En analys för Permeabilitet för zebrafisk Embryonal neuroepitelet

Summary

Vi beskriver en levande hela djuret kvantitativ mätning för permeabilitet embryonala zebrafisk hjärnan. Tekniken analyserar förmågan att kvarhålla cerebrospinalvätska och molekyler av olika molekylvikter inom neuralrörsdefekter lumen och kvantifierar deras rörelse ut ur kamrarna. Denna metod är användbar för att bestämma skillnader i epitelial permeabilitet och mognad under utveckling och sjukdom.

Abstract

Hjärnan ventrikulära systemet är konserverad bland ryggradsdjur och består av en serie sammankopplade hålrum som kallas ventriklar i hjärnan, som bildas under de tidigaste stadierna av hjärnans utveckling och bibehålls under hela djurets liv. Hjärnan ventrikulära systemet hittas i ryggradsdjur, och ventriklarna utvecklas efter neuralröret bildning, när den centrala lumen fylls med cerebrospinalvätska (CSF) ^1,2. CSF är en proteinrik vätska som är nödvändig för normal utveckling av hjärnan och funktion ^3-6.

I zebrafisk, börjar hjärnan ventrikeln inflation på ungefär 18 timmar efter befruktning (HPF), efter det neurala röret stängt. Flera processer är förknippade med hjärnan kammare bildas, bland annat bildandet av en neuroepitelet, stram korsning formation som reglerar permeabilitet och CSF-produktion. Vi visade att Na, K-ATPas som krävs för hjärnans ventrikel inflationen påverkar alla dessa processeres ^7,8, medan Claudin 5a är nödvändig för tät korsning bildas ^9. Dessutom visade vi att "avkoppling" av embryonala neuroepitelet, via hämning av myosin, är förknippad med hjärnan kammare inflationen.

För att undersöka regleringen av permeabiliteten under zebrafisk hjärnan kammare inflation har vi utvecklat en ventrikulär analys färg retention. Denna metod använder injektion hjärna kammare i en levande zebrafisk embryo, en teknik som tidigare utvecklats i vårt labb ^10, för att fluorescerande märka cerebrospinalvätskan. Embryon sedan avbildas med tiden, eftersom fluorescerande färgämnet förflyttas genom ventriklar i hjärnan och neuroepitelet. Avståndet färgfronten rör sig bort från den basala (icke-luminala) sidan av neuroepitelet över tiden kvantifieras och är ett mått på neuroepiteliala permeabilitet (figur 1). Vi observerar att färgämnen 70 kDa och mindre kommer gå igenom neuroepitelet och kan detected utanför den embryonala zebrafisk hjärnan vid 24 HPF (Figur 2).

Detta färgämne kvarhållande analys kan användas för att analysera neuroepiteliala permeabilitet i en mängd olika genetiska bakgrunder, vid olika tidpunkter under utveckling, och efter miljö störningar. Det kan också vara användbart för att undersöka patologisk ansamling av CSF. Sammantaget gör denna teknik utredare att analysera vilken roll och reglering av permeabilitet under utveckling och sjukdom.

Protocol

1. Förberedelser för Mikroinjektion

1. Förbered mikroinjektion nålar genom att dra kapillärrör med Sutter instrument nål avdragare.
2. Load mikroinjektion nål med fluorescerande färgämne (FITC-Dextran).
3. Montera nålen mikromanipulator och mikroinjektion apparat.
4. Bryt försiktigt mikroinjektion nål med pincett till ungefär 2 nm i bredd, dock kommer detta varierar beroende på din microinjector inställningar. För våra mikroinjektion nålar, motsvarar detta det första området av nålen från spetsen som inte böjer.
5. Mät droppstorleken i olja, justering injektion tid och tryck, så att varje injektion levererar 1 nl. Exempel inställningar för Harvard Apparatus microinjector är: P saldo = 1,4 psi, P ut = 1,4 psi, P injicera = 22,9 psi, P tydliga = 67,8 psi med en injektion tid från 0,4 till 0,7 sek. Diametern på vår nål med dessa inställningar är ungefär 2 pm. Dock kommer inställningar att microinjector specifika, och varieranligt nål diameter.

2. Förbereda Embryon

1. Coat 2 rätter med 1% agaros i vatten för varje tillstånd, hål peta in agaros med en 1-200 ul pipettspets, och ta bort agaros pluggar. Fyll rätter med embryo medier.
2. Använd pincett, dechorionate embryon som är 18 HPF eller äldre under ett stereomikroskop. Embryon iscensatt enligt Kimmel et al. ^11.
3. Överför dechorionated embryon in i den första agarosbelagda maträtt.
4. Att bedöva embryon, tillsätt tricaine (0,1 mg / ml) till skålen tills embryon slutar röra (tillverkad enligt Westerfield ^12).

3. Injicera ventriklar i hjärnan

1. Orient embryon så du tittar på sin ryggsidan genom att sätta svansen av embryot i hålet. Om din mikromanipulator är på höger och sedan flytta embryot så att framhjärnan är till vänster och bakhjäman till höger.
2. Placera nålen widest punkt bakhjäman ventrikeln.
3. Försiktigt Pierce takplåt av bakhjäman kammare är säker på att inte gå igenom djupet av hjärnan i äggulan (Figur 1A).
4. Injicera 1-2 nl av fluorescerande färgämne i ventriklarna och ser till att färgämnet fyller hela längden av hjärnan ventriklar.
5. Överför embryon till den andra agarosbelagda skålen fylld med embryo medier och åter söva enligt 2,4.
6. Omedelbart börja avbildning, som beskrivs i avsnitt 4 för att få en bild tid noll.

4. Imaging

1. Orient embryon med svansen i hålet som beskrivs i 3,1.
2. Använd en dissekera mikroskop med både sänds och lysrör för att ta en bild brightfield rygg. Håll förstoringen konstant mellan avbildning av olika embryon. Detta möjliggör direkt jämförelse av analyser utförda med Image J (5,2-6).
3. Utan att flytta embryot, mikroskop eller skål, ta enmotsvarande fluorescerande bild.
4. Upprepa för varje embryo vid önskade tidpunkter.

5. Kvantifiering av färgämne rörelsen

1. Sammanfoga ljusfält och fluorescerande bilder i Photoshop som tidigare beskrivits av Gutzman och Sive ^10.
2. Mät avståndet färgämnet främre rör sig i bild J programvara tillgänglig på http://rsbweb.nih.gov/ij/ .
3. Öppna sammanslagna fil i Image J och använda linje för att rita en linje från framhjärnan gångjärn-punkt att färga fram på en 10-20 ° vinkel från neuroepitelet (Figur 1A). Denna region har valts eftersom den är den första och mest märkbara platsen för färg läcker ut från vildtyp neuroepitelet.
4. Välj mätverktyg för att beräkna längden av raden.
5. Upprepa för varje tidpunkt.
6. Beräkna netto avstånd färgfronten flyttades över tiden genom att subtrahera avståndet vid t = 0 från andra tidpunkter.
7. Tomt pågraf.

6. Representativa resultat

Ett exempel på resultat som erhållits i en neuroepiteliala permeabilitet analys med användning av vildtyp embryon visas i figur 1B-D. Att exakt skilja permeabilitet, är det bra att testa färger med olika molekylär weightsto identifiera en storlek som är bara något läckande i vildtyp eller embryon kontroll (Figur 2). Detta möjliggör identifiering av genetiska mutanter eller miljöförhållanden som antingen ökar eller minskar permeabilitet (figur 1D, gröna och röda linjer respektive). För 24 HPF zebrafisk neuroepitelet, 70 kDa FITC Dextran läcker långsamt över 2 timmar, medan 2.000 kDa inte och 10 kDa nästan omedelbart läcker ut. Därför 70 kDa är den idealiska molekylvikten att identifiera förhållanden som både öka och minska neuroepiteliala permeabilitet.

Om nålen missar ventrikulära lumen, fluorescens wsjuk visas utanför hjärnan vid t = 0 (för ett exempel se Gutzman och Sive, 2009 ^10). Dessa embryon kasseras eftersom den injicerade färgämnet inte initialt inuti hjärnan och ingen tydlig slutsats om rörelse av färgämnet och permeabilitet neuropeithelium kan göras.

Slutligen, om embryon har små ventriklarna eller icke-uppblåsta ventriklar i hjärnan, pre-injektion av ventriklar med en saltlösning kan göras före injektion av fluorescerande färg. Detta blåser ventriklarna gör efterföljande visualisering av ventriklarna lättare när injektioner med det fluorescerande färgämnet. Ordentliga kontroller måste utföras för att fastställa om injektion av saltlösning stör normal neuralrörsdefekter utveckling.

Figur 1. Tidsförlopp för olika molekylvikt färgämnen. (A) Experimentell diagram. FörstÄr fluorescerande färgämne sprutas in i ventriklarna. X = position nål för injektion. Nästa rygg bilderna tas över tiden. Slutligen flyttade avstånd färgen fronten från framhjärnan gångjärn-punkt mäts (representeras av en röd linje). (BC) Sammanslagen ljusfält och fluorescerande rygg bilder med 22 HPF (t = 0 min, B) och 24 HPF (t = 120 min, C). Vit linje anger avståndet färgen fronten från framhjärnan kammare. (D) HYPOTETISK prov permeabilitetsdata. Blå = vildtyp eller kontroller, röd = prov med minskad permeabilitet i förhållande till kontroll, och grön = prov med ökad permeabilitet i förhållande till kontroll.

Figur 2. Mätning av neuroepiteliala permeabilitet till olika molekylvikt färgämnen. (AE) Dorsal sammanslagna ljusfält och fluorescerande bilder av 22 HPF vildtyp embryon vid t = 0 min efter injektion med FITC-dExtran av följande molekylvikter: 10 kDa (A), 40 kDa (B), 70 kDa (C), 500 kDa (D) och 2.000 kDa (E). (A'-E ') Samma embryo som i (AE) vid t = 120 min vid 24 HPF. Anterior till vänster. F = framhjärna, M = mitthjärnan, H = bakhjäman. Asterisk = öra.

Discussion

Vi visa förmåga att kvantifiera permeabilitet levande embryonala zebrafisk hjärna som fastställts för en injicerad färg av en viss molekylvikt. Vår observation att den embryonala zebrafisk neuroepitelet är differentiellt genomsläpplig för färgämnen med olika molekylvikt tyder på att färgämnet går via paracellulär permeabilitet. Däremot kan vi inte utesluta möjligheten av ett transcellulär bidrag till den observerade permeabilitet. Denna teknik kan tillämpas på varje annan rörformig struktur, så länge som både på insidan och utsidan av röret kan ses och lumen kan injiceras. Emellertid kommer identifieringen av den ideala molekylvikten för andra organ måste fastställas eftersom detta kan variera mellan vävnader och utvecklingsstadier.

Denna analys kommer att möjliggöra ytterligare utredning in i rollen som epitelial permeabilitet under lumen inflationen och reglering av lumen storlek. Dessutom har denna teknik kommer hanlp karakterisera ändringar i epitelial permeabilitet associerad med störningar såsom hydrocefalus och polycystisk njursjukdom.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable	Invitrogen	D7136, D7137, D1822, D1820, D1845
Tricaine powder	Sigma	A5040
Capillary Tubes	FHC Inc.	30-30-1