Um ensaio para a permeabilidade do neuroepitélio Zebrafish Embryonic

Summary

Nós descrevemos uma medição animal vivo todo quantitativa para a permeabilidade do cérebro de zebrafish embrionário. A técnica de análise da capacidade de retenção de fluido cerebrospinal e moléculas de diferentes pesos moleculares no interior do lúmen do tubo neural e quantifica o seu movimento para fora dos ventrículos. Este método é útil para a determinação de diferenças de permeabilidade epitelial e maturação durante o desenvolvimento e na doença.

Abstract

O sistema ventricular do cérebro é conservada entre vertebrados e é composto de uma série de cavidades interconectadas chamado ventrículos cerebrais, os quais formam, durante as primeiras fases do desenvolvimento do cérebro e são mantidas durante toda a vida do animal. O sistema ventricular do cérebro é encontrado em vertebrados, e os ventrículos se desenvolver após a formação do tubo neural, em que o lúmen central, enche-se de líquido cefalorraquidiano (LCR) ^1,2. CSF é um líquido rico em proteínas que são essenciais para o desenvolvimento do cérebro e função normais ^3-6.

No peixe-zebra, o cérebro de inflação ventrículo começa em cerca de 18 a fertilização pós hr (hpf), depois de o tubo neural está fechado. Vários processos estão associados com a formação de cérebro ventricular, incluindo a formação de um neuroepitélio, a formação da junção estanque, que regula a produção de permeabilidade e CSF. Nós mostramos que o Na, K-ATPase é necessária para a inflação do ventrículo cerebral, afectando todos estes processoses ^7,8, ao passo 5a claudina é necessário para a formação da junção estanque ^9. Além disso, mostramos que a "relaxamento" do neuroepitélio embrionário, através da inibição da miosina, está associada com a inflação do ventrículo cerebral.

Para investigar a regulação da permeabilidade durante zebrafish inflação ventrículo cerebral, foi desenvolvido um ensaio ventricular retenção de corante. Este método utiliza a injecção ventrículo cerebral em um embrião do peixe-zebra vivos, uma técnica anteriormente desenvolvido no nosso laboratório ^10, a fluorescência rotular o fluido cerebrospinal. Os embriões são então trabalhada ao longo do tempo à medida que o corante fluorescente, através dos ventrículos cerebrais e neuroepitélio. A distância da frente de corante se afasta do basal (não luminal) do lado do neuroepitélio ao longo do tempo é quantificado e é uma medida da permeabilidade neuroepitelial (Figura 1). Observamos que corantes 70 kDa e menores vão percorrer a neuroepitélio e pode ser detected fora do cérebro embrionário do peixe-zebra a 24 hpf (Figura 2).

Este ensaio de retenção de corante pode ser usada para analisar a permeabilidade neuroepitelial em uma variedade de diferentes origens genéticas, em momentos diferentes durante o desenvolvimento, e após perturbações ambientais. Também pode ser útil para examinar a acumulação patológica de CSF. No geral, esta técnica permite aos pesquisadores analisar o papel e regulação da permeabilidade durante o desenvolvimento e doença.

Protocol

1. Preparando-se para microinjeção

1. Prepare agulhas microinjeção puxando tubos capilares utilizando Sutter extrator agulha instrumentos.
2. Agulha de microinjecção de carga com corante fluorescente (FITC-dextrano).
3. Montar a agulha no aparelho micromanipulador e microinjecção.
4. Cuidadosamente quebrar agulha microinjeção usando uma pinça para cerca de 2 m de largura, no entanto, isso vai variar dependendo da configuração do microinjetor. Para agulhas nossos microinjecção, esta corresponde à primeira região da agulha a partir da ponta, que não se curva.
5. Medir o tamanho da gota de óleo, ajustando o tempo de injecção e pressão, de modo que cada um proporciona uma injecção nl. Definições de exemplo para Harvard Apparatus microinjetor são: P = 1,4 psi equilíbrio, P = 1,4 psi fora, P = 22,9 psi injetar, P = 67,8 psi claras com um tempo de injeção de 0,4-0,7 seg. O diâmetro da nossa agulha usando essas configurações é de aproximadamente 2 m. No entanto, as definições serão microinjetor específico, e variamegundo a agulha de diâmetro.

2. Preparando os embriões

1. Revestimento de dois pratos com agarose a 1% em água, para cada condição, furos puxão em agarose com uma ponta de pipeta de 1-200 uL, e remover tampões de agarose. Preencha pratos com a mídia de embriões.
2. Usando pinça, embriões dechorionate que são 18 hpf ou mais sob estereomicroscópio. Embriões são encenadas de acordo com Kimmel et al. ^11.
3. Transferência de embriões dechorionated no prato agarose primeiro revestido.
4. Para anestesiar os embriões, adicionar tricaina (0,1 mg / ml) para o prato até embriões parar de se mover (feito de acordo com Westerfield ^12).

3. Injetando os ventrículos cerebrais

1. Embriões orientar para que você está olhando para o seu lado dorsal, colocando a cauda do embrião dentro do buraco. Se o micromanipulador está do lado direito, em seguida, deslocar o embrião de modo que o prosencéfalo é para a esquerda e para a direita rombencéfalo.
2. Posição da agulha ao widest ponto de ventrículo rombencéfalo.
3. Cuidadosamente placa telhado perfurar do ventrículo rombencéfalo tendo a certeza de não passar a profundidade do cérebro para a gema (Figura 1A).
4. Injectar 1-2 nl de corante fluorescente para os ventrículos, certificando-se que o corante enche todo o comprimento dos ventrículos do cérebro.
5. Transferir os embriões para o prato agarose segundo revestido cheio com meios de embriões e re-anestesiar como descrito em 2.4.
6. Começar imediatamente a imagem, como descrito na seção 4, a fim de obter uma imagem tempo zero.

4. Imagem

1. Embriões orientar com sua cauda no buraco, como descrito em 3.1.
2. Use um microscópio de dissecação com luz fluorescente e transmitida tanto para obter uma imagem dorsal campo claro. Mantenha a ampliação constante entre imagiologia de embriões diferentes. Isto permite a comparação direta de análises realizadas utilizando Image J (5,2-6).
3. Sem mover o embrião microscópio, ou prato, dê umaimagem fluorescente correspondente.
4. Repetir para cada embrião em pontos de tempo desejados.

5. Quantificação de Movimento Dye

1. Fundir de campo claro e as imagens fluorescentes em Photoshop como anteriormente descrito por Gutzman e Sive ^10.
2. Medir a distância os movimentos frente de corante no software Image J disponível em http://rsbweb.nih.gov/ij/ .
3. Arquivo mesclado aberto no Image J e use a ferramenta de linha para desenhar uma linha do prosencéfalo dobradiça ponto-a-tingir frente em um ângulo de 10-20 ° de neuroepitélio (Figura 1A). Esta região foi escolhida por ser o primeiro local e mais notável de corante vazar do neuroepitélio de tipo selvagem.
4. Selecione a ferramenta de medição para calcular o comprimento da linha.
5. Repetir para cada ponto do tempo.
6. Calcular a distância a frente de corante líquido movido ao longo do tempo, subtraindo a distância em t = 0 a partir de outros pontos de tempo.
7. Lote emgráfico.

6. Resultados representativos

Um exemplo dos resultados obtidos num ensaio de permeabilidade utilizando embriões neuroepitelial do tipo selvagem é mostrada na Figura 1B, D-. Para diferenciar com precisão da permeabilidade, que é útil para testar os corantes com weightsto molecular diferente identificar um tamanho que é apenas ligeiramente permeável de tipo selvagem ou de embriões de controlo (Figura 2). Isto permite a identificação de mutantes genéticos ou condições ambientais que, ou aumento ou diminuição de permeabilidade (Figura 1D, verde e vermelho, respectivamente, de linhas). Para o neuroepitélio zebrafish 24 hpf, 70 kDa vazamentos FITC Dextran lentamente ao longo de 2 horas, enquanto 2.000 kDa não faz e 10 kDa quase imediatamente vaza. Portanto 70 kDa é o peso ideal molecular para identificar as condições que tanto aumentar e diminuir a permeabilidade neuroepitelial.

Se a agulha falha do lúmen do ventrículo, a fluorescência wmal aparecem fora do cérebro em t = 0 (para um exemplo veja Gutzman e Sive, 2009 ^10). Estes embriões devem ser eliminados uma vez que a tinta não foi injectado inicialmente contido no interior do cérebro e nenhuma conclusão clara sobre o movimento do corante e permeabilidade da neuropeithelium podem ser feitas.

Finalmente, se os embriões têm ventrículos pequenos ou ventrículos cerebrais un-inflados, pré-injecção dos ventrículos com uma solução salina pode ser feito antes da injecção do corante fluorescente. Isto faz a insuflação dos ventrículos tornando visualização posterior dos ventrículos mais fácil quando se injecta com o corante fluorescente. Controlos apropriados devem ser realizados para determinar se a injecção de uma solução salina normal, interrompe o desenvolvimento do tubo neural.

Figura 1. Curso de tempo de diferentes corantes de peso molecular. (A) Diagrama Experimental. Primeiro, Corante fluorescente é injetado nos ventrículos. X = posição de agulha para injecção. Próxima imagens dorsais são capturados ao longo do tempo. Finalmente, a distância percorrida pela frente do corante a partir do prosencéfalo dobradiça ponto é medida (representada por uma linha vermelha). (BC) Incorporada campo claro e fluorescentes imagens dorsal a 22 hpf (t = 0 min, B) e 24 hpf (t = 120 min, C). Linha branca indica a distância da frente de corante do cérebro anterior do ventrículo. (D) de dados de permeabilidade hipotéticos amostra. Azul = tipo selvagem ou controles, vermelho = amostra com permeabilidade diminuiu em relação ao controle, e amostra verde = com permeabilidade aumentada em relação ao controle.

Figura 2. Medição da permeabilidade de diferentes corantes neuroepitelial peso molecular. (AE) brightfield Dorsal resultante da fusão e as imagens fluorescentes de 22 HPF embriões de tipo selvagem em t = 0 min após a injecção, com FITC-dExtran dos pesos moleculares seguintes: 10 kDa (A), 40 kDa (B), 70 kDa (C), 500 kDa (D) e de 2.000 kDa (E). (A'-E ') O mesmo que no embrião (AE) em t = 120 min a 24 hpf. Anterior para a esquerda. F = prosencéfalo, M = mesencéfalo, H = rombencéfalo. Asterisco = orelha.

Discussion

Nós demonstrar a capacidade de quantificar a permeabilidade do cérebro embrionário do peixe-zebra vivos, tal como determinado por um corante injectado de um determinado peso molecular. A nossa observação de que o neuroepitélio zebrafish embrionária é diferencialmente permeável aos corantes de diferentes pesos moleculares sugere que o corante está a avançar através da permeabilidade paracelular. No entanto, não podemos descartar a possibilidade de uma contribuição para a permeabilidade transcelular observado. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer outra estrutura tubular, enquanto o interior eo exterior do tubo pode ser visto e o lúmen pode ser injectada. No entanto, a identificação do peso molecular ideal para outros órgãos terá de ser determinado como este pode diferir entre os tecidos e estádios de desenvolvimento.

Este ensaio vai permitir uma investigação mais aprofundada sobre o papel da permeabilidade epitelial durante lúmen inflação ea regulação do tamanho do lúmen. Além disso, esta técnica vai elelp caracterizar as alterações na permeabilidade epitelial associada a perturbações tais como a hidrocefalia e doença poliquística do rim.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7136, D7137, D1822, D1820, D1845
Tricaine powder	Sigma	A5040
Capillary Tubes	FHC Inc.	30-30-1