'extraction d'ADN commercial régulier ou d'un protocole standard similaire.
Protocol
1. Prélèvement
- Prélever des échantillons de sang de personnes atteintes de consentement éclairé adéquat. Pour chaque individu, tirage 4 à 5 ml de sang dans un tube P100 (BD Diagnostics, le lac Franklin, NY, USA). Aux fins de comparaison, recueillir simultanément sang dans un tube EDTA.
- Le P100 tubes BD contiennent 15,8 ml K2EDTA atomisé et un cocktail à large spectre propriétaire lyophilisée d'inhibiteurs de protéase pour éviter la coagulation et de stabiliser les protéines plasmatiques. Ils contiennent également un séparateur mécanique. Après avoir recueilli le sang total, maintenir les deux tubes à la température ambiante pendant 60 minutes à une nuit jusqu'à ce que la transformation se produit.
- Centrifuger les tubes BD P100 à 2500 g pendant quinze minutes à la température ambiante. Transférer le plasma collecté au-dessus du séparateur mécanique dans des tubes de micro-centrifugation.
- Stocker les tubes P100, contenant le sang compacté sous le séparateur, à -80 ° C jusqu'à ce que vous êtes prêt à commencer l'ADN posteraction.
2.1 Du sang du tube P100 (P100_DNA)
- Le P100 tubes sont stockés à -80 ° C après extraction du plasma. Dans les 3 à 4 mois, récupérer le tube P100 contenant le sang compacté du congélateur et décongeler à 37 ° C dans un bain-marie pendant 5 min (figure 1A). Retirez tout plasma résiduel qui se trouve au-dessus du séparateur. Ajouter 2 ml de solution de saccharose à 17% (solution de gradient testé dans la maison - données non publiées) dans les tubes P100-dessus du séparateur (figure 1B). Centrifuger les tubes à la température ambiante pendant 20 min à 2500 g, ce procédé pousse le séparateur mécanique à la partie supérieure du tube, et on obtient trois couches d'une solution comprenant la couche leuco-plaquettaire (figure 1C). Extraire manuellement le séparateur à l'aide d'un trombone métallique accroché steriled (figure 1D).
- Après avoir récupéré le séparateur mécanique de chaque tube (figure 1D), enlever et discard de la couche de saccharose haut. Transférer la couche intermédiaire, ce qui représente la couche couche leuco-plaquettaire (BC), dans un tube conique stérile 15 ml. Ajouter tampon phosphate salin (PBS) pour augmenter le volume de la couche leucocytaire à 3 ml. Extraire l'ADN à partir de la couche leuco-plaquettaire en utilisant des réactifs de la trousse de sang Puregene Qiagen selon la recommandation du fabricant, à l'exception d'une vitesse de centrifugation de 2500 g (au lieu de 2.000 g).
- Pour lyse et enlever les globules rouges (RBC), ajouter 9 ml de lyse RBC à 3 ml de couche leuco-plaquettaire. Inversez chaque tube plusieurs fois et incuber à température ambiante pendant 10 min avec inversion occasionnelle pendant l'incubation. Spin chaque mélange vers le bas à 2500 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Traiter le culot restant dans chaque tube avec 3 ml d'une solution de lyse des cellules et le vortex pendant 15 s. Traiter le lysat avec 1 ml de solution de précipitation des protéines et vortex pendant 15 sec.
- Centrifugeuse à 2500 g pendant 5 min et transférer le surnageant dans un tube conique de 15 ml contenant fraîche3 ml d'isopropanol à 100%. Inverser les nouveaux tubes 10 fois et centrifuger à 2500 g pendant 3 min. Jeter le surnageant et ajouter 1 ml d'éthanol à 70%. Inverser les tubes coniques à quelques reprises pour déloger et laver le culot d'ADN. Centrifuger à 2500 g pendant 1 min. Laisser le pellet à sécher pendant 3 min (placer le tube à l'envers) à température ambiante, puis suspendre l'ADN avec 250 ml de solution de réhydratation à 37 ° C pendant 10 min et le transfert à un pré-étiquetés 1,7 ml microtubes. Conserver les tubes à -80 ° C jusqu'à utilisation.
2.2 De Sang EDTA Ttube (EDTA_DNA)
- Le sang total pour les essais d'immuno-routine est recueilli dans des tubes en plastique vaccutainer revêtu par pulvérisation avec 10,8 mg de K 2 EDTA et stockée à -80 ° C. Parce que les tubes ne contiennent pas un séparateur mécanique, l'extraction d'ADN ne comprend pas les étapes impliquant le séparateur mécanique (2.1.1 et 2.1.2).
- Dans les 3 à 4 mois de stockage du sang, le DNA est extrait en utilisant le martin-pêcheur Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Il s'agit d'un système d'extraction de l'ADN d'automatisation sur la base de la technologie à poudre magnétique et se compose de lyse / liaison de l'ADN, plusieurs étapes de lavage des cellules et l'élution de l'ADN.
- Le kit utilisé dans l'extraction de l'ADN est le Flex 24 kit de sang de l'ADN Kingfisher (Qiagen, Allemagne).
3. Quantité d'ADN et évaluation de la qualité
La quantité, la qualité et l'intégrité de l'ADN génomique ont été évalués par une combinaison de méthode qui inclut PicoGreen, la spectroscopie et l'électrophorèse.
- La concentration de l'ADN génomique est déterminée par quantification Nanodrop et PicoGreen.
- La pureté est déterminée à partir de la mesure du rapport 260/280 sur le spectrophotomètre Nanodrop.
- L'échantillon (500 ng) est également chargé sur gel d'agarose 1% pour évaluer l'intégrité (dégradation) de l'ADN.
4. Genotyping analyses et contrôle de qualité
- Cinq échantillons de leurs EDTA_DNA correspondants P100_DNA et sont choisis au hasard pour une analyse plus approfondie en utilisant le Immunochip personnalisé (Immuno analyse ADN BeadChip). Immunochip est une puce de génotypage Infinium contenant 196 524 polymorphismes et est conçu pour les études immunogénétiques 5.
- Pour chaque échantillon, 200 ng d'ADN est amplifié, fragmenté, précipité et remise en suspension dans du tampon d'hybridation appropriée.
- Les échantillons dénaturés sont hybridés sur Immunochips à 48 ° C pendant un minimum de 16 heures.
- Après l'hybridation, les Immunochips sont traitées pour des réactions d'extension d'une seule base et colorées.
- Les immunochips sont ensuite imagées par Illumina HISCAN lecteur d'arrangement de billes et les données d'intensité de talon normalisées sont chargées dans le logiciel Illumina GenomeStudio et convertis en génotypes. Les génotypes sont appelées à l'aide de l'algorithme autocalling de GenomeStudio. Le contrôle de la qualité dansimplique d exclusion des polymorphismes de nucléotide simple (SNP), avec un taux d'appels <95%.
- Le taux d'appel SNP est utilisée comme une mesure de l'efficacité de dosage immunochip. Il est calculé comme le pourcentage du nombre total de dosages sur la puce (196 524 SNP codée sur chaque puce) qui permettent d'atteindre une intensité de signal suffisante et de qualité pour recevoir une assignation de génotype automatisé. On s'attend ADN de haute qualité (260/280 rapport de 1,8 ou plus et en l'absence de dégradation) pour atteindre au moins le même taux d'appel que l'ADN de contrôle HapMap inclus dans l'essai immunochip. Le contrôle de qualité comprend l'exclusion de SNP avec un taux d'appels <95%, dans chaque ensemble de données.
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Representative Results
évaluation de la qualité de l'ADN et la mesure de la concentration
Les rendements des P100_DNAs étaient significativement inférieurs à ceux des EDTA_DNAs (tableaux 1 et 2). La pureté d'ADN représentée par sa valeur du rapport 260/280 est similaire pour les deux P100_DNA et ensemble d'échantillons EDTA_DNA (tableaux 1 et 2). La qualité de l'ADN est assez uniforme dans chaque ensemble de l'échantillon, bien que certains dégradation est observée dans les échantillons EDTA_DNA, comme indiqué par frottis lumière (Figure 2). Les EDTA_DNAs qui montrent plus de signes de dégradation ont également montré concentration d'ADN réduite.
Génotypage
Le taux d'appel de génotypage pour les deux EDTA_DNAs et P100_DNAs ont été comparés. Ils ont donné des tarifs des appels similaires et étaient à la fois comparable à l'ADN contrôle interne HapMap (tableau 3).
Figure 1. Isolement de couche leuco-plaquettaire.
Tableau 1. rendement de l'ADN de l'échantillon (PicoGreen) et le rapport (NanoDrop).
| Rendement de l'ADN | Pureté de l'ADN | |||
| Échantillons | P100 | EDTA | P100 | EDTA |
| 1 | 135 | 340 | 1,79 | 1.9 |
| 2 | 119 | 344 | 1.85 | 1.89 |
| 3 | 57 | 129 | 1,88 | 1,88 |
| 4 | 159 | 640 | 1,86 | 1,88 |
| 5 | 140 | 430 | 1,86 | 1,88 |
| 6 | 150 | 673 | 1,86 | 1.9 |
| 7 | 139 | 425 | 1,74 | 1,88 |
| 8 | 118 | 240 | 1,87 | 1,86 |
| 9 | 51 | 86 | 1,87 | 1.83 |
| valeur p | p = 0,00221 | p = 0,09836 | ||
Tableau 2. Comparaison du rendement et de la pureté (bilatéral, l'échantillon test t apparié).
| Génotypage Cell Rate | ||
| Échantillons | P100 | EDTA |
| 1 | 97,9 | 97,5 |
| 2 | 97,9 | 97,8 |
| 4 | 97,4 | 97,5 |
| 7 | 97,5 | 98,2 |
| 8 | 97,9 | 98 |
| Valeur P | p = 0,67970 | |
Tableau 3. Taux d'appel Génotypage (bilatéral, l'échantillon test t apparié).
| Échantillons | Couches | Rendement (g) | Ratio (260/280) |
| Buffy coat | 150 | 1,86 | |
| RBC | 4.13 | 1,73 | |
| P100_07 | Buffy coat | 139 | 1,74 |
| RBC | 1.00 | 1,70 | |
| P100_08 | Buffy coat | 118 | 1,87 |
| RBC | 3,72 | 1,78 | |
| P100_09 | Buffy coat | 51 | 1,87 |
| RBC | 0,23 | 0.98 |
Annexe. L'évaluation de la quantité d'ADN trouvés dans la couche de globules rouges (GR).
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Discussion
De nombreuses maladies humaines ont des causes génétiques et explorer la base génétique des maladies humaines exige une augmentation de l'ADN de haute qualité. La source la plus commune de l'ADN utilisée dans les études génétiques anticoagulant du sang total. Parce que la plupart des laboratoires cliniques effectuent des tests biochimiques, sérologiques et virales comme une première étape dans l'enquête de résultat phénotypique, le sang est souvent recueillie dans un tube à plasma. Après le prélèvement du plasma, du sang compacté est souvent jeté. Par conséquent, lorsque l'ADN est nécessaire de mener des études ou des tests génétiques, une prise de sang supplémentaire n'est nécessaire chez le même patient. Le sang compacté rebut représente une source potentielle d'ADN, car il contient les globules blancs. Par conséquent, en utilisant le sang compacté à partir de tubes plasma offre la possibilité d'utiliser l'échantillon de sang recueilli plus efficacement, sans la nécessité d'élaborer surplus sang ou de rappeler au patient de sang supplémentaire.
Diverses méthodes pour exADN des voies à partir des cellules blanches de sang coagulé ou compacté ont été rapportés 6-10. La plupart des défis de ces méthodes ont été associés à la conception du tube de collecte de plasma. Des tubes de collecte de plasma antérieures contenaient un séparateur constitué d'un gel (gel séparateur) qui, lorsqu'il est centrifugé, formé d'une barrière pour séparer des cellules sanguines (piégé en dessous du séparateur) à partir du plasma (située au dessus du séparateur). Pour éviter la contamination des cellules sanguines avec la matière en gel, le séparateur doit d'abord être soigneusement retiré du tube 11. Il est suivi par une fragmentation du caillot de sang afin de garantir l'extraction d'ADN efficace. Le processus de fragmentation se traduit souvent par une perte importante de l'échantillon de sang et une diminution du rendement de l'ADN. Pour réduire au minimum la perte de l'échantillon et d'améliorer le procédé, un maillage à petits pores a été utilisé pour disperser mécaniquement le caillot de sang en petits morceaux 12, mais la fragmentation de l'ADN rendement encore affecté et la qualité et even constituait un danger pour la santé du technicien 13.
Les BD P100 tubes de BD Bioscience sont la dernière génération de tubes de collecte de plasma évalués dans multicentrique immunologique étude 14. Comme les tubes de plasma précédentes, ils contiennent des anticoagulants pour empêcher des inhibiteurs de la coagulation et de la protéase pour stabiliser les protéines plasmatiques. L'innovation majeure du tube P100 BD réside dans le séparateur mécanique (pas un séparateur de gel) à l'intérieur de chaque tube. Le séparateur mécanique fournit également une barrière physique entre le plasma et le culot cellulaire après centrifugation, mais contrairement au gel séparateur, n'offre pas de risque de contamination de l'échantillon par un gel. Le protocole appliqué dans cette étude n'inclut pas de fragmentation, il n'y a donc pas de risque de danger pour la santé.
L'ADN a été extrait à partir de la couche leuco-plaquettaire, en utilisant un protocole de kit commercial (voir l'extraction d'ADN). Le sang compacté dans les tubes P100 BD étaient cryopréservée pour une durée de 3 à 4 mois avant l'extraction de l'ADN. ADN extrait à partir des tubes EDTA (EDTA_DNA) ont été utilisées comme témoin dans l'évaluation du rendement et la qualité de leur P100_DNA correspondant. De précédentes études 12,13,15, les rendements des échantillons EDTA_DNA étaient significativement plus élevée que celle de l'ADN à partir de sang de tubes de plasma précédents. Dans cette étude, pour le même sang total montant collecté par chaque patient, la couche leuco-plaquettaire du sang compacté a donné moins d'ADN (tableau 2, p = 0,00221). Lors de l'extraction d'ADN à partir du sang dans les nouveaux tubes plasma P100, certains globules blancs de la côte buffy sont perdus à la couche de globules rouges (ci-dessous), mais représente quantité non négligeable de l'ADN par rapport à ceux de la couche leuco-plaquettaire (voir annexe tableau). La variation du rendement vu avec EDTA_DNAs est également imité avec la P100_DNA suggérant qu'il est dépendant échantillon. Les échantillons avec un volume supérieur devraient normalement donner plus d'ADN et des échantillonsavec un volume plus faible et / ou de l'ADN légèrement dégradée donnerait moins d'ADN.
Les analyses sur gel d'agarose (figure 2) ont révélé que EDTA_DNAs montrent des signes de dégradation (frottis) ne voit pas dans leurs P100_DNAs correspondants. En particulier, deux échantillons EDTA_DNA (EDTA_01053 et EDTA_06030) avec le rendement le plus faible montrent plus frottis que les autres. Dans leur étude, Wong et al. 11 ont signalé une baisse de rendement de l'ADN avec l'augmentation du temps de stockage. Étant donné que tous les échantillons de sang dans notre garde ont été soumis à la même condition de stockage et le sous-ensemble de l'échantillon utilisé dans cette étude ont été choisis au hasard, la durée de stockage et l'état sont peu susceptibles d'expliquer les différences observées sur le gel d'agarose entre P100_DNAs et EDTA_DNAs. Le fait que seulement EDTA_DNAs spectacle dégradation pourrait être associée à l'absence d'inhibiteurs de protéase dans les tubes EDTA.
La pureté des P100_DNAs et EDTA_DNAs n'étaient pas significativement différentes ( Les échantillons utilisés ont été recrutés pour les études génétiques de la maladie inflammatoire de l'intestin. Par conséquent, pour comparer les performances des échantillons d'ADN extraits, le immunochip 5 a été choisi comme plate-forme de tests de génotypage. Le immunochip a été utilisé comme une plate-forme de génotypage de la cartographie fine de l'immunogénétique 16,17. Le génome nature des tests de génotypage SNP a été utilisé comme une mesure rigoureuse de la performance de l'ADN. Le taux d'appel de génotypage moyenne de tous les échantillons de contrôle de HapMap test d'ADN et, à travers toutes les puces, ont été 97,76% et 97,4% respectivement, montrant une excellente performance comparable de l'ADN de deux tubes de collecte de sang ( Conclusion L'ADN peut être isolé du sang compactée de BD P100 tubes, facilitant les tests génomiques à partir du même échantillon de sang prélevé pour le plasma études de protéomique. Nos résultats étendent l'utilité de la recherche du tube P100. Le fait que l'ADN dans le contenu cellulaire de sang recueilli dans P100 est utilisable pour les analyses génomiques peut aider à simplifier l'acquisition des échantillons pour les études dans lesquelles les analyses protéomiques et génomiques fois sera effectuée. Par conséquent, moins de sang est nécessaire pour chaque sujet humain et un coût associé et des économies d'effort pour les commanditaires de l'étude et le personnel est améliorée. Il ya plusieurs avantages démontrés:
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Paper clip | Office product | ||
| 15 ml tube | Corning | 430052 | |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| Bead array reader | Illumina | NA | |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
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