مقايسة لنفاذية الظهارة العصبية الجنينية واسماك الزرد

Summary

وصفنا يعيش القياس الكمي للحيوان كامل النفاذية للدماغ الزرد الجنينية. هذه التقنية يحلل القدرة على الاحتفاظ السائل المخي الشوكي والجزيئات ذات أوزان جزيئية مختلفة داخل تجويف الأنبوب العصبي والكمي حركة للخروج من البطينين. هذه الطريقة مفيدة لتحديد الاختلافات في نفاذية الظهارية والنضج خلال تطوير والمرض.

Abstract

يتم حفظها في النظام البطيني الدماغ بين الفقاريات وتتألف من سلسلة من تجاويف الدماغ مترابطة تسمى البطينين، والتي تشكل خلال المراحل المبكرة من نمو الدماغ ويتم الاحتفاظ طوال حياة الحيوان. تم العثور على نظام البطين الدماغ في الفقاريات، والبطينين تطوير بعد تشكيل الأنبوب العصبي، وعندما يملأ التجويف المركزي مع السائل النخاعي (CSF) ^1،2. CSF هو السائل الغنية بالبروتين التي لا غنى عنها لنمو الدماغ الطبيعي وظيفة ^3-6.

في الزرد والدماغ التضخم البطين يبدأ في حوالي 18 ساعة الإخصاب آخر (HPF)، بعد إغلاق الأنبوب العصبي. وترتبط عمليات متعددة مع تشكيل البطين الدماغ، بما في ذلك تشكيل الظهارة العصبية، مشددة تشكيل تقاطع الذي ينظم نفاذية والإنتاج CSF. أظهرت لنا أن نا، مطلوب K-أتباز للتضخم البطين الدماغ، مما يؤثر كل هذه العمليةوفاق ^7،8، في حين claudin 5A هو ضروري لتشكيل تقاطع ضيق ^9. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت لنا أن "الاسترخاء" من الظهارة العصبية الجنينية، عن طريق تثبيط الميوسين، ويرتبط مع التضخم البطين الدماغ.

للتحقيق في تنظيم النفاذية خلال الدماغ الزرد التضخم البطين، وضعنا الاحتفاظ صبغ مقايسة البطين. هذا الأسلوب يستخدم حقن الدماغ البطين في جنين الزرد المعيشة، وهي تقنية طورت من قبل في مختبرنا ^10، لتسمية fluorescently السائل المخي الشوكي. وتصوير الأجنة ثم مع مرور الوقت بينما يتحرك صبغة الفلورسنت من خلال البطينين الدماغ والظهارة العصبية. المسافة الجبهة صبغ يتحرك بعيدا عن الجانب القاعدية (غير اللمعية) من الظهارة العصبية مع مرور الوقت هو كميا وهي مقياس لنفاذية عصبية ظهارية (الشكل 1). نلاحظ أن الأصباغ 70 كيلو دالتون وأصغر سوف تتحرك من خلال الظهارة العصبية ويمكن كشفهاد خارج الدماغ الزرد الجنينية في 24 HPF (الشكل 2).

ويمكن استخدام هذا الاختبار لتحليل الصبغة الاحتفاظ نفاذية عصبية ظهارية في مجموعة متنوعة من الخلفيات وراثية مختلفة، في أوقات مختلفة خلال التنمية، وبعد الاضطرابات البيئية. قد يكون من المفيد أيضا في دراسة تراكم المرضية من CSF. وعموما، هذا الأسلوب يسمح للمحققين تحليل دور وتنظيم نفاذية خلال تطوير والمرض.

Protocol

1. التحضير للحقن مكروي

1. إعداد الإبر حقن مكروي عن طريق سحب الأنابيب الشعرية باستخدام إبرة سوتر مجتذب الصكوك.
2. تحميل إبرة حقن مكروي مع صبغة الفلورسنت (FITC-دكستران).
3. تحميل الإبرة على مياداة مجهرية وأجهزة حقن مكروي.
4. كسر إبرة حقن مكروي بعناية باستخدام ملقط لحوالي 2 ميكرومتر في العرض، ومع ذلك، سوف تختلف تبعا لهذا الإعداد microinjector الخاص بك. لدينا حقن مكروي الإبر، وهذا يتوافق مع المنطقة الأولى من الإبرة من طرف أن لا ينحني.
5. قياس حجم انخفاض النفط، وتعديل الوقت وضغط الحقن، بحيث يسلم كل حقنة 1 NL. إعدادات سبيل المثال لجهاز هارفارد microinjector هي: P = 1.4 رطل التوازن، P = 1،4 رطل من، P = 22.9 رطل لكل بوصة مربعة حقن، P = 67،8 رطل واضحة مع الوقت حقن 0،4-0،7 ثوانى. قطر إبرة لدينا باستخدام هذه الإعدادات هي حوالي 2 ميكرومتر. ومع ذلك، سوف تكون إعدادات microinjector محددة، وتختلفccording لإبرة قطرها.

2. إعداد الأجنة

1. معطف أطباق 2 مع الاغاروز 1٪ في الماء لكل حالة، والثقوب كزة في الاغاروز مع طرف ماصة ميكرولتر 1-200، وإزالة شمعات الاغاروز. ملء الأطباق مع وسائل الاعلام الجنين.
2. باستخدام ملقط، أن الأجنة dechorionate هي 18 HPF أو أكثر تحت stereomicroscope. ونظمت وفقا لأجنة وآخرون كيميل ^11.
3. نقل الأجنة في طبق dechorionated الاغاروز 1 المغلفة.
4. لتخدير الأجنة، إضافة tricaine (0.1 ملغ / مل) إلى الطبق حتى الأجنة يتوقف عن الحركة (تقدم وفقا لWesterfield ^12).

3. حقن الدماغ البطينين

1. توجيه الأجنة لذلك أنت تبحث في جانبهم الظهرية من خلال وضع ذيل الجنين في حفرة. إذا مياداة مجهرية الخاص بك هو على اليمين، ثم نقل الجنين بحيث الدماغ المقدم هو إلى اليسار وإلى اليمين الدماغ المؤخر.
2. إبرة في موقف وايدست نقطة البطين الدماغ المؤخر.
3. لوحة السقف بعناية بيرس للبطين الدماغ المؤخر لا يجري التأكد من خلال الذهاب الى عمق الدماغ في صفار (الشكل 1A).
4. حقن 1-2 NL من صبغة الفلورسنت إلى البطينين التأكد من الصبغة تملأ طول كاملة من البطينين الدماغ.
5. نقل الأجنة إلى الطبق الاغاروز 2 المغلفة وسائل الإعلام مليئة الجنين وإعادة تخدير كما هو موضح في 2.4.
6. البدء فورا في التصوير، كما هو موضح في المادة 4 من أجل الحصول على صورة صفر الوقت.

4. التصوير

1. توجيه الأجنة مع الذيل في حفرة كما هو موضح في 3.1.
2. استخدام المجهر تشريح مع ضوء الفلورسنت والمنقولة على حد سواء لالتقاط صورة الظهرية brightfield. الحفاظ على التكبير المستمر بين التصوير الأجنة مختلفة. وهذا يسمح للمقارنة مباشرة لتحليلات أجريت باستخدام J صورة (5،2-6).
3. دون تحريك الجنين، أو طبق المجهر، واتخاذالفلورسنت الصورة المقابلة.
4. كرر لكل الجنين في نقطة الوقت المطلوب.

5. الكمي لحركة صبغ

1. دمج الصور brightfield والفلورية في فوتوشوب كما هو موضح سابقا من قبل Gutzman وSIVE ^10.
2. قياس المسافة التحركات الأمامية صبغ في برنامج J صورة متاحة على http://rsbweb.nih.gov/ij/ .
3. المدمجة في ملف مفتوح J الصورة واستخدام أداة سطر لرسم خط من نقطة الدماغ المقدم يتوقف لصبغ أمام بزاوية ° 10-20 من الظهارة العصبية (1A الشكل). وقد تم اختيار هذه المنطقة لأنه هو أول موقع وملحوظ معظم صبغ تسرب من نوع الظهارة العصبية البرية.
4. حدد أداة قياس لحساب طول الخط.
5. كرر ذلك لكل نقطة في الوقت.
6. حساب المسافة صافي الجبهة صبغ انتقلت مع مرور الوقت من خلال طرح المسافة في ر = 0 نقطة من وقت آخر.
7. مؤامرة علىالرسم البياني.

6. ممثل النتائج

ويرد مثال على النتائج التي تم الحصول عليها في فحص النفاذية عصبية ظهارية باستخدام أجنة النوع البري في الشكل 1B-D. التفريق بدقة النفاذية، من المفيد لاختبار الأصباغ مع weightsto الجزيئية المختلفة تحديد الحجم الذي تتسرب منه ليست سوى قليلا في نوع البرية أو الأجنة التحكم (الشكل 2). وهذا يسمح لتحديد طفرات وراثية أو الظروف البيئية التي إما زيادة أو نقصان النفاذية (1D الشكل والأخضر وخطوط حمراء على التوالي). الظهارة العصبية لل24 HPF الزرد، 70 كيلو دالتون FITC التسريبات دكستران ببطء أكثر من 2 ساعة، في حين أن 2000 كيلو دالتون لا كيلو دالتون و 10 من التسريبات على الفور تقريبا. ولذلك 70 كيلو دالتون هو الوزن المثالي الجزيئية لتحديد الظروف أن كلا من الزيادة والنقصان النفاذية عصبية ظهارية.

إذا كانت إبرة يفتقد التجويف البطيني، مضان ثتظهر سوء خارج الدماغ في ر. = 0 (للحصول على مثال انظر Gutzman وSIVE، 2009 ¹⁰⁾ يجب التخلص من هذه الأجنة لأنه لم يرد حقن الصبغة في البداية في الدماغ، ويمكن أن تكون هناك نتيجة واضحة بشأن حركة الصبغة ونفاذية neuropeithelium.

وأخيرا، إذا الأجنة يكون البطينين صغيرة أو البطينين الدماغ من الامم المتحدة والمتضخمة، قبل حقن البطينين بمحلول ملحي يمكن القيام به قبل حقن الصبغة الفلورية. هذا يضخم البطينين مما يجعل التصور لاحقة من البطينين أسهل عندما حقن صبغة الفلورسنت مع. يجب أن يتم تنفيذ الضوابط المناسبة لتحديد ما إذا كان حقن محلول ملحي عادي يعطل التنمية الأنبوب العصبي.

الشكل 1. بالطبع وقت المختلفة الأصباغ الوزن الجزيئي (A) مخطط التجريبية. الأول، الفلورسنت يتم حقن صبغة في البطينين. X = موقف إبرة للحقن. يتم التقاط الصور الظهرية المقبل بمرور الوقت. وأخيرا، انتقل المسافة من خلال الجبهة الصبغة من الدماغ الأمامي يقاس المفصلي نقطة (يمثله خط أحمر). (BC) مدموجة brightfield والصور الظهرية الفلورسنت في 22 HPF (ر = 0 دقيقة، B) و 24 HPF (ر = 120 دقيقة، C). الخط الأبيض يشير إلى المسافة من أمام الصبغة من البطين الدماغ الأمامي. (D) افتراضية البيانات نفاذية العينة. الأزرق = النوع البري أو ضوابط، مع عينة الأحمر = النفاذية النسبية للسيطرة على انخفاض، والأخضر مع عينة = النفاذية النسبي المتزايد للسيطرة.

الشكل 2. قياس نفاذية عصبية ظهارية لمختلف الأصباغ الوزن الجزيئي. (AE) brightfield الظهرية المدمجة والصور الفلورسنت من 22 نوع الأجنة HPF البرية في ر = 0 دقيقة بعد الحقن مع FITC-Dextran من الأوزان الجزيئية التالية: 10 كيلو دالتون (A)، و 40 كيلو دالتون (B)، و 70 كيلو دالتون (C)، و 500 كيلو دالتون (D) و 2،000 كيلو دالتون (E). (A'-E ') الجنين في نفس (AE) في ر = 120 دقيقة في 24 HPF. الأمامي إلى اليسار. F = الدماغ الأمامي، M = الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر = H. النجمة = الأذن.

Discussion

علينا أن نظهر القدرة على تحديد النفاذية للدماغ الزرد الجنينية المعيشة كما هو محدد لصباغة حقن من وزن جزيئي معين. ملاحظتنا أن الظهارة العصبية الجنينية الزرد هو نفاذية تفاضلي لصبغات مختلفة من الأوزان الجزيئية تشير إلى أن الصبغة تتحرك عبر نفاذية paracellular. ومع ذلك، لا يمكننا أن نستبعد إمكانية مساهمة العابر لللنفاذية الملاحظة. ويمكن تطبيق هذه التقنية لهيكل أنبوبي أي الأخرى طالما يمكن رؤية كل من داخل وخارج الأنبوب ويمكن حقن التجويف. ومع ذلك، فإن تحديد الوزن الجزيئي للمثالية لأجهزة أخرى يجب أن يتم تحديد لأن هذا قد تختلف بين الأنسجة والمراحل التنموية.

وهذا الاختبار تمكين مزيد من التحقيق في دور نفاذية الظهارية خلال التجويف التضخم وتنظيم حجم التجويف. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية هوليرة لبنانية تميز تغيرات في نفاذية الظهارية المرتبطة اضطرابات مثل استسقاء الرأس ومرض تكيس الكلى.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7136, D7137, D1822, D1820, D1845
Tricaine powder	Sigma	A5040
Capillary Tubes	FHC Inc.	30-30-1