Summary
Stiamo descrivendo un nuovo procedimento per isolare DNA genomico da sangue intero prelevato per plasma / sierologia. Dopo la raccolta del plasma, il sangue compattato viene solitamente scartata. Il nostro nuovo metodo rappresenta un miglioramento significativo rispetto ai metodi esistenti e rende il DNA e plasma disponibili da una singola collezione, senza richiedere ulteriore sangue.
Abstract
Test di laboratorio possono essere praticati sulle porzioni cellulari o fluido del sangue. L'uso di diverse provette determina la porzione del sangue che può essere analizzato (sangue intero, plasma o siero). Laboratori coinvolti nello studio delle basi genetiche delle malattie umane si basano su anticoagulante del sangue intero prelevato in EDTA contenente vacutainer come fonte di DNA per l'analisi genetica / genomica. Perché laboratori clinici di eseguire più test biochimici, sierologici e virali come un primo passo in un'indagine risultato fenotipico, il sangue coagulato è anche raccolto in provetta contenente eparina (tubo plasma). Pertanto quando sono necessarie DNA e plasma per analisi simultanea e parallela di dati sia genomici e proteomici, è consuetudine per raccogliere il sangue in EDTA e sia con eparina. Se sangue potrebbe essere raccolto in un unico tubo e servire come fonte sia per plasma e DNA, tale metodo sarebbe considerato un avanzamento a met esistentiods. L'utilizzo del sangue compattato dopo estrazione plasma rappresenta una fonte alternativa per il DNA genomico, minimizzando così la quantità di campioni di sangue trasformati e riducendo il numero di campioni richiesti da ogni paziente. Ciò finirebbe per risparmiare tempo e risorse.
Il P100 sistema di raccolta del sangue BD per la conservazione delle proteine del plasma sono stati creati come un metodo migliorato nel corso del plasma precedente o raccolta siero tubi 1, per stabilizzare il contenuto proteico del sangue, consentendo una migliore proteina scoperta di biomarcatori e proteomica sperimentazione dal sangue umano. I tubi P100 BD contengono 15,8 ml di K2EDTA essiccato a spruzzo e un liofilizzato proprietaria ampio spettro cocktail di inibitori di proteasi per prevenire la coagulazione e stabilizzare le proteine plasmatiche. Essi includono anche un separatore meccanico, che fornisce una barriera fisica tra plasma e pellet cellulari dopo centrifugazione. Pochi metodi sono stati studiati per estrarre il DNA da sangue coagulato SAmples raccolti nei vecchi tubi di plasma 2-4. Sfide da questi metodi sono stati principalmente associati con il tipo di separatore all'interno dei tubi (separatore di gel) ed inclusi difficoltà di recupero del sangue coagulato, l'inconveniente di frammentare o disperdendo il coagulo e ostruzione del coagulo estrazione dal gel di separazione.
Vi presentiamo il primo metodo che estrae e purifica il DNA genomico da sangue prelevato nei nuovi P100 tubi BD. Si confronta la qualità del campione di DNA da P100 tubi, a quella in provette EDTA. Il nostro approccio è semplice ed efficiente. Si tratta di quattro fasi principali, come segue: 1) l'uso di un BD P100 plasma (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tubo con separatore meccanico per la raccolta del sangue, 2) la rimozione del separatore meccanico utilizzando una combinazione di saccarosio e di un sterile graffetta gancio metallico, 3) la separazione dello strato di buffy coat contenente le cellule bianche e 4) l'isolamento del DNA genomico dalbuffy coat utilizzando un kit di estrazione del DNA normale commerciale o un protocollo standard simile.
Protocol
1. Raccolta dei campioni
- Raccogliere campioni di sangue di soggetti con adeguata consenso informato. Per ogni individuo, trarre 4-5 ml di sangue in una provetta P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). A scopo di confronto, raccogliere contemporaneamente il sangue in una provetta con EDTA.
- I tubi P100 BD contengono 15,8 ml K2EDTA essiccato a spruzzo e un liofilizzato proprietaria ampio spettro cocktail di inibitori di proteasi per prevenire la coagulazione e stabilizzare le proteine plasmatiche. Essi contengono anche un separatore meccanico. Dopo aver raccolto il sangue intero, mantenere entrambi i tubi a temperatura ambiente per 60 min a tutta la notte fino al verificarsi di elaborazione.
- Centrifugare le provette BD P100 a 2.500 g per quindici minuti a temperatura ambiente. Trasferire il plasma raccolto sopra il separatore meccanico in provette da centrifuga micro.
- P100 Conservare le provette, contenente il sangue compattato sotto il separatore, a -80 ° C fino a quando si è pronti per iniziare il DNA extraction.
2.1 Dal sangue di P100 tubo (P100_DNA)
- Le P100 tubi sono conservati a -80 ° C dopo l'estrazione del plasma. Entro 3 a 4 mesi, recuperare la provetta contenente il sangue P100 compattato dal congelatore e scongelare a 37 ° in un bagno d'acqua per 5 minuti (Figura 1A). Rimuovere eventuali residui di plasma che si trova sopra il separatore. Aggiungere 2 ml di soluzione di saccarosio al 17% (soluzione gradiente testato in casa - dati non pubblicati) nelle P100 tubi sopra il separatore (Figura 1B). Centrifugare le provette a temperatura ambiente per 20 min a 2500 g; questo processo spinge il separatore meccanico per la parte superiore del tubo e produce tre strati di soluzione compreso il buffy coat (Figura 1C). Estrarre manualmente il separatore utilizzando una graffetta metallica uncinata steriled (Figura 1D).
- Dopo aver recuperato il separatore meccanico da ogni tubo (Figura 1D), rimuovere e discard dello strato di saccarosio superiore. Trasferire lo strato centrale, che rappresenta il livello di buffy coat (BC), in una sterile 15 ml tubo conico. Aggiungere Tampone fosfato salino (PBS) per aumentare il volume buffy coat a 3 ml. Estrarre il DNA dal buffy coat utilizzando reagenti dalla Qiagen Puregene Kit Sangue come da indicazioni del produttore, eccetto una velocità di centrifugazione di 2500 g (invece di 2.000 g).
- Per lisare e rimuovere i globuli rossi (RBC), aggiungere 9 ml di RBC lisi a 3 ml di buffy coat. Capovolgere ogni provetta diverse volte e incubare a temperatura ambiente per 10 min, con occasionale invertente durante l'incubazione. Spin ogni miscela fino a 2.500 g per 5 minuti e scartare il surnatante. Trattare il restante pellet in ogni provetta con 3 ml di soluzione di lisi cellulare e vortex per 15 sec. Trattare il lisato con 1 ml di soluzione di precipitazione proteica e vortex per 15 sec.
- Centrifugare a 2500 g per 5 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da 15 ml contenente3 ml di isopropanolo al 100%. Invertire i nuovi tubi di 10 volte e centrifugare a 2500 g per 3 min. Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml di etanolo al 70%. Invertire i tubi conici un paio di volte per rimuovere e lavare il pellet di DNA. Centrifugare a 2500 g per 1 min. Lasciar seccare il precipitato per 3 min (posizionare il tubo capovolto) a temperatura ambiente e quindi sospendere il DNA con 250 ml di soluzione di reidratazione a 37 ° C per 10 min e il trasferimento ad un pre-etichettato 1,7 ml provetta. Conservare le provette a -80 ° C fino all'utilizzo.
2.2 da sangue di EDTA Ttube (EDTA_DNA)
- Il sangue intero per i test di routine immunoematologia viene raccolto in provette di plastica vaccutainer spruzzo-rivestito con 10,8 mg di K 2 EDTA e conservati a -80 ° C. Poiché i tubi non contengono un separatore meccanico, l'estrazione del DNA non include le fasi che coinvolgono il separatore meccanico (2.1.1 e 2.1.2).
- Entro 3-4 mesi di conservazione del sangue, il DNA viene estratto utilizzando il martin pescatore Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Si tratta di un sistema di estrazione del DNA di automazione basati su tecnologia di particelle magnetiche ed è costituito da cellule di lisi / DNA vincolanti, diverse fasi di lavaggio e di eluizione del DNA.
- Il kit utilizzato per l'estrazione del DNA è il martin pescatore Flex 24 DNA del sangue kit (Qiagen, Germania).
3. DNA Quantità e valutazione della qualità
La quantità, la qualità e l'integrità del DNA genomico sono stati valutati da una combinazione di metodo che comprende PicoGreen, spettroscopia e elettroforesi.
- La concentrazione del DNA genomico è determinata dalla quantificazione Nanodrop e PicoGreen.
- La purezza è determinata dalla misurazione 260/280 rapporto sullo spettrofotometro Nanodrop.
- Il campione (500 ng) è anche caricato su gel di agarosio 1% per valutare l'integrità (degradazione) del DNA.
4. Genotyping saggi e controllo di qualità
- Cinque P100_DNA e loro corrispondenti campioni EDTA_DNA sono scelti a caso per ulteriori analisi utilizzando la Immunochip personalizzato (Immuno DNA Analysis BeadChip). Immunochip è un chip di genotipizzazione Infinium contenente 196.524 polimorfismi ed è progettato per gli studi immunogenetici 5.
- Per ciascun campione, 200 ng di DNA è amplificato, frammentata, precipitato e risospeso in tampone di ibridazione appropriate.
- I campioni denaturati sono ibridate su Immunochips a 48 ° C per un minimo di 16 ore.
- Dopo l'ibridazione, i Immunochips sono trattati per le reazioni di estensione singolo-base e macchiati.
- Le immunochips vengono poi ripreso con lettore di serie Illumina HISCAN Bead ei dati di intensità di perline normalizzati vengono caricati nel software Illumina GenomeStudio e convertiti in genotipi. I genotipi sono chiamate utilizzando l'algoritmo autocalling di GenomeStudio. Il controllo di qualità individeranno in esclusione di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs), con un tasso di chiamata <95%.
- Il tasso di chiamata SNP è utilizzato come misura dell'efficienza dosaggio immunochip. Esso è calcolato come percentuale del numero totale di saggi sul chip (196.524 SNP codificati su ogni chip) che realizzano sufficiente intensità e qualità del segnale per ricevere un'assegnazione genotipo automatizzato. DNA di alta qualità (260/280 rapporto di 1,8 o superiore e assenza di degradazione) è previsto per conseguire almeno lo stesso tasso di chiamata come il DNA di controllo HapMap inclusa nel saggio immunochip. Il controllo di qualità comporta l'esclusione di SNPs con un tasso di chiamata <95% in ogni set di dati.
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Representative Results
Valutazione della qualità del DNA e la misura della concentrazione
Le rese di P100_DNAs erano significativamente inferiori a quelli di EDTA_DNAs (Tabelle 1 e 2). La purezza del DNA rappresentata dal valore 260/280 rapporto è simile per entrambi P100_DNA e set di esempio EDTA_DNA (Tabelle 1 e 2). La qualità del DNA è abbastanza uniforme all'interno di ogni serie di campioni sebbene alcuni degradazione è visto nei campioni EDTA_DNA, come indicato dalla striscio luce (Figura 2). Le EDTA_DNAs che hanno mostrato più segni di degrado anche mostrato concentrazione di DNA ridotta.
Genotipizzazione
Il tasso di chiamata genotipizzazione per entrambi EDTA_DNAs e P100_DNAs sono stati confrontati. Essi hanno prodotto tassi di chiamata simili ed erano entrambi paragonabile al DNA di controllo interno HapMap (Tabella 3).
Figura 1. Buffy isolamento cappotto.
Tabella 1. Resa del DNA campione (PicoGreen) e rapporto (NanoDrop).
| DNA Yield | La purezza del DNA | |||
| Campioni | P100 | EDTA | P100 | EDTA |
| 1 | 135 | 340 | 1.79 | 1.9 |
| 2 | 119 | 344 | 1.85 | 1.89 |
| 3 | 57 | 129 | 1.88 | 1.88 |
| 4 | 159 | 640 | 1.86 | 1.88 |
| 5 | 140 | 430 | 1.86 | 1.88 |
| 6 | 150 | 673 | 1.86 | 1.9 |
| 7 | 139 | 425 | 1.74 | 1.88 |
| 8 | 118 | 240 | 1.87 | 1.86 |
| 9 | 51 | 86 | 1.87 | 1.83 |
| valore p | p = 0.00221 | p = 0,09836 | ||
Tabella 2. Confronto di resa e la purezza (a due code, Campione paired t-test).
| Genotipizzazione Cell Rate | ||
| Campioni | P100 | EDTA |
| 1 | 97.9 | 97.5 |
| 2 | 97.9 | 97.8 |
| 4 | 97.4 | 97.5 |
| 7 | 97.5 | 98.2 |
| 8 | 97.9 | 98 |
| Valore di P | p = 0,67970 | |
Tabella 3. Genotipizzazione call rate (a due code, Campione paired t-test).
| Campioni | Livelli | Resa (mg) | Rapporto (260/280) |
| Buffy-coat | 150 | 1.86 | |
| RBC | 4.13 | 1.73 | |
| P100_07 | Buffy-coat | 139 | 1.74 |
| RBC | 1.00 | 1.70 | |
| P100_08 | Buffy-coat | 118 | 1.87 |
| RBC | 3.72 | 1.78 | |
| P100_09 | Buffy-coat | 51 | 1.87 |
| RBC | 0.23 | 0.98 |
Appendice. Valutazione della quantità di DNA trovato nella cella strato rosso sangue (RBC).
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Discussion
Molte malattie umane hanno cause genetiche ed esplorare la base genetica delle malattie umane richiede una crescente DNA di alta qualità. La fonte più comune di DNA utilizzato in studi genetici è coagulato sangue intero. Poiché laboratori più eseguire test biochimici clinici, sierologici, e virali come primo passo in esito indagine fenotipica, il sangue viene spesso raccolta in un tubo plasma. Dopo la raccolta del plasma, il sangue compattato viene spesso scartato. Pertanto, quando il DNA è necessario per condurre studi genetici o test, un prelievo di sangue aggiuntivo è richiesto dallo stesso paziente. Il sangue compattato scartato rappresenta una potenziale fonte di DNA in quanto contiene globuli bianchi. Pertanto, utilizzando il sangue compattato da tubi plasma offre l'opportunità di utilizzare il campione di sangue raccolto più efficiente, senza la necessità di elaborare avanzo sangue o richiamare il paziente per ulteriore sangue.
Vari metodi di extratto DNA dalle cellule bianche del sangue coagulato compattato o sono stati riportati 6-10. Maggior parte delle sfide di questi metodi sono stati associati con il design della provetta di raccolta del plasma. Tubi di raccolta del plasma precedenti contenevano una separatrice in un gel (gel separatore) che, centrifugato, formata una barriera per separare le cellule del sangue (intrappolata sotto il separatore) dal plasma (situato sopra il separatore). Per evitare la contaminazione dei globuli con il materiale gel, il separatore deve prima essere accuratamente rimosso dalla provetta 11. Questo è seguito da una frammentazione del coagulo di sangue di garantire l'estrazione del DNA efficiente. Il procedimento di frammentazione si traduce spesso in una perdita significativa di campione di sangue e una diminuzione della resa DNA. Per minimizzare la perdita di campione e migliorare il processo, una maglia piccola-poro è stato utilizzato per disperso meccanicamente il coagulo in piccoli pezzi 12, ma la frammentazione del DNA resa ancora condizionato e di qualità e di even costituiva un pericolo per la salute per il tecnico 13.
Il BD P100 tubi da BD Bioscience sono l'ultima generazione di tubi di raccolta del plasma valutati in multicentrico studio di ricerca immunologica 14. Come i precedenti tubi plasma, contengono anticoagulanti per prevenire inibitori della proteasi della coagulazione e per stabilizzare le proteine plasmatiche. La grande innovazione del tubo BD P100 risiede nel separatore meccanico (non un separatore gel) all'interno di ciascun tubo. Il separatore meccanico fornisce anche una barriera fisica tra il plasma e il pellet cellulare dopo centrifugazione, ma a differenza del gel separatore, offre alcun rischio di contaminazione del campione mediante un gel. Il protocollo applicata in questo studio non include una frammentazione, pertanto non vi è alcun rischio pericolo per la salute.
Il DNA è stato estratto dal buffy coat, utilizzando un protocollo kit commerciale (cfr. estrazione del DNA). Il sangue compattato nelle P100 tubi BD erano cryopriservato per un periodo di 3 a 4 mesi prima dell'estrazione del DNA. DNA estratto da tubi EDTA (EDTA_DNA) sono stati utilizzati come controllo nella valutazione della resa e la qualità del loro corrispondente P100_DNA. Da studi precedenti 12,13,15, le rese di campioni EDTA_DNA erano significativamente superiore a quella del DNA da sangue di tubi plasma precedenti. In questo studio, per la stessa quantità di sangue intero raccolto da ciascun paziente, il buffy coat del sangue compattato prodotto meno DNA (Tabella 2, p = 0.00221). Durante l'estrazione del DNA dal sangue nei nuovi tubi di plasma P100, alcuni globuli bianchi dalla costa buffy sono persi per lo strato di globuli rossi (al di sotto di esso), ma rappresenta quantità insignificante di DNA rispetto a quelli del buffy coat (vedi appendice tabella). La variazione della resa visto con EDTA_DNAs anche imitato con la P100_DNA suggerendo che è campione dipendente. I campioni con volume più alto di norma produrre più di DNA e campionicon volume più basso e / o DNA leggermente degradato sarebbe resa meno DNA.
Analisi su gel di agarosio (Figura 2) ha rivelato che EDTA_DNAs mostrano segni di degrado (striscio) non si vedono in loro corrispondenti P100_DNAs. In particolare, due campioni EDTA_DNA (EDTA_01053 e EDTA_06030) con il rendimento più basso mostrano più striscio di altri. Nel loro studio, Wong et al. Riportarono 11 resa del DNA diminuita con un tempo di stoccaggio. Poiché tutti i campioni di sangue nel nostro repository sono stati sottoposti alla stessa condizione di stoccaggio e il sottoinsieme campione utilizzato in questo studio è stato selezionato in modo casuale, lunghezza stoccaggio e la condizione è improbabile per spiegare le differenze vedute sul gel di agarosio tra P100_DNAs e EDTA_DNAs. Il fatto che solo EDTA_DNAs mostra degradazione potrebbe essere associata alla mancanza di inibitori della proteasi nei tubi EDTA.
La purezza dei P100_DNAs e EDTA_DNAs non erano significativamente differenti ( I campioni utilizzati sono stati reclutati per gli studi di genetica delle malattie infiammatorie intestinali. Pertanto, per confrontare le prestazioni dei campioni di DNA estratti, il immunochip 5 è stato selezionato come piattaforma di test genotipizzazione. Il immunochip è stato utilizzato come piattaforma di genotipizzazione mappatura bene per Immunogenetica 16,17. Il genoma natura dei saggi SNP genotipizzazione è stata utilizzata come misura rigorosa di prestazioni DNA. I tassi medi di chiamata di genotipizzazione per tutti i test del DNA e campioni di controllo HapMap, in tutte le patatine, erano 97,76% e 97,4% rispettivamente, mostrando paragonabile ottime prestazioni del DNA di entrambi i tubi di raccolta del sangue ( Conclusione DNA può essere isolato dal sangue compattata di BD P100 tubi, facilitando la sperimentazione genomica dallo stesso campione di sangue prelevato per proteomica studi plasma. I nostri risultati estendono l'utilità di ricerca del tubo P100. Il fatto che il DNA nel contenuto cellulare del sangue prelevato in P100 è utilizzabile per le analisi genomiche può aiutare a semplificare l'acquisizione dei campioni per gli studi in cui saranno effettuate le analisi di proteomica e genomica. Pertanto, meno sangue è necessaria per ogni soggetto umano e un costo associato e risparmio di sforzo per gli sponsor di studio e il personale è migliorata. Ci sono diversi vantaggi dimostrati:
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Paper clip | Office product | ||
| 15 ml tube | Corning | 430052 | |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| Bead array reader | Illumina | NA | |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
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