Summary
Apresenta-se um método para recolher fluido cerebrospinal (CSF) e para criar um sistema que não tem CSF dentro do sistema ventricular embrionário do peixe-zebra cérebro. Isto permite uma análise mais aprofundada de CSF composição e sua exigência durante o desenvolvimento do cérebro embrionário.
Abstract
Líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fluido rico em proteínas contidas dentro dos ventrículos do cérebro. Encontra-se presente durante o desenvolvimento embrionário precoce dos vertebrados e persiste durante toda a vida. Adulto CSF é pensado para amortecer o cérebro, remover resíduos, e proceder secretado 1,2 moléculas. No embrião de adultos e mais velhos, a maioria dos CSF é feita pelo plexo coróide, uma série de regiões altamente vascularizadas secretoras colocadas junto dos ventrículos do cérebro 3-5. No peixe-zebra, o plexo coróide está completamente formado a 144 horas pós-fertilização (hpf) 6. Antes disso, em embriões de vertebrados tanto peixe-zebra e outros, incluindo ratinho, uma quantidade significativa de embrionário CSF (eCSF) está presente. Estes dados e os estudos em pintainho sugerem que o neuroepitélio é secretória precoce no desenvolvimento e pode ser a fonte principal de eCSF antes do desenvolvimento do plexo coróide 7.
eCSF contém cerca de três vezes mais proteína than adulto CSF, sugerindo que pode desempenhar um papel importante durante o desenvolvimento 8,9. Os estudos realizados em pintos e de rato demonstram que os factores secretados no eCSF, a pressão do fluido, ou uma combinação destes, são importantes para a expressão do gene neurogenesis sobrevivência, a proliferação de células, e células, no neuroepitélio 10-20. Análises proteômicas de rato, humano, mouse e eCSF garota identificaram muitas proteínas que possam ser necessárias para a função LCR. Estes incluem componentes da matriz extracelular, apolipoproteínas, proteínas que regulam a pressão osmótica, e proteínas envolvidas na morte celular e proliferação 21-24. No entanto, as funções complexas do eCSF são largamente desconhecidos.
Desenvolvemos um método para a remoção de eCSF ventrículos cerebrais zebrafish, permitindo assim a identificação de componentes eCSF e para a análise do requisito eCSF durante o desenvolvimento. Embora mais eCSF podem ser coletadas de outros vertebrados sistemas wom embriões maiores, eCSF podem ser coletadas desde os primeiros estágios de desenvolvimento do peixe-zebra, e sob condições genéticas ou ambientais que levam ao volume anormal do cérebro ventrículo ou morfologia. Remoção e recolha de eCSF permite a análise de espectrometria de massa de inquérito, de função eCSF, e reintrodução de factores seleccionados para os ventrículos para ensaiar a sua função. Assim, a acessibilidade do embrião do peixe-zebra precoce permite a análise detalhada da função eCSF durante o desenvolvimento.
Protocol
1. Preparando agulhas microinjeção e Bonde celular
- Encha Eppendorf CellTram óleo aparelho microinjector com óleo mineral de acordo com as instruções do fabricante.
- Prepare agulhas microinjeção puxando tubos capilares utilizando Sutter extrator agulha instrumentos.
- Montar a agulha na micromanipulador Eppendorf CellTram conectado.
- Parta cuidadosamente a ponta da agulha. Para tamanho da ponta uniforme, medir com um micrômetro, ou comparar a uma agulha de referência.
- Encher o comprimento da agulha com óleo, usando o CellTram para empurrar para baixo o comprimento de petróleo, tendo o cuidado para evitar as bolhas.
2. Preparando os embriões
- Criar buracos em uma placa de agarose a 1%, revestida com uma ponta de pipeta de 1-200 uL, e remover tampões de agarose. Preencha prato com media de embriões (feita de acordo com Westerfield 25).
- Utilizando uma pinça, embriões dechorionate sob estereomicroscópio.
- Transferência de embriões dechorionatedem agarose prato revestido.
- Para anestesiar os embriões, adicionar tricaina (0,1 mg / ml) ao prato de agarose até embriões parar de se mover (feito de acordo com Westerfield 25).
3. Drenagem do eCSF
- Orientar os embriões com as caudas dos orifícios da agarose e os seus lados posteriores mais próximos do micromanipulador, permitindo a visualização do lado dorsal do cérebro.
- Posicionar a agulha no rhombomere 0/1 dobradiça-ponto ou ponto mais largo do cérebro posterior esquerdo (Figura 1A).
- Cuidadosamente placa telhado perfurar do ventrículo rombencéfalo tendo a certeza de não passar a profundidade do cérebro para a gema.
- Drenar o eCSF usando o CellTram e recolher fluido na agulha de microinjecção. Tenha cuidado para evitar quaisquer células.
4. Coletar a eCSF para análise de composição
- Uma vez que o eCSF é recolhida na agulha, cuidadosamente parar de aspiração do CellTram.
- Move o prato para fora sob a agulha e posicionar a agulha com cuidado para um tubo que contém o tampão desejado.
- Usando o CellTram, drenar o eCSF para fora da agulha para o buffer de tentar evitar a contaminação da solução com óleo.
- A fim de eliminar as células que tenham aspirado juntamente com o, eCSF rotação eCSF a 10.000 x g. Colete contaminada eCSF (sobrenadante) e armazenar a -80 ° C até estar pronto para análise posterior.
5. Reintrodução de fatores selecionados
- Drenar o eCSF cada 2 horas durante o intervalo de tempo desejado, uma vez que o líquido é alimentado dentro desse período de tempo. Entre os pontos de tempo de drenagem, retire a agulha e armazenar os embriões a 28,5 ° C ou a temperatura desejada.
- Carregar agulha micropipeta segundo com factor de teste.
- Agulha lugar em micromanipulador ligado a microinjetor.
- Ajustar o volume de injecção de 1 nl medindo o tamanho da gota de óleo e ajustamento do tempo de injecção e pressure.
- Injetar 1-2 NL em ventrículos cerebrais, como descrito anteriormente 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um exemplo de um ventrículo cerebral drenado é mostrado na Figura 1B, C-. Ventrículos cerebrais são recolhidos como falta eCSF (Figura 1B vs C). Como se vê nas imagens dorsal (Figura 1B-C, e A Figura 2A-D) do neuroepitélio rombencéfalo retém a sua morfologia característica e parece ser aberta, apesar da falta de eCSF provavelmente devido à robustas dobradiças-pontos. No entanto, vistas laterais (Figura 2A'-D ") demonstram que o ventrículo rombencéfalo foi drenada, consistente com a presença de um epitélio placa flexível telhado fino que colapsa ventralmente. Em embriões de tipo selvagem, eCSF é produzido continuamente e reenche o cérebro ventrículos 2-3 hr pós-escoamento (Figura 2). Portanto, CSF deve ser continuamente descarregada ao longo do tempo de interesse.
Embora a remoção do fluido em 24 hpf não interrompe a morfologia grosseira ou de desenvolvimento, a remoção de eCSF durante um longo per iod de desenvolvimento pode ter efeitos adversos para o desenvolvimento de todo o corpo. Isto deve ser tomado em consideração na determinação da eficácia de factores injectados nos ventrículos cerebrais. Além disso, para determinar se os defeitos de desenvolvimento são um resultado da perda de eCSF ou devido a uma agulha de punção do cérebro, é importante um controlo de inserção de uma agulha no interior do cérebro, sem retirar eCSF.
Nós demonstramos que eCSF tem um perfil de proteína diferente que o extracto de embrião inteiro, e análise de proteínas em gel de SDS-PAGE mostra que uma quantidade detectável da proteína pode ser recolhida a partir do peixe-zebra eCSF (Figura 3). Isto demonstra que neuroepiteliais contaminantes celulares estão em níveis mais baixos do que as proteínas eCSF específicos, e, ainda, que uma quantidade substancial de proteína que pode ser recolhida é suficiente para a análise de espectrometria de massa.
3/4243fig1.jpg "/>
Figura 1. Ventrículos cerebrais manualmente drenados. (A) O delineamento experimental. Lateral (esquerda) e dorsal (direita) vê de onde inserir a agulha microinjeção. Agulha (triângulo preto) é inserido na placa de cobertura do ventrículo rombencéfalo no ponto mais largo do cérebro posterior. A agulha é então posteriormente inserido no mesencéfalo e os ventrículos do cérebro anterior, designadas pelas setas vermelhas. (BC) Exemplos de 24 hpf drenado manualmente embrião. O embrião mesma fotografada antes da drenagem (B) ou depois da descarga (C). (B'-C ') Traçados do BC. Linha cinza indica morfologia presente mas não visível. F = prosencéfalo, M = mesencéfalo, H = rombencéfalo. Barra de escala = 50 um.
Figura 2. ECSF recargas ventrículos cerebrais ao longo do tempo. (A) embrião hpf 24 antes de drenagem (B) imediatamente após t = 0 (C), 15 (D) 60, (E) 120, (F) 180, (G) 240, e (H) 300 min (m) após a drenagem. (AH) e dorsal (A'-H '), as imagens de campo claro com laterais anterior para a esquerda. F = prosencéfalo, M = mesencéfalo, H = rombencéfalo. Barra de escala = 50 um.
Figura 3. Perfil de proteínas difere entre os 24 embriões de peixe zebra hpf inteiro (WE) extracto (0,5 ug de proteína total) e 24 hpf eCSF a partir de 50 embriões. SDS tampão de carga adicionada à eCSF recolhidos para desnaturar as proteínas, são executados em amostras de um gel de PAGE 8% de Tris-HCl, e detectado com Sypro Ruby. * Indicar bandas únicas para eCSF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A utilização desta técnica para drenar manualmente eCSF de ventrículos cerebrais zebrafish será útil para a determinação da exigência de eCSF durante o desenvolvimento. Além disso, esta técnica permite a descrição do perfil proteico eCSF ao longo do desenvolvimento embrionário. Identificação de proteínas diferentes durante este tempo irá permitir uma investigação mais aprofundada sobre a função do LCR e o seu papel potencial durante o desenvolvimento do cérebro. No amniotas, alguns factores identificados no eCSF (IGF2, FGF2, ácido retinóico, e apolipoproteínas) têm demonstrado um papel na proliferação de células neuroepiteliais de sobrevivência, e a neurogénese 13,17,20,23,27,28. No entanto, parece haver centenas de proteínas descaracterizados no eCSF, que foi obtida após a formação do plexo coróide, mais tarde do que o tempo de pontos demonstrado aqui. Além disso, nosso laboratório e outros identificaram mutantes peixe-zebra com tamanho anormal do cérebro ventrículo ou defeitos no cérebro 29-31, e pode havanormalidades E em eCSF composição e função. Este método permite prontamente para o isolamento e teste de eCSF anormal putativo a partir de mutantes ou em diferentes condições ambientais.
A utilização eficaz do sistema de peixe-zebra consiste em substituir factores seleccionados através de injecção nos ventrículos cerebrais após a remoção do eCSF, assim, testar a sua função durante o desenvolvimento do cérebro. As moléculas pequenas, proteínas, e eCSF obtidos após a perturbação genética ou química podem ser testados. Reintrodução de eCSF de outras espécies vai permitir a comparação de fatores e funções em todas as espécies e sob diferentes condições patológicas, tais como hidrocefalia, complementando e interface com os estudos de mamíferos. Em resumo, a utilização do peixe-zebra para remover eCSF, analisar a sua composição e reintroduzir eCSF ou factores específicos nos ventrículos cerebrais, irá aumentar significativamente a compreensão da função e regulação da função eCSF ea do sistema ventricular do cérebro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional para a Saúde Mental, e da National Science Foundation. Um agradecimento especial ao Dr. Jen Gutzman, Amanda Dr. Dickinson e outros membros do laboratório SIVE para muitas discussões úteis e críticas construtivas, e Olivier Paugois para criação de peixes especialista.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
- Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience. 129, 957-970 (2004).
- Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
- Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
- Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish. PLoS One. 3, e3090 (2008).
- Welss, P. Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture. The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).
- Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).
- Zheng, W., Chodobski, A. The blood-cerebrospinal fluid barrier. , Taylor and Francis. Boca Raton, Fl. (2005).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Parada, C., et al. Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression. J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).
- Mashayekhi, F., Salehi, Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).
- Martin, C., et al. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).
- Martin, C., et al. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Gato, A., et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).
- Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development. Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).
- Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development. Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2 (2006).
- Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats. Eur. J. Pediatr. Surg. 11, Suppl 1. S57-S59 (2001).
- Lehtinen, M. K., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Zappaterra, M. D., et al. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).
- Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development. Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).
- Gato, A., et al. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development. Neuroreport. 19, 945-950 (2008).
- Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation. J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).
- Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
