Summary
אנו מציגים שיטה לאיסוף נוזל שדרה (CSF) וליצור מערכת שאין בה CSF בתוך מערכת חדרית מוח דג הזברה העוברית. זה מאפשר לבדיקה נוספת של רכב CSF והדרישה שלה במהלך התפתחות מוח העוברית.
Abstract
נוזל השדרתי (CSF) הוא נוזל עשיר חלבון מכיל בתוך החדרים במוח. היא נמצאת במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת חוליות ונמשכת לאורך כל חיים. מבוגרי CSF הוא חשב לרפד את המוח, להסיר פסולת, ולשאת 1,2 מולקולות מופרשות. במבוגרים ומבוגרים העובר, רוב CSF נעשה על ידי דמה עין המקלעת, סדרה של אזורי הפרשת כלי דם מאוד ממוקמים סמוך למוח החללים 3-5. בדג הזברה, דמה עין המקלעת נוצרה במלואו בשעות שלאחר ההפריה 144 (hpf) 6. לפני זה, בעוברי החולייתנים הוא דג זברה ואחרים, כוללים עכבר, כמות משמעותית של עוברי CSF (eCSF) הוא הווה. נתונים אלה ומחקרים מראים כי בחומוס neuroepithelium היא הפרשה מוקדם בפיתוח ועלולה להיות המקור העיקרי של eCSF לפני דמה עין המקלעת 7 פיתוח.
eCSF מכיל בערך פי שלושה לא יותר חלבוןהאן המבוגר CSF, המצביע על כך שזה יכול להיות תפקיד חשוב במהלך הפיתוח 8,9. מחקרים באפרוח ועכבר להוכיח כי גורמים מופרשים בeCSF, לחץ נוזל, או שילוב של אלה, הם חשובים לנוירוגנזה, ביטוי גנים, שגשוג תאים, ותא ההישרדות בneuroepithelium 10-20. מנתח proteomic של, עכברוש אדם, עכבר, ואפרוח eCSF זיהה חלבונים רבים שעשויה להיות נחוץ לתפקוד CSF. אלה כוללים מרכיבים תאיים מטריצה, apolipoproteins, חלבוני ויסות לחץ האוסמוטי, וחלבונים מעורבים במוות של תאים והתרבות 21-24. עם זאת, הפונקציות המורכבות של eCSF אינן ידועות.
אנחנו פתחנו שיטה להסרת eCSF מחדרים במוח דג זברה, ובכך מאפשרים לזיהוי של רכיבי eCSF ולניתוח של דרישת eCSF במהלך פיתוח. למרות שיותר eCSF ניתן לאסוף מחוליות w מערכות האחרותעוברי ith גדולים, eCSF ניתן לאסוף מהשלבים המוקדמים של פיתוח דג זברה, ובתנאים גנטיים או סביבתיים המובילים למוח נורמלי נפח חלל או במורפולוגיה. הסרה ואוסף של eCSF מאפשרות ניתוח, חקירה המונית spectrometric תפקוד eCSF, וחידוש של גורמים נבחרים לתוך חדרי הלב לבדיקת תפקודם. לכן הנגישות של עובר דג הזברה מוקדם מאפשרת ניתוח מפורט של פונקצית eCSF במהלך פיתוח.
Protocol
1. הכנת מחטי microinjection וחשמלי ניידים
- מלא מנגנון אפנדורף CellTram שמן microinjector עם שמן מינרלים על פי הוראות היצרן.
- הכן את מחטי microinjection ידי משייכת צינורות נימים באמצעות חולץ מחט מכשירי סאטר.
- הר מחט על micromanipulator מחובר לאפנדורף CellTram.
- זהירות לשבור את קצה המחט. לגודל קצה אחיד, למדוד עם מיקרומטר, או להשוות למחט הפניה.
- מלא את אורך המחט עם שמן, שימוש CellTram לדחוף שמן לאורך, להיות זהיר, כדי למנוע בועות.
2. הכנת העוברים
- חורים ב1% מנה מצופית agarose עם קצה פיפטה 1-200 μl, ולהסיר תקעי agarose. מלא צלחת עם תקשורת עובר (נעשה על פי 25 Westerfield).
- שימוש במלקחי עוברים, dechorionate תחת stereomicroscope.
- העברת עוברי dechorionatedלמנה מצופית agarose.
- להרדים עוברים, להוסיף Tricaine (0.1 מ"ג / מ"ל) למנת agarose עד עוברים מפסיקים לנוע (שנעשה על פי 25 Westerfield).
3. ניקוז eCSF
- אוריינט את העוברים בעלי הזנבות באת החורים של agarose והצדדים האחוריים שלהם הקרובים לmicromanipulator, ומאפשר הדמיה של הצד הגבי של המוח.
- מקם את המחט בrhombomere 0/1 ציר נקודה או נקודה הרחבה ביותר של מוח אחורי חדר לב (איור 1 א).
- זהירות צלחת גג לנקב של חלל המוח האחורי להיות בטוח שלא לעבור את העומק של המוח לחלמון.
- מסנן את eCSF באמצעות CellTram ולאסוף נוזלים במחט microinjection. להיות זהיר, כדי למנוע את כל תאים.
4. איסוף eCSF לניתוח רכב
- ברגע eCSF נאסף במחט, להפסיק יניקה מCellTram זהירות.
- מוve הצלחת מתחת למחט ולמקם את המחט בזהירות לתוך מבחנה המכילה את המאגר הרצוי.
- שימוש CellTram, לנקז eCSF מתוך המחט לחיץ מנסה להימנע מלזהם את הפתרון בשמן.
- על מנת להסיר את התאים שיש לך ונשאף יחד עם eCSF, ספין eCSF ב -10,000 x גרם. איסוף מזוהם eCSF (supernatant) ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן לניתוח נוסף.
5. חידוש של גורמים נבחרים
- מסנן את eCSF כל 2 שעות בפרק זמן רצוי, שכן הנוזל מתחדש בתוך תקופת זמן זו. בין ניקוז בזמן נקודות, הסר את המחט ולאחסן את העוברים ב28.5 מעלות צלזיוס או רצוי טמפרטורה.
- טען מחט micropipette שנייה עם גורם מבחן.
- מחט למקום micromanipulator מצורפת microinjector.
- כיוון עוצמת זריקה עד 1 nl על ידי מדידת גודל הטיפה בזמן שמן והכוון הזרקה ו-pressure.
- להזריק 1-2 nl לחדרים במוח כפי שתוארו קודם לכן 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמה לחדר לב מוח מרוקן מוצגת באיור 1 ב-C. חדרים במוח הם התמוטטו כהם חסרים eCSF (האיור 1B לעומת C). כפי שניתן לראות בתמונות גב (איור 1B-C, ואיור 2A-D) neuroepithelium המוח האחורי עושה לשמור מורפולוגיה האופיינית ונראה שהוא פתוח למרות חוסר eCSF הנראה בשל נקודתי צירים חזקות. עם זאת, נופים רוחביים (איור 2A'-D ') מראים כי את חדר המוח האחורי כבר סחוטים, עולים בקנה אחד עם הנוכחות של אפיתל דק וגמיש גג צלחת שקורסת ventrally. בעוברים מסוג פרא, eCSF מיוצר ברציפות, ממלאת את חדרי לב מוח פוסט 2-3 שעתי ניקוז (איור 2). לכן, CSF צריך להיות מרוקן ללא הרף על הזמן של עניין.
בעוד הסרת הנוזל ב24 hpf לא תשבש את מורפולוגיה ברוטו או פיתוח, הסרת eCSF מעל לעוד iod של פיתוח עשויה להיות השפעה שלילית על ההתפתחות של כל גוף. זה צריך להילקח בחשבון בעת קביעת היעילות של גורמים אשר הוזרקו לתוך החדרים במוח. יתר על כן, כדי לקבוע אם ליקויים התפתחותיים הם תוצאה של אובדן eCSF או בשל מחט מנקבת את המוח, שליטה חשובה היא החדרת מחט לתוך המוח מבלי להסיר eCSF.
אנחנו הוכחנו שיש לו פרופיל eCSF שונה חלבון מאשר תמצית עובר כולו, וניתוח על ג'ל החלבון SDS-PAGE מוכיח כי כמות זיהוי של חלבון ניתן לאסוף מדג הזברה eCSF (איור 3). זה מוכיח כי מזהמים סלולריים neuroepithelial נמצאים ברמות נמוכות יותר מאשר חלבונים ספציפיים eCSF, ועוד, כי כמות משמעותית של חלבון ניתן לאסוף זה מספיק לניתוח ספקטרומטריית מסות.
3/4243fig1.jpg "/>
איור 1. חדרים במוח נוקז ידני. () עיצוב ניסיוני. לרוחב (משמאל) וגב (מימין) רואה משם כדי להכניס מחט microinjection. מחט (משולש שחור) מוכנסת לתוך צלחת הגג של חדר המוח האחורי בנקודה הרחבה ביותר של המוח האחורי. אז המחט המוחדרת עמוקה יותר אל תוך המוח התיכון ואת חדרי מוח קדמי כפי שיועד על ידי החצים האדומים. (BC) דוגמאות של 24 hpf מנוקזות עובר באופן ידני. אותו העובר צלם לפני הניקוז (B) או לאחר ניקוז (C). העתקים (B'-C ') של BC. קו אפור מציין מורפולוגיה קיים אך לא נראה לעין. F = מוח קדמי, מ = מוח תיכון, H = מוח אחורי. ברי קנה מידה = 50 מיקרומטר.
איור 2. ECSF ממלא את החדרים במוח לאורך זמן. (א) העובר 24 hpf לפני הניקוז (ב ') מייד לאחר t = 0 (ג) 15, (ד) 60, (E) 120, (F) 180, (G) 240, ו( H) 300 דקות (מ ') לאחר הניקוז. הגבה (AH) ו( A'-H ') תמונות brightfield רוחביות עם קדמי בצד השמאל. F = מוח קדמי, מ = מוח תיכון, H = מוח אחורי. ברי קנה מידה = 50 מיקרומטר.
איור 3. פרופיל חלבון משתנה בין עובר 24 hpf כל דג זברה (אנחנו) תמצית (חלבון 0.5 מיקרוגרם סך הכל) וhpf eCSF 24 מ 50 עוברים. חיץ טעינת SDS הוסיף לeCSF נאסף ללפגל חלבונים, לדוגמה לרוץ על 8% ג'ל עמוד טריס-HCl, ומזוהה עם Sypro רובי. * מצביע על להקות ייחודיות לeCSF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש בטכניקה זו באופן ידני לניקוז eCSF מחדרים במוח דג זברה יהיה שימושי לקביעת הדרישה לeCSF במהלך פיתוח. בנוסף, טכניקה זו תאפשר תיאור של פרופיל חלבון eCSF במהלך התפתחות עוברית. זיהוי של חלבונים שונים בתקופה זו יאפשר חקירה נוספת לפונקציה של CSF והתפקיד הפוטנציאלי שלה במהלך התפתחות מוח. בamniotes, כמה גורמים שזוהו בeCSF (IGF2, FGF2, חומצה רטינואית, וapolipoproteins) יש תפקיד הפגין בהישרדות תא, התפשטות neuroepithelial וneurogenesis 13,17,20,23,27,28. עם זאת, נראה שיש מאה חלבוני uncharacterized בeCSF, שהושג לאחר היווצרות מקלעת דמה עין, מאוחר יותר מן זמן הנקודות הפגינו כאן. בנוסף, המעבדה ועוד זיהו מוטציות דג זברה עם גודל נורמלי מוח חדר לב או מומים במוח 29-31, והוא רשאי havהפרעות אלקטרוניות בהרכב ותפקוד eCSF. שיטה זו מאפשרת בקלות לבידוד ובדיקת eCSF הנורמלי משוער ממוטציות או בתנאים סביבתיים שונים.
שימוש רב עצמה של מערכת דג הזברה הוא להחליף גורמים נבחרים באמצעות הזרקה לתוך החדרים במוח לאחר הסרת eCSF, ובכך לבחון את תפקידם במהלך התפתחות מוח. מולקולות קטנות, חלבונים וeCSF הושגו לאחר הפרעות גנטיות או כימיות ניתן לבדוק. חידוש של eCSF ממינים אחרים יאפשר השוואה של גורמים ופונקציות ברחבי מינים ובתנאים שונים פתולוגיים, כגון הידרוצפלוס, משלימים והתממשקות עם מחקרי יונקים. לסיכום, שימוש בדג הזברה להסיר eCSF, לנתח את הרכבו ולהחזיר eCSF או גורמים ספציפיים לחדרים במוח, יגדיל באופן משמעותי הבנת התפקיד והרגולציה של תפקוד eCSF וזה של מערכת חדרית המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות נפש, והקרן הלאומית למדע. תודה מיוחדת לד"ר ג'ן Gutzman, ד"ר אמנדה דיקינסון וחברי מעבדת סייב אחרות לדיונים שימושיים רבים וביקורת בונה, ואוליבייה Paugois לגידול בעלי דגי מומחה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: from development to aging. Curr. Top. Dev. Biol. 71, 1-52 (2005).
- Brown, P. D., Davies, S. L., Speake, T., Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience. 129, 957-970 (2004).
- Praetorius, J. Water and solute secretion by the choroid plexus. Pflugers Arch. 454, 1-18 (2007).
- Speake, T., Whitwell, C., Kajita, H., Majid, A., Brown, P. D. Mechanisms of CSF secretion by the choroid plexus. Microsc. Res. Tech. 52, 49-59 (2001).
- Garcia-Lecea, M., Kondrychyn, I., Fong, S. H., Ye, Z. R., Korzh, V. In vivo analysis of choroid plexus morphogenesis in zebrafish. PLoS One. 3, e3090 (2008).
- Welss, P. Secretory activity of the inner layer of the embryonic mid-brain of the chick, as revealed by tissue culture. The Anatomical Record. 58, 299-302 (1934).
- Saunders, N. R., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M. Barrier mechanisms in the brain, II. Immature brain. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 26, 85-91 (1999).
- Zheng, W., Chodobski, A. The blood-cerebrospinal fluid barrier. , Taylor and Francis. Boca Raton, Fl. (2005).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Parada, C., et al. Embryonic cerebrospinal fluid collaborates with the isthmic organizer to regulate mesencephalic gene expression. J. Neurosci. Res. 82, 333-345 (2005).
- Mashayekhi, F., Salehi, Z. The importance of cerebrospinal fluid on neural cell proliferation in developing chick cerebral cortex. Eur. J. Neurol. 13, 266-272 (2006).
- Martin, C., et al. FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells. Dev. Biol. 297, 402-416 (2006).
- Martin, C., et al. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Gato, A., et al. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Desmond, M. E., Levitan, M. L., Haas, A. R. Internal luminal pressure during early chick embryonic brain growth: descriptive and empirical observations. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 285, 737-747 (2005).
- Alonso, M. I., Martin, C., Carnicero, E., Bueno, D., Gato, A. Cerebrospinal fluid control of neurogenesis induced by retinoic acid during early brain development. Dev. Dyn. 240, 1650-1659 (2011).
- Miyan, J. A., Zendah, M., Mashayekhi, F., Owen-Lynch, P. J. Cerebrospinal fluid supports viability and proliferation of cortical cells in vitro, mirroring in vivo development. Cerebrospinal Fluid Res. 3, 2 (2006).
- Mashayekhi, F., Bannister, C. M., Miyan, J. A. Failure in cell proliferation in the germinal epithelium of the HTx rats. Eur. J. Pediatr. Surg. 11, Suppl 1. S57-S59 (2001).
- Lehtinen, M. K., et al. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Zappaterra, M. D., et al. A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid. J. Proteome. Res. 6, 3537-3548 (2007).
- Parvas, M., Parada, C., Bueno, D. A blood-CSF barrier function controls embryonic CSF protein composition and homeostasis during early CNS development. Dev. Biol. 321, 51-63 (2008).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome. J. Proteome Res. 4, 2420-2428 (2005).
- Gato, A., et al. Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos. J. Exp. Zool. A Comp. Exp. Biol. 301, 280-289 (2004).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Res. 29, 87-90 (2001).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218 (2009).
- Parada, C., Gato, A., Bueno, D. All-trans retinol and retinol-binding protein from embryonic cerebrospinal fluid exhibit dynamic behaviour during early central nervous system development. Neuroreport. 19, 945-950 (2008).
- Parada, C., Escola-Gil, J. C., Bueno, D. Low-density lipoproteins from embryonic cerebrospinal fluid are required for neural differentiation. J. Neurosci. Res. 86, 2674-2684 (2008).
- Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
