Summary
Presentiamo un metodo per raccogliere il fluido cerebrospinale (CSF) e per creare un sistema che manca CSF nel sistema ventricolare cerebrale embrionale zebrafish. Ciò consente un ulteriore esame della composizione CSF e il suo fabbisogno durante lo sviluppo embrionale del cervello.
Abstract
Liquido cerebrospinale (CSF) è un fluido ricco di proteine contenute nei ventricoli cerebrali. E 'presente durante le prime fasi dello sviluppo embrionale dei vertebrati e persiste per tutta la vita. Adulto CSF è pensato per attutire il cervello, rimuovere i rifiuti, e portare secreta 1,2 molecole. Nell'embrione adulti e anziani, la maggior parte di CSF è fatta dal plesso coroide, una serie di regioni altamente vascolarizzati secretori adiacenti al cervello ventricoli 3-5. In zebrafish, la coroide plesso è completamente formato a 144 dopo la fecondazione ore (HPF) 6. Prima di questo, negli embrioni dei vertebrati sia zebrafish e altre cui mouse, una quantità significativa di embrionale CSF (eCSF) è presente. Questi dati e studi suggeriscono che il pulcino è neuroepitelio secretoria presto nello sviluppo e può essere la principale fonte di eCSF prima del plesso coroide sviluppo 7.
eCSF contiene circa tre volte più proteine than adulto CSF, suggerendo che essa può avere un ruolo importante durante lo sviluppo 8,9. Studi in pulcino e topo dimostrano che i fattori secreti nel eCSF, pressione del fluido, o una combinazione di questi, sono importanti per la neurogenesi, sopravvivenza espressione genica, la proliferazione cellulare, e nella cella neuroepitelio 10-20. Analisi proteomica di umano, ratto, topo, e pulcino eCSF hanno identificato molte proteine che potrebbero essere necessari per la funzione LCR. Questi includono componenti della matrice extracellulare, apolipoproteine, proteine che regolano la pressione osmotica, e proteine coinvolte nella morte cellulare e proliferazione 21-24. Tuttavia, le funzioni complesse del eCSF sono largamente sconosciuti.
Abbiamo sviluppato un metodo per la rimozione eCSF dai ventricoli cerebrali zebrafish, consentendo così l'identificazione dei componenti eCSF e per l'analisi del fabbisogno eCSF durante lo sviluppo. Anche se più eCSF possono essere raccolti da altri vertebrati sistemi with embrioni più grandi, eCSF possono essere raccolti fin dalle prime fasi di sviluppo zebrafish, e in condizioni genetiche o ambientali che portano a volume anormale ventricolo del cervello o la morfologia. La rimozione e la raccolta di eCSF permette l'analisi di spettrometria di massa, l'indagine della funzione eCSF, e la reintroduzione di elementi selezionati nei ventricoli di test la loro funzione. Così l'accessibilità del zebrafish precoce consente un'analisi dettagliata della funzione eCSF durante lo sviluppo.
Protocol
1. Preparazione Aghi microiniezione e tram cellulare
- Riempire Eppendorf CellTram olio apparato microiniettore con olio minerale secondo le istruzioni del produttore.
- Preparare aghi microiniezione tirando tubi capillari con Sutter estrattore ago strumenti.
- Montare ago su micromanipolatore collegato a Eppendorf CellTram.
- Attentamente rompere la punta dell'ago. Per le dimensioni della punta uniforme, misurare con un micrometro, o confrontare ad un ago di riferimento.
- Riempire la lunghezza dell'ago con olio, utilizzando il CellTram per spingere l'olio per tutta la lunghezza, facendo attenzione ad evitare eventuali bolle.
2. Preparazione dei Embrioni
- Colpire i fori in un piatto rivestito di agarosio 1% con una punta 1-200 microlitri pipetta, e rimuovere i tappi di agarosio. Riempire piatto con i media di embrioni (in conformità con le Westerfield 25).
- Utilizzando pinze, embrioni dechorionate sotto stereomicroscopio.
- Trasferimento embrioni dechorionatedin un piatto rivestito di agarosio.
- Per anestetizzare embrioni, aggiungere Tricaine (0,1 mg / ml) al piatto agarosio fino embrioni interrompe il movimento (in conformità con le Westerfield 25).
3. Svuotamento del eCSF
- Orientare gli embrioni con le code nei fori di agarosio e loro parti posteriori più vicini al micromanipolatore, permettendo la visualizzazione del lato dorsale del cervello.
- Posizionare l'ago al rhombomere 0/1 cerniera-punto o punto più largo del romboencefalo ventricolo (Figura 1A).
- Attenzione forare lamiera del tetto del ventricolo romboencefalo assicurandosi di non passare attraverso la profondità del cervello nel tuorlo.
- Svuotare il eCSF utilizzando il CellTram e raccogliere il fluido in ago microiniezione. Fate attenzione a non tutte le cellule.
4. Raccolta la eCSF per l'Analisi Composizione
- Una volta che il eCSF viene raccolta in dell'ago, accuratamente arrestare aspirazione dal CellTram.
- Momentove il piatto da sotto l'ago e accuratamente posizionare l'ago in una provetta contenente il tampone desiderato.
- Utilizzando il CellTram, drenare la eCSF fuori l'ago nel buffer cercando di evitare di contaminare la soluzione con olio.
- Al fine di rimuovere le cellule che si sono aspirati insieme, eCSF eCSF centrifuga a 10000 x g. Raccogliere incontaminata eCSF (surnatante) e conservare a -80 ° C fino al momento per ulteriori analisi.
5. Reintroduzione dei fattori selezionati
- Scolate la eCSF ogni 2 ore durante l'intervallo di tempo desiderato, dal momento che il fluido viene reintegrati entro tale periodo di tempo. Tra il drenaggio punti temporali, rimuovere l'ago e conservare gli embrioni a 28.5 ° C o la temperatura desiderata.
- Caricare secondo ago micropipetta con fattore di controllo.
- Inserire l'ago in micromanipolatore collegato microiniettore.
- Regolare il volume di iniezione a 1 nl misurando la dimensione della goccia in tempo di iniezione di olio e di regolazione e di pressione.
- Iniettare 1-2 nl in ventricoli cerebrali, come descritto in precedenza 26.
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Representative Results
Un esempio di un ventricolo cerebrale drenato viene mostrato nella Figura 1B-C. Ventricoli cerebrali sono crollate, poiché non hanno eCSF (Figura 1B vs C). Come visto in immagini dorsali (Figura 1B-C, e la Figura 2A-D) neuroepitelio romboencefalo fa mantenere la sua morfologia caratteristica e sembra essere aperta nonostante la mancanza di eCSF probabilmente dovuto robuste cerniera punti. Tuttavia, viste laterali (Figura 2A'-D ') dimostrano che il ventricolo romboencefalo è stato drenato, coerente con la presenza di un epitelio sottile e flessibile lamiera del tetto che crolla ventralmente. In embrioni di tipo selvatico, eCSF viene continuamente prodotta e riempie il cervello ventricoli 2-3 ore dopo lo scarico (Figura 2). Pertanto, CSF bisogno di essere continuamente impoverito nel tempo di interesse.
Mentre la rimozione del fluido a 24 hpf non perturbare morfologia lordo o sviluppo, la rimozione di eCSF su un più lungo per iod di sviluppo può avere effetti negativi per lo sviluppo del corpo intero. Ciò deve essere tenuto in considerazione per determinare l'efficacia di fattori iniettate nei ventricoli cerebrali. Inoltre, per determinare se i difetti dello sviluppo sono un risultato di perdita di eCSF oa causa di un ago puntura del cervello, un controllo importante è l'inserimento di un ago nel cervello senza rimuovere eCSF.
Abbiamo dimostrato che eCSF ha un diverso profilo di proteina estratto embrionale intero, e analisi su un gel SDS-PAGE proteina dimostra che una quantità rilevabile di proteine possono essere raccolti da zebrafish eCSF (Figura 3). Questo dimostra che neuroepiteliale contaminanti cellulari sono a livelli inferiori eCSF proteine specifiche, e inoltre che una notevole quantità di proteina può essere raccolto che sufficiente per l'analisi di spettrometria di massa.
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Figura 1. Ventricoli cerebrali manualmente drenati. (A) Il disegno sperimentale. Laterale (a sinistra) e dorsale (a destra) vede di dove inserire l'ago microiniezione. Dell'ago (triangolo nero) viene inserito nella piastra tetto del ventricolo romboencefalo nel punto più largo del romboencefalo. L'ago viene poi ulteriormente inserito nel mesencefalo e ventricoli del cervello anteriore, come indicato dalle frecce rosse. (BC) Esempi del 24 HPF manualmente drenato embrione. L'embrione stesso ripreso prima di scarico (B) o dopo di scarico (C). (B'-C ') Tracciati di BC. Linea grigia indica la morfologia presente ma non visibile. F = proencefalo, M = mesencefalo, H = rombencefalo. Barre di scala = 50 micron.
Figura 2. ECSF riempie i ventricoli del cervello nel corso del tempo. (A) 24 HPF embrione prima del drenaggio (B) immediatamente dopo t = 0 (C) 15, (D) 60, (E) 120, (F) 180, (G) 240, e (H) 300 min (m) dopo lo scarico. (AH) e dorsale (A'-H ') le immagini con campo chiaro laterali anteriore a sinistra. F = proencefalo, M = mesencefalo, H = rombencefalo. Barre di scala = 50 micron.
Proteine Figura 3. Profilo varia tra il 24 HPF zebrafish intero (WE) estratto (0,5 mg di proteine totali) e 24 HPF eCSF da 50 embrioni. SDS tampone di caricamento aggiunto raccolti eCSF a denaturare le proteine, esempio di esecuzione su un 8% Tris-HCl gel PAGE, e rilevato con Sypro Ruby. * Indicare fasce uniche eCSF.
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Discussion
L'uso di questa tecnica per drenare manualmente eCSF dai ventricoli cerebrali zebrafish sarà utile per determinare la necessità di eCSF durante lo sviluppo. Inoltre, questa tecnica consente descrizione del profilo proteico eCSF nel corso dello sviluppo embrionale. Identificazione di proteine differenti durante questo periodo consentirà ulteriori indagini sul funzionamento del CSF e il suo ruolo potenziale durante lo sviluppo del cervello. In amnioti, alcuni fattori di cui eCSF (IGF2, FGF2, acido retinoico, e apolipoproteine) hanno un ruolo dimostrato neuroepiteliale sopravvivenza cellulare, la proliferazione e la neurogenesi 13,17,20,23,27,28. Tuttavia, sembra che vi siano centinaia di proteine non caratterizzate in eCSF, che è stato ottenuto dopo la formazione dei plessi corioidei, oltre i punti temporali dimostrato qui. Inoltre, il nostro laboratorio e altri hanno identificato mutanti di zebrafish con dimensioni abnormi ventricolo cerebrale o difetti cerebrali 29-31, e può havanomalie posta nella composizione eCSF e funzione. Questo metodo permette facilmente per isolare e testare putative eCSF anormale da mutanti o in diverse condizioni ambientali.
Un uso efficace del sistema di zebrafish è quello di sostituire i fattori selezionati tramite iniezione nei ventricoli cerebrali dopo la rimozione di eCSF e testare la loro funzione durante lo sviluppo del cervello. Piccole molecole, proteine, e eCSF ottenuti dopo perturbazione genetica o chimici può essere testato. Reintroduzione eCSF da altre specie da consentire il confronto dei fattori e funzioni varie specie e in diverse condizioni patologiche, come idrocefalo, completano e interfacciamento con gli studi di mammifero. In sintesi, l'uso del zebrafish per rimuovere eCSF, analizzare la composizione e reintrodurre eCSF o fattori specifici nei ventricoli cerebrali, aumenteranno significativamente comprensione del ruolo e regolazione della funzione eCSF e quella del sistema ventricolare cerebrale.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute for Mental Health, e la National Science Foundation. Un ringraziamento particolare al Dr. Jen Gutzman, Dr. Amanda Dickinson e altri membri di laboratorio esclusivo per molte utili discussioni e critiche costruttive, e di Olivier Paugois per l'allevamento dei pesci di esperti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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