Summary
我们提出一个方法，收集脑脊液（CSF），并建立系统，缺乏的胚胎斑马鱼大脑脑室系统内脑脊液。 CSF的组成及其胚胎大脑发育过程中的要求，这使得进一步的检查。
Abstract
脑脊液（CSF）是一种富含蛋白质的脑室内所含的流体。这是目前早期脊椎动物的胚胎发育过程中，坚持在整个生命。成人CSF认为，以减轻大脑，排除废物，并进行分泌的分子1,2。在成人和年龄较大的胚胎中，大多数的CSF是由脉络丛，一系列的高度血管化的分泌位于脑室3-5相邻的区域。在斑马鱼，脉络丛完全形成受精后144小时（HPF）6。在此之前，在包括鼠标，一个显着量的胚胎CSF（eCSF）的斑马鱼和其他脊椎动物胚胎是本。这些数据和研究表明，在鸡的神经上皮分泌在开发的早期，可能是之前的主要来源eCSF发展脉络丛7。
eCSF包含了大约3倍以上的蛋白质吨韩成人CSF，这表明它可能具有重要作用，在发展8,9。研究表明，在小鸡和老鼠分泌因子eCSF，流体压力，或这些的组合，是非常重要的神经发生，基因表达，细胞增殖和细胞生存的神经上皮10-20中。人，大鼠，小鼠和小鸡eCSF的蛋白质组学分析，已经确定了许多蛋白质可能是必要的CSF功能。这些包括胞外基质成分，载脂蛋白，渗透压调节蛋白和蛋白参与细胞死亡和增殖21-24。然而，复杂的功能在很大程度上是未知的eCSF。
我们已经开发出一种方法，用于除去从斑马鱼脑室eCSF，从而允许识别eCSF组件，并在开发过程中进行分析的eCSF规定的。虽然可以采集更多eCSF，从其他脊椎动物系统W第i个较大的胚胎，eCSF可以收集到的斑马鱼发育的早期阶段，与遗传或环境条件下，导致脑室体积异常或形态。拆卸和回收的eCSF允许质谱分析，调查eCSF功能，并重新选择因素破入脑室分析它们的功能。因此，斑马鱼早期胚胎的可访问性可以在开发过程中的eCSF功能进行详细的分析。
Protocol
1。准备显微注射针和细胞电
- 根据制造商的指示，填写Eppendorf公司CellTram油微量注射器装置与矿物油。
- 准备显微注射针拉毛细管萨特仪器针拔出器。
- 微操作机器人连接到Eppendorf公司CellTram上安装针。
- 小心打破针尖。为针尖大小均匀，用千分尺测量，或比较的参考针。
- 填写针的长度与油，使用CellTram，推动油价下跌的长度，小心，以避免任何气泡。
2。准备胚胎
- 在1％的琼脂糖涂布菜用1-200微升的移液管尖戳孔，并除去琼脂糖插头。填写菜与胚胎媒体（根据韦斯特25）。
- 钳，dechorionate的胚胎体视显微镜下。
- 转让dechorionated胚胎到琼脂糖凝胶涂层菜。
- 若要麻醉胚胎，三卡因（0.1毫克/毫升）添加琼脂糖培养皿直到胚胎停止移动（韦斯特25根据）。
3。排水eCSF
- 东方胚胎的琼脂糖和最接近显微操纵后部两侧的孔中与它们的尾巴，允许可视化的大脑的背侧。
- 针定位在菱0/1的铰接点或后脑心室（ 图1A）的最宽点。
- 小心刺破屋顶板的后脑心室进入蛋黄，千万不要去通过深入的大脑。
- 沥干eCSF使用CellTram和收集液中显微注射针。要小心，以避免任何细胞。
4。成分分析收集eCSF的
- 一旦被收集在针eCSF，仔细停止从CellTram的吸入。
- 莫从下针，没办法菜，小心地将针管所需的缓冲区。
- 使用CellTram，沥干eCSF满分针进入尝试，以避免污染的油溶液与缓冲。
- 为了除去细胞您已吸气一起以10,000×g的eCSF，自旋eCSF。收集未受污染的eCSF（上清），并存储在-80°C，直到准备进行进一步的分析。
5。重新的选择因素
- 沥干eCSF在所需的时间间隔期间每2小时，由于流体在此期限内补充。排水时间点之间，取出针和储存的胚胎在28.5°C，或所需的温度。
- 将第二的微量移液器针与测试因素。
- 地点连接到微量注射器针头插入微操作机器人。
- 调整注射量的墨滴大小通过测量在油和调整喷射时间和p 1 NLressure。
- 注入1-2 NL到如前所述26脑室。
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Representative Results
一个排水脑室的一个例子示出在图1B-C。作为他们缺乏eCSF的（ 图1B和C），脑室倒塌。可以看出在背侧的图像（ 图1B-C，以及图2A-D）的后脑神经上皮确实保留其特征的形态，而且似乎是开放，尽管缺乏eCSF可能是由于强大的铰接点。然而，横向次（ 图2A'-D'）表明已后脑脑室沥干，的存在下，一薄的柔性顶板上皮折叠腹侧一致。在野生型胚胎，eCSF连续生产和笔芯大脑脑室引流（ 图2）后2-3小时。因此，脑脊液需要不断比感兴趣的时间耗尽。
，虽然移除的流体在24 hpf时不扰乱大体形态或发展，eCSF除去在一个较长每 IOD发展可能产生不利影响全身的发展。这应该予以考虑确定的疗效时注入脑室的因素。此外，为了确定是否损失的eCSF或由于针穿刺大脑发育缺陷的结果，是一个重要的控制的针插入到大脑而不删除eCSF。
我们表明，eCSF具有比全胚胎提取物，不同的蛋白质谱分析表明可以收集来自斑马鱼eCSF（ 图3）的可检测量的蛋白质的SDS-PAGE的蛋白质凝胶。这表明，神经上皮细胞的污染物是在较低的水平比eCSF特定的蛋白质，进一步说是足够的用于质谱分析，可以收集大量的蛋白质。
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图1。手动排水脑室。 （A）实验设计。横向（左）和背（右）的意见显微注射针插入。针（黑色三角形）被插入到在最宽点的后脑后脑脑室顶板。然后将针插入到指定的红色箭头中脑和前脑脑室。 （BC）24 HPF的例子手动排水胚胎。同一胚胎排水前，（B）或（C）的漏极之后成像。 （B'-C'）的踪迹BC。灰色线表示形态存在，但不可见。 F =前脑，M =中脑，：H =后脑的。比例尺= 50微米。
图2。eCSF笔芯随着时间的推移的脑室。 （A）24（B）后，立即排水前的斑马鱼胚胎吨= 0（C）15（D）60，（E）120（F）180，（G）240，和（H）排水后的300分钟（m）。 （AH）背和（A'-H'），向左侧的前方的横向的明视野图像。 F =前脑，M =中脑，：H =后脑的。比例尺= 50微米。
图3。不同的蛋白质表达谱24 HPF整个斑马鱼胚胎（WE）提取物（0.5μg总蛋白）和24 HPF eCSF从50胚胎。 SDS上样缓冲液添加到收集eCSF变性蛋白质，8％的Tris-HCl PAGE凝胶上运行的样品，和检测用SYPRO红宝石。 *表示带独特的eCSF。
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Discussion
使用这种技术的手动排水eCSF的从斑马鱼脑室用于确定eCSF在开发过程中的要求将是有益的。此外，这种技术将允许在胚胎发育过程中描述的eCSF蛋白更新。在此期间，不同的蛋白质的鉴定将能够进一步调查到CSF和大脑发育过程中的潜在作用的功能。在脊椎动物中，在eCSF（FGF2，IGF2，视黄酸和载脂蛋白）的一些因素有证明作用在神经上皮细胞存活，增殖和神经细胞13,17,20,23,27,28。然而，似乎有数百个在eCSF未知蛋白，得到脉络膜丛形成后，购买的时间点比这里演示。此外，我们的实验室和其他已经确定的斑马鱼突变体异常脑室大小或脑部缺陷29日至31日 ，5月甲肝Ê异常在eCSF的组成和功能。这种方法很容易可以用于分离和检测突变体或在不同的环境条件下，假定异常eCSF。
使用的斑马鱼系统是一个功能强大的替代选择的因素通过注射进入脑室后去除eCSF，从而测试他们的大脑发育过程中的功能。小分子，蛋白质和eCSF后获得的遗传或化学的扰动，可以被测试。来自其他物种的eCSF放归将允许跨物种和根据不同的病理条件下，如脑积水，补充和接口与哺乳动物的研究的因素和功能的比较。总之，使用的斑马鱼中删除eCSF，分析其组成，并重新恢复到脑室eCSF或特定因素，将显着增加的作用和调节eCSF功能的了解的大脑脑室系统。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国家精神卫生研究所和美国国家科学基金会的支持。特别感谢仁Gutzman博士，博士阿曼达迪金森和其他许多有益的讨论和建设性的批评的的西伯实验室成员，并奥利维尔Paugois专家鱼的饲养。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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