Summary
Wir präsentieren eine Methode zur Liquor (CSF) zu sammeln und ein System, das CSF fehlt im embryonalen Zebrafischgehirn ventrikuläre System zu erstellen. Dies ermöglicht eine weitere Untersuchung der CSF Zusammensetzung und seine Forderung während der embryonalen Entwicklung des Gehirns.
Abstract
Liquor (CSF) ist ein Protein reiche Flüssigkeit innerhalb der Ventrikel im Gehirn enthalten. Es ist während der frühen Wirbeltiere Embryonalentwicklung vorhanden und bleibt während des gesamten Lebens. Adult CSF wird angenommen, dass das Gehirn dämpfen, entfernen Abfallprodukte und tragen sezernierte Moleküle 1,2. Beim Erwachsenen und älteren Embryo, wird die Mehrheit der CSF durch den Plexus choroideus, eine Reihe von stark vaskularisierten sekretorischen Bereiche benachbart angeordnet, um den Hirnkammern 3-5 hergestellt. Im Zebrafisch wird der Plexus komplett bei 144 Stunden nach der Befruchtung (hpf) 6 gebildet. Zuvor sowohl Zebrafisch und andere Wirbeltierembryonen einschließlich Maus, eine signifikante Menge an embryonalen CSF (ECSF) vorhanden ist. Diese Daten und Studien chick vermuten, dass die Neuroepithel sekretorischen früh in der Entwicklung ist, und kann die Hauptquelle der ECSF vor Plexus Entwicklung 7 sein.
ECSF enthält etwa dreimal mehr Protein than Erwachsenen CSF, was darauf hindeutet, dass es eine wichtige Rolle bei der Entwicklung 8,9 haben. Studien bei Huhn und Maus demonstrieren, dass sekretierten Faktoren im ECSF, Fluiddruck oder eine Kombination von diesen, die wichtig sind für die Neurogenese, Genexpression, Zellproliferation und Zellüberleben im Neuroepithel 10-20. Proteomik Analysen von Mensch, Ratte, Maus und chick ECSF haben viele Proteine, die notwendig sein CSF-Funktion identifiziert. Dazu gehören Komponenten der extrazellulären Matrix, Apolipoproteine, den osmotischen Druck regulierende Proteine und Proteine in Zelltod und Proliferation 21-24 beteiligt. Jedoch sind die komplexen Funktionen des ECSF weitgehend unbekannt.
Wir haben ein Verfahren zum Entfernen von Zebrafisch ECSF Hirnkammern entwickelt, so dass für die Identifizierung des ECSF Komponenten und zur Analyse der ECSF Anforderung während der Entwicklung. Obwohl mehr ECSF aus anderen Wirbeltieren Systeme w gesammelt werdenith größeren Embryonen können ECSF von den frühesten Stadien der Zebrabärblingentwicklung gesammelt werden, und unter genetischen oder Umgebungsbedingungen, die zu abnormen Hirnventrikel Volumen oder Morphologie führen. Entfernen und Sammeln von ECSF ermöglicht für die massenspektrometrische Analyse, Ermittlung von ECSF Funktion, und die Wiedereinführung der ausgewählten Faktoren in die Ventrikel zu Assay ihre Funktion. So ist die Erreichbarkeit des frühen Zebrafischembryo ermöglicht eine detaillierte Analyse der ECSF Funktion während der Entwicklung.
Protocol
Ein. Vorbereiten Mikroinjektion Needles and Cell Tram
- Füllen Eppendorf CellTram Öl Mikroinjektor Apparat mit Mineralöl nach den Anweisungen des Herstellers.
- Bereiten Mikroinjektion Nadeln durch Ziehen Kapillarrohre mit Sutter Instrumente Nadel abziehen.
- Montieren Nadel auf Mikromanipulator an Eppendorf CellTram.
- Vorsichtig brechen die Spitze der Nadel. Für eine gleichmäßige Größe der Spitze, mit einem Mikrometer messen oder vergleichen, um eine Referenz Nadel.
- Füllen Sie die Länge der Nadel mit Öl, mit dem CellTram Öl über die gesamte Länge zu schieben, dabei darauf achten, keine Blasen zu vermeiden.
2. Vorbereitung der Embryonen
- Stoßen Löcher in einem 1% Agarose-beschichteten Schale mit einem 1-200 ul Pipettenspitze und entfernen Agarose Steckern. Füllen Schale mit Embryo Medien (hergestellt nach Westerfield 25).
- Mit Pinzette dechorionate Embryonen unter Stereomikroskop.
- Übertragen dechorionated Embryonenin Agarose-beschichteten Gericht.
- Embryonen zu betäuben, fügen Tricaine (0,1 mg / ml) an Agarose Antenne, bis Embryonen bewegten Anschlag (hergestellt nach Westerfield 25).
3. Entleeren des ECSF
- Orient die Embryonen mit ihren Endstücken in den Löchern der Agarose und ihre hinteren Seiten am nächsten zu dem Mikromanipulator, so dass für die Visualisierung der dorsalen Seite des Gehirns.
- Positionieren Sie die Nadel am Rhombomer 0/1 Scharnier-Punkt oder der breitesten Stelle Hinterhirn Ventrikel (Abbildung 1A).
- Sorgfältig durchbohren Dachblech Rautenhirn Ventrikel sicher zu sein, um nicht durch die Tiefe des Gehirns in dem Eigelb zu gehen.
- Lassen Sie das ECSF mit dem CellTram sammeln und Flüssigkeit in Mikroinjektionsnadel. Seien Sie vorsichtig, um alle Zellen zu vermeiden.
4. Das Sammeln der ECSF für Composition Analysis
- Sobald die ECSF in der Nadel gesammelt wird, zu stoppen sorgfältig Absaugung aus dem CellTram.
- Move die Schale aus unter der Nadel und die Nadel genau positionieren zu einem Schlauch mit dem gewünschten Puffer.
- Mit dem CellTram, lassen Sie das ECSF aus der Nadel in den Puffer zu vermeiden versucht Verunreinigung der Lösung mit Öl.
- Um Zellen, die Sie haben zusammen mit dem ECSF, Spin ECSF bei 10.000 x g abgesaugt entfernen. Unberührten ECSF (Überstand) und bei -80 ° C bis zur weiteren Analyse zu sammeln.
5. Wiedereinführung der ausgewählten Faktoren
- Lassen Sie das ECSF alle 2 Stunden während der gewünschte Zeitintervall, da die Flüssigkeit in diesem Zeitraum wieder aufgefüllt wird. Zwischen Entwässerungszeit-Punkte, entfernen Sie die Nadel und bewahren die Embryonen bei 28,5 ° C oder Temperatur gewünscht wird.
- Legen zweiten Mikropipette Nadel mit Test-Faktor.
- Ort Nadel in den Mikromanipulator Mikroinjektorkopfs befestigt.
- Passen Injektionsvolumen bis 1 nl durch Messung der Tropfengröße in Öl und Einstellen Einspritzzeit und pressure.
- Inject 1-2 nl in Hirnkammern wie zuvor beschrieben 26.
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Representative Results
Ein Beispiel eines durchlässigen Hirnventrikel ist in 1B-C gezeigt. Hirnkammern sind zusammengebrochen, als sie ECSF (Abbildung 1B vs C) fehlt. Wie in dorsalen Bilder (1B-C und 2A-D) die Hinterhirn Neuroepithel macht behalten ihre charakteristische Morphologie und scheint trotz fehlender ECSF wahrscheinlich durch robuste Scharnier-Punkte offen gesehen. Allerdings zeigen Seitenansichten (Abbildung 2A'-D '), dass die Hinterhirn Ventrikel entleert wurde, im Einklang mit der Anwesenheit von einem dünnen, flexiblen Dachblech Epithel, ventral zusammenbricht. In Wildtyp-Embryonen wird ECSF kontinuierlich produziert und füllt die Ventrikel im Gehirn 2-3 Stunden nach Entleerung (Abbildung 2). Daher muss CSF, kontinuierlich über die Zeit von Interesse abgereichert werden.
Während Entfernen der Flüssigkeit bei 24 hpf nicht stört grobe Morphologie oder Entwicklung, die Entfernung von ECSF pro über einen längeren iod der Entwicklung möglicherweise nachteilige Auswirkungen auf ganze Körper Entwicklung. Dies sollte berücksichtigt werden bei der Bestimmung der Wirksamkeit von Faktoren in die Hirnkammern injiziert. Ferner, um zu bestimmen, ob Entwicklungsdefekten ein Ergebnis des Verlustes der ECSF oder aufgrund einer Nadel Punktieren des Gehirns befinden, ist eine wichtige Kontrolle Einführen einer Nadel in das Gehirn, ohne ECSF.
Wir zeigten, dass ECSF ein anderes Protein Profil als Ganzes Embryonalextrakt und Analyse weist auf einem SDS-PAGE Proteingel zeigt, daß eine nachweisbare Menge an Protein aus Zebrafisch ECSF (Abbildung 3) gesammelt werden können. Dies zeigt, dass neuroepithelialen zellulären Verunreinigungen sind in geringeren Mengen als ECSF spezifischer Proteine, und ferner, dass eine wesentliche Menge an Protein gesammelt werden kann, die ausreichend ist für die Massenspektrometrie-Analyse.
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Abbildung 1. Manuell entleert Hirnkammern. (A) Experimentelles Design. Lateral (links) und dorsal (rechts) sieht, wo die Mikroinjektionsnadel einzufügen. Needle (schwarzes Dreieck) in der Dachplatte des Rautenhirns Ventrikels an der breitesten Stelle des Rautenhirns eingefügt. Die Nadel wird dann weiter in das Mittelhirn und Vorderhirn Ventrikel wie von den roten Pfeilen bezeichnet eingefügt. (BC) Beispiele von 24 hpf manuell Embryos entwässert. Dasselbe Embryo vor dem Ablassen (B) oder nach dem Drain (C) abgebildet. (B'-C ') Tracings von BC. Grau Linie zeigt Morphologie vorhanden, aber nicht sichtbar. F = Vorderhirn, M = Mittelhirn, H = Hinterhirn. Maßstabsbalken = 50 um.
Abbildung 2. ECSF füllt die Ventrikel im Gehirn im Laufe der Zeit. (A) 24 hpf Embryo vor dem Ablassen (B) unmittelbar nach t = 0 (C) 15, (D) 60, (E) 120, (F) 180, (G) 240, und (H) 300 min (m) nach dem Ablassen. (AH) Dorsal und (A'-H ') laterale Hellfeld Bilder mit anterior der linken Seite. F = Vorderhirn, M = Mittelhirn, H = Hinterhirn. Maßstabsbalken = 50 um.
Abbildung 3. Protein Profil unterscheidet sich zwischen 24 hpf ganzen Zebrafisch-Embryos (WE) Extrakt (0,5 ug Gesamtprotein) und 24 hpf ECSF von 50 Embryonen. SDS-Ladepuffer zugesetzt gesammelt ECSF an Proteine, Probe auf einem 8% Tris-HCl-PAGE-Gel laufen gelassen denaturieren, und detektiert mit Sypro Ruby. * Zeigen Bands einzigartig ECSF.
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Discussion
Die Verwendung dieser Technik, um manuell ablaufen ECSF vom Zebrafisch Hirnkammern nützlich sein wird für die Bestimmung der Voraussetzung für ECSF während der Entwicklung. Darüber hinaus wird diese Technik Beschreibung des ECSF Proteinprofil Laufe der Embryonalentwicklung ermöglichen. Identifizierung verschiedener Proteine während dieser Zeit ermöglicht genauere Ermittlung der Funktion des CSF und seine potenzielle Rolle während der Entwicklung des Gehirns. In Amnioten haben einige Faktoren ECSF (IGF2, FGF2, Retinsäure, und Apolipoproteine) identifiziert eine nachgewiesene Rolle neuroepithelialen Zellüberleben, Proliferation und Neurogenese 13,17,20,23,27,28. Jedoch scheint es hunderte von Proteinen in der uncharakterisierten ECSF, die nach Bildung des Plexus choroideus erhalten wurde, später als die Zeitpunkte hier gezeigt sein. Darüber hinaus haben unser Labor und andere Zebrafisch-Mutanten mit abnormen Hirnventrikel Größe oder Gehirn Defekte 29-31, und kann hav identifizierte Anomalien in ECSF Zusammensetzung und Funktion. Diese Methode ermöglicht sehr einfach zu isolieren und zu testen mutmaßlichen abnormen ECSF von Mutanten oder unter verschiedenen Umweltbedingungen.
Eine leistungsstarke Verwendung des Systems ist es, Zebrafisch ausgewählten Faktoren über Injektion in die Hirnkammern ersetzen nach Entfernen ECSF, wodurch Testen ihrer Funktion während der Entwicklung des Gehirns. Kleine Moleküle, Proteine und ECSF nach genetische oder chemische Störung erhalten kann getestet werden. Wiedereinführung ECSF aus anderen Spezies ermöglicht Vergleich der Faktoren und Funktionen über Arten und unter verschiedenen pathologischen Bedingungen, wie Wasserkopf, Ergänzung und einer Schnittstelle mit Säuger-Studien. Zusammenfassend des Zebrafisches zu verwenden, um ECSF entfernen, analysieren die Zusammensetzung und Wiedereinführung ECSF oder spezielle Faktoren in die Ventrikel des Gehirns, deutlich erhöhen Verständnis der Rolle und Regulierung der ECSF Funktion und die des Gehirns Ventrikelsystem.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Institute for Mental Health und der National Science Foundation unterstützt. Besonderer Dank geht an Dr. Jen Gutzman, Dr. Amanda Dickinson und anderen Sive lab Mitglieder für viele hilfreiche Diskussionen und konstruktive Kritik, und Olivier Paugois für Experten Fische Tierhaltung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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