Summary
हम विधि मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) को इकट्ठा करने और एक प्रणाली है जो भ्रूण zebrafish मस्तिष्क वेंट्रिकुलर सिस्टम के भीतर सी.एस.एफ. का अभाव बना उपस्थित. यह सी.एस.एफ. और भ्रूण के मस्तिष्क के विकास के दौरान की आवश्यकता संरचना के आगे की परीक्षा के लिए अनुमति देता है.
Protocol
1. Microinjection सुई और सेल ट्राम की तैयारी
- खनिज तेल के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार Eppendorf CellTram तेल microinjector तंत्र भरें.
- केशिका Sutter उपकरणों सुई डांड़ी का उपयोग ट्यूबों खींच कर microinjection सुइयों तैयार.
- Eppendorf CellTram से जुड़े micromanipulator पर सुई माउंट.
- ध्यान से सुई की नोक तोड़. वर्दी टिप आकार के लिए, एक micrometer के साथ उपाय, या एक संदर्भ सुई तुलना.
- तेल के साथ सुई की लंबाई भरें, CellTram का उपयोग करने के लिए लंबाई नीचे तेल धक्का, कोई बुलबुले से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है.
2. भ्रूण की तैयारी
- एक 1-200 μl विंदुक टिप के साथ एक 1% agarose लेपित थाली में छेद प्रहार, और agarose प्लग हटा. भ्रूण मीडिया (25 Westerfield के अनुसार किया) के साथ पकवान भरें.
- Stereomicroscope तहत संदंश, dechorionate भ्रूण का उपयोग.
- स्थानांतरण dechorionated भ्रूणagarose लेपित पकवान में.
- भ्रूण anesthetize, agarose पकवान Tricaine (0.1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने जब तक भ्रूण बढ़ रोकने के लिए 25 Westerfield के अनुसार किया.
3. ECSF Draining
- ओरिएंट agarose और उनके पीछे micromanipulator करने के लिए करीब पक्षों के छेद में अपनी पूंछ के साथ भ्रूण मस्तिष्क के पृष्ठीय पक्ष के दृश्य के लिए अनुमति देता है.
- Rhombomere 0/1 काज बिंदु या पश्चमस्तिष्क वेंट्रिकल (चित्रा 1 ए) की व्यापक बिंदु पर सुई की स्थिति.
- पश्चमस्तिष्क वेंट्रिकल की जर्दी में नहीं जाने के लिए मस्तिष्क की गहराई के माध्यम से सुनिश्चित किया जा रहा ध्यान बेध छत प्लेट.
- का उपयोग कर CellTram eCSF नाली और microinjection सुई में तरल पदार्थ इकट्ठा. किसी भी कोशिकाओं से बचने के लिए सावधान रहो.
4. संरचना विश्लेषण के लिए eCSF एकत्रित
- एक बार eCSF सुई में एकत्र किया जाता है, ध्यान से CellTram से चूषण बंद करो.
- मोve सुई के नीचे से बाहर पकवान और ध्यान से एक वांछित बफर युक्त ट्यूब में सुई की स्थिति.
- CellTram का उपयोग करना है, eCSF नाली से बाहर करने के लिए तेल के साथ समाधान contaminating से बचने की कोशिश कर रहा बफर में सुई की.
- आदेश में कोशिकाओं को दूर करने के लिए कि आप के साथ 10,000 x छ eCSF, स्पिन eCSF साथ aspirated है. लीजिए (तैरनेवाला) eCSF और दुकान -80 डिग्री सेल्सियस तक आगे के विश्लेषण के लिए तैयार है पवित्र.
5. चयनित कारकों के reintroduction
- ECSF वांछित समय अंतराल के दौरान हर 2 घंटा नाली, क्योंकि उस समय अवधि के भीतर तरल पदार्थ मंगाया है. समय अंक जल निकासी के बीच, सुई को दूर करने के लिए और 28.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण की दुकान या वांछित तापमान.
- परीक्षण कारक के साथ 2 micropipette सुई लोड.
- Micromanipulator में जगह सुई microinjector करने के लिए संलग्न.
- तेल और समायोजन इंजेक्शन समय और पी में ड्रॉप आकार को मापने के द्वारा 1 nl इंजेक्शन मात्रा समायोजितressure.
- मस्तिष्क के रूप में 26 पहले से वर्णित ventricles में 1-2 nl सुई.
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Representative Results
एक सूखा मस्तिष्क वेंट्रिकल का एक उदाहरण 1B - सी चित्रा में दिखाया गया है. मस्तिष्क ventricles के रूप में वे eCSF (चित्रा 1B बनाम सी) की कमी ढह रहे हैं. जैसा कि पृष्ठीय (1 बी - सी, चित्रा और चित्रा 2A-D) पश्चमस्तिष्क neuroepithelium इसकी विशेषता आकारिकी बनाए रखने और eCSF की कमी की संभावना मजबूत काज अंक के कारण के बावजूद खुला किया जा रहा है. छवियों में देखा हालांकि, पार्श्व दृश्य (चित्रा '2A'-D) दिखाना है कि पश्चमस्तिष्क निलय सूखा किया गया है, एक पतली लचीला छत प्लेट उपकला जो पेट के बल गिर की उपस्थिति के साथ संगत. जंगली प्रकार भ्रूण में, eCSF लगातार और उत्पादन किया है केवल मस्तिष्क में 2-3 घंटे के बाद draining (2 चित्रा) ventricles. इसलिए, सी.एस.एफ. के लिए लगातार ब्याज के समय पर समाप्त हो की जरूरत है.
जबकि 24 HPF में तरल पदार्थ की एक लंबे समय तक प्रति हटाने पर सकल आकारिकी या विकास, eCSF के हटाने को बाधित नहीं करता विकास के IOD पूरे शरीर के विकास के लिए प्रतिकूल प्रभाव हो सकता है. यह ध्यान में रखा जाना चाहिए जब मस्तिष्क ventricles में इंजेक्शन कारकों की प्रभावकारिता का निर्धारण. इसके अलावा, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या विकास संबंधी दोषों eCSF या एक सुई puncturing मस्तिष्क के कारण की हानि का एक परिणाम हैं, एक महत्वपूर्ण नियंत्रण मस्तिष्क में एक सुई की प्रविष्टि eCSF हटाने के बिना है.
हमने दिखा दिया है कि eCSF एसडीएस पृष्ठ एक प्रोटीन जेल पर पूरे भ्रूण निकालने की तुलना में एक अलग प्रोटीन प्रोफाइल है, और विश्लेषण दर्शाता है कि प्रोटीन की एक detectable राशि zebrafish eCSF (3 चित्रा) से एकत्र किया जा सकता है. यह दर्शाता है कि neuroepithelial सेलुलर contaminants eCSF विशिष्ट प्रोटीन की तुलना में निचले स्तर पर हैं, और आगे है कि प्रोटीन की एक पर्याप्त राशि एकत्र किया जा सकता है कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए पर्याप्त है.
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चित्रा 1 मैन्युअल रूप से सूखा मस्तिष्क ventricles. (ए) प्रयोगात्मक डिजाइन. पार्श्व (बाएं) और पृष्ठीय (दाएं) जहां microinjection सुई डालने के लिए विचार है. सुई (काले त्रिकोण) पश्चमस्तिष्क वेंट्रिकल की छत की थाली में पश्चमस्तिष्क की व्यापक बिंदु पर डाला जाता है. सुई तो आगे मध्यमस्तिष्क और अग्रमस्तिष्क ventricles के रूप में लाल तीर द्वारा नामित में डाला. (BC) 24 HPF के उदाहरण स्वयं भ्रूण सूखा. एक ही भ्रूण draining (बी) से पहले या नाली (सी) के बाद imaged. (B'- सी ') ई.पू. के tracings. ग्रे लाइन आकारिकी मौजूद है, लेकिन दिखाई नहीं इंगित करता है. F = अग्रमस्तिष्क, एम = मध्यमस्तिष्क, एच = पश्चमस्तिष्क. स्केल सलाखों = 50 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 2. ECSF समय पर मस्तिष्क ventricles केवल एक बार. (ए) 24 draining पहले HPF भ्रूण (बी) के तुरंत बाद टी = 0 (सी) 15, 60 (डी), 120 (ई), 180 (एफ), 2 (G)40, और (एच) draining (एम) के बाद 300 मिनट. (आह) और पृष्ठीय (A'एच) बाईं के लिए पूर्वकाल के साथ पार्श्व brightfield छवियों. F = अग्रमस्तिष्क, एम = मध्यमस्तिष्क, एच = पश्चमस्तिष्क. स्केल सलाखों = 50 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3. प्रोटीन प्रोफाइल 24 HPF पूरे zebrafish (हम) भ्रूण निकालने (0.5 ग्राम कुल प्रोटीन) और 50 भ्रूण से 24 HPF eCSF के बीच अलग है. एसडीएस loading बफर एकत्र eCSF जोड़ा denature प्रोटीन, नमूना एक पेज 8% Tris - एचसीएल जेल पर चलाने, और Sypro रूबी के साथ पता लगाया. * ECSF लिए अद्वितीय बैंड का संकेत मिलता है.
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Discussion
इस तकनीक का उपयोग करने के लिए मैन्युअल zebrafish मस्तिष्क ventricles से eCSF नाली विकास दौरान eCSF लिए आवश्यकता का निर्धारण करने के लिए उपयोगी होगा. इसके अलावा, इस तकनीक में भ्रूण के विकास के पाठ्यक्रम पर eCSF प्रोटीन प्रोफाइल के वर्णन की अनुमति होगी. इस समय के दौरान विभिन्न प्रोटीन की पहचान CSF और उसके मस्तिष्क के विकास के दौरान संभावित भूमिका के समारोह में आगे की जांच पड़ताल के लिए सक्षम हो जाएगा. Amniotes में, कुछ eCSF (IGF2, FGF2, retinoic एसिड, और apolipoproteins) में कारकों की पहचान neuroepithelial सेल अस्तित्व प्रसार और neurogenesis 13,17,20,23,27,28 में एक प्रदर्शन भूमिका है. हालांकि, वहाँ uncharacterized प्रोटीन के eCSF में सैकड़ों है, जो रंजित plexus गठन के बाद प्राप्त किया गया था, बाद में समय अंक से यहाँ का प्रदर्शन होना दिखाई देते हैं. इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला और अन्य लोगों के आकार असामान्य मस्तिष्क निलय या मस्तिष्क 29-31 दोष है, और हो सकता है हवलदार के साथ zebrafish म्यूटेंट की पहचान की हैई eCSF संरचना और समारोह में असामान्यताएं. इस विधि अलग और परीक्षण म्यूटेंट से या विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में ख्यात असामान्य eCSF के लिए आसानी से की अनुमति देता है.
Zebrafish प्रणाली के एक शक्तिशाली उपयोग eCSF के हटाने के बाद मस्तिष्क ventricles में इंजेक्शन के माध्यम से चयनित कारकों, जिससे मस्तिष्क के विकास के दौरान उनके कार्य का परीक्षण की जगह है. छोटे अणु, प्रोटीन, और eCSF आनुवंशिक या रासायनिक गड़बड़ी के बाद प्राप्त परीक्षण किया जा सकता है. Reintroduction अन्य प्रजातियों से eCSF के कारकों और प्रजातियों भर में और जलशीर्ष के रूप में विभिन्न रोग की स्थिति, पूरक और स्तनधारी अध्ययन के साथ interfacing के तहत कार्यों की तुलना की अनुमति देगा. सारांश में, zebrafish की का उपयोग करने के लिए eCSF निकालने के लिए, इसकी संरचना का विश्लेषण और मस्तिष्क ventricles में eCSF या विशिष्ट कारकों reintroduce महत्वपूर्ण भूमिका और eCSF समारोह के विनियमन को समझने में वृद्धि होगी और मस्तिष्क वेंट्रिकुलर प्रणाली के.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के मानसिक स्वास्थ्य के लिए राष्ट्रीय संस्थान, और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया. डॉ. जेन Gutzman, डॉ. Amanda डिकिंसन और अन्य कई उपयोगी चर्चा और रचनात्मक आलोचना के लिए निर्णायक प्रयोगशाला के सदस्यों, और ओलिवर Paugois विशेषज्ञ मछली पालन के लिए विशेष धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 | |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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