为外植体含量的颅间充质细胞行为评定

Summary

颅间充质经历了戏剧性的形态发生变动，可能提供的驱动力升高的神经褶

Abstract

是来自中枢神经系统的神经板，经过一系列复杂的形态发生变动导致的神经管形成一个被称为神经胚形成过程中。在神经胚形成过程中，被认为是推动神经褶海拔形态的间充质细胞，神经板的基础。颅间充质是由近轴中胚层和神经嵴细胞。细胞的颅间充质形式组成星状状细胞和细胞外基质（ECM）股神经褶支持混杂的一个pourous小梁。在神经胚形成过程中，的颅间充质进行定型重排，从而导致其扩张和神经褶海拔，这些动作被认为是提供动力。然而，途径和细胞的行为，带动颅间充质形态仍然很差研究。 ECM的的颅间充质underly THES的细胞之间的相互作用的E细胞的行为。在这里，我们描述了一个简单的体外植试验设计的特点，这些细胞的行为。此法是可以改变的药理操作解剖的信号通路参与和实时成像分析，以进一步鉴定这些细胞的行为。我们提出了一个代表性的实验表明本测定中的实用程序的特征的颅间充质细胞的迁移性能上的各种ECM组分。

Introduction

在胚胎8.5天（E8.5）和9.5在小鼠胚胎神经管闭合发生在颅地区。未能正确关闭的神经管头无脑儿，一个共同的结构在人类出生缺陷和不符合生活。驱动头的神经管闭合的力量，会产生神经组织本身和周围的表皮细胞和间充质^3。特别是扩大的颅间充质被认为是必不可少的海拔的颅神经褶^1,2。的颅间充质是含有丰富的细胞外基质蛋白，特别是糖基化蛋白，硫酸肝素糖蛋白，硫酸软骨素，透明质酸^4-8。

不像在鸡胚胎神经嵴细胞的移民从背神经管，神经管闭合后，在小鼠胚胎神经嵴迁移的神经褶的同时，开始为rISE（后5体节期）。因此，在小鼠胚胎神经胚形成过程中，脑神经细胞来源于神经嵴和近轴中胚层间充质细胞组成的。诱导神经嵴旁轴中胚层的人口在不同时期的发展定位在不同的位置在胚胎发育成不同的结构^9,10。近轴中胚层起源于原始的条纹，并迁移到前牙区的胚胎的的推定神经板的基础。交界处的神经板和表皮外胚层的神经嵴细胞是诱导，经历了一个上皮细胞向间质细胞转变，脱层只是之前的啮齿类动物胚胎的神经褶海拔。神经嵴细胞迁移以及刻板的路径中的subectodermal的旁轴中胚层的鳃弓，额鼻和眼周的间充质。近轴中胚层，将有助于一些的头骨穹窿的骨骼和面部肌肉;而日E神经嵴将有助于其他的头骨和面部骨骼，除了颅神经^9-11。差异的近轴中胚层和神经嵴细胞谱系标记的Mesp1创建和WNT1的表达Cre重组酶转基因小鼠的线，分别为^9。

治疗的ECM干扰剂，如透明质酸，硫酸软骨素酶ABC，肝素酶或重氮-氧代-亮氨酸（DON）在神经胚形成减值的神经管闭合⁷啮齿动物胚胎神经管闭合的颅间充质细胞中的重要作用已推断实验^{， 12-14。}在这些实验中，后的静态部分神经胚形成的组织学分析显示相关颅间充质^7,12-14 dysmorphogeneis。然而，由于致畸剂获得多个组织，但它仍然被确定，如果颅间充质是真正的靶组织。在支持的结论，该组织是必不可少的神经胚形成，的颅间充质出现异常后，一些的小鼠突变与exencephaly ^{15日至17日}组织学分析。尽管如此，在大多数情况下，突变的颅间充质细胞的细胞行为的效果没有得到解决。

我们已经制定了一个体外植试验，直接研究基因突变的结果或药物处理的行为的的颅间充质细胞^15。此法的基础，是类似访问的颅间充质细胞的分化潜能公布的2003年Tzahor 等的菱^18，除非我们修改了外植体解剖学习的迁移性能更前的人群的颅骨间充质前神经网络的基础板。我们的方法是在鸡胚进行修改外植体实验分析的神经嵴细胞的迁移行为与科Ÿ差异。前的准备工作外植神经嵴或更后的近轴中胚层^19,20。此外，在海拔在鸡胚神经褶，神经嵴尚未移居海外，从背神经管和，从而植前的近轴中胚层将不包含神经嵴细胞。在我们的试验中，颅间质组成的近轴的中胚层，神经嵴和表面外胚层的外植体被制备和镀在基板上。可以进行实验操作，包括隔离的外植体，基因突变，电镀外植体，在不同的ECM或药物治疗。与细胞迁移的外植体和的距离，数量和行为可以分析和治疗组之间的比较。此外，该制剂是可以改变的，以通过实时成像技术中的细胞迁移分析。迁移实验后，外植体可以被固定，并进行免疫组化分析，裘THER阐明的治疗效果。从总体上看，这里介绍的协议是一个简单的体外实验调查的颅间充质细胞的行为。作为一个代表性的实验中，我们利用这个试验，以检查不同的细胞外基质的的颅间充质迁移。

Protocol

1。制备ECM包被的培养皿或盖玻片

1. 准备ECM原液中溶解：ECM，衬底在PBS（Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水，＃14040-133，Invitrogen公司）。使用为0.2mm的注射器过滤器（VWR，＃28145-495）和冻结以等分试样在-80℃下进行筛选
2. ECM原液稀释在PBS中，以所需的浓度。对于MaxGel，DMEM（Dulbecco改良的Eagle培养基，Invitrogen公司，＃11995-065）中稀释。
3. 如果将进行免疫荧光染色，灭菌通过浸渍在乙醇中的12毫米的圆形玻璃盖玻片（VWR，＃89015-724）和在空气中晾干。这项工作应在无菌层流罩。如果免疫荧光法，将不会执行跳到步骤1.5。
4. 地点灭菌盖玻片在24孔板的各孔中（Corning公司，＃3526）。
5. 0.5毫升稀释的底物溶液加入到24孔板，在室温下孵育3小时温度的各孔中。
6. 吸出的ECM解决方案，并用THRE在PBS的e时代。
7. 吸干PBS及立即使用或包裹在封口膜，并储存于4℃下进行长达2个星期。

2。准备解剖工具

Sylgard的，添加木炭准备每板制造商的协议。这些板的耐药黑色背景提供支持牵制胚胎和颜色提供良好的对比度，便于可视化的透光性的胚胎。

1. 为了准备板，权衡直接进入三倒入烧杯中的平衡150 G部分的液体15克B部分木炭粉和1 g（世界精密仪器，＃SYLG184）。混合在一起，用一个木制的冰棒棍或压舌板。倒入玻璃或塑料100 cm培养皿。用一个小丁烷火炬，举行了约10至12英寸以上的菜烧的气泡。将平板上的盖子，让坐在至少24小时来设置。
2. 准备清扫工具插入一个Minutien针（0.1毫米diameteR）进入的销保持器（精细科学工具，＃26002-10和＃26018-17），分别交替26表针（BD，＃309597），与借助钳子弯曲成直角，可以用作解剖仪器。锋利的学生杜蒙＃5镊子（精细的科学工具，＃91150-20）用磨刀石（精细的科学工具，＃29008-22）。
3. 所有清扫工具，在使用前用70％乙醇消毒。

3。收集胚胎

1. 根据使用动物委员会条例安乐死的时间为8.5天coitum孕鼠和取出子宫。
2. 将子宫在塑料培养皿中，用无菌PBS。
3. 用无菌PBS洗净子宫一次。
4. 在解剖显微镜下小心地取出胚胎蜕膜组织，用一个钳子。
5. 删除胚外膜和基因分型，如果需要保存。
6. 计数体节的胚胎阶段。理想的阶段，使外植体，分析细胞BEHavior在神经褶海拔之间的6和10体节阶段时，神经褶才刚刚开始提升的颅间充质细胞的主要形态发生之前。
7. 胚胎在PBS中洗涤。在一个黑色的SYLGARD板用DMEM包含没有酚红（Invitrogen公司，＃21063-029）的地点。删除的胚外膜和基因分型，如果需要保存。

4。外植体的制备

1. 再聚焦在头部区域的胚胎在最高可能的放大倍率的显微镜。
2. 用解剖针在每手削减。使用一针保持在地方和其他组织作出削减。
3. 剪去头的菱前的胚胎。
4. 切沿中线平分头，分成两等分。
5. 切的头部和中线周围的外边缘。这些削减将删除的premigratory的的波峰和外边框和表面外胚层的在中线prechordal板。其余的生活将是外植体，将包含迁移颅神经嵴旁轴中胚层和表面外胚层。
6. 当组织被切断，除去解剖的碎片从培养皿用无菌巴斯德吸管。这可以防止混淆了外植体解剖的碎片。
7. 轻轻冲洗外植体，由pipeting向上和向下20微升移液器吸头和PIPETMAN。这将删除松散贴壁细胞和防止外植体边缘呈锯齿状。
8. 小心地拿起每个外植体，在约10微升的液体，使用移液管尖20微升和PIPETMAN和地点的中心处的包被的培养以及。
9. 中加入20μl含15％FBS补充的培养基中，以覆盖外植体。
10. 地点板在湿润的组织培养箱（5％CO _{2，37℃）1-2}小时，以允许附加到外植体的培养皿的底部。定期查看，以确保外植体不干燥了。
11. 外植体已经附着时，小心地加至每个孔中加入250μl含10％FBS DMEM培养液已被温热至37℃的水浴中。一旦外植体连接时不会移动板在显微镜下轻轻摇动。
12. 返回菜组织培养的孵化器。
13. 24小时后，将外植体牢固地附着和细胞就会开始移民。此时药理剂可添加到介质中。
14. 48小时后，电镀，已经从外植体细胞。可以可视化和成像的距离迁移。我们通常会停止在这一点上，因为文化外植体开始出现较长的孵育的生存能力下降。如吖啶橙或台盼蓝甲活力染色也可用于判断是否将外植体的可行性。
15. 在这一点上，可以获取图像文件从外植体的细胞迁移的距离和数量。另外，如果外植体涂布于盖玻片上，它们可以是固定的，并执行的可视化感兴趣的蛋白质的免疫组织化学分析。

在协议中的关键步骤

1. 把外植体的大致相同的大小。
2. 清除所有清扫污物解剖板解剖，以避免混淆所需的移植组织碎片。
3. 当电镀外植体井或盖玻片上是一定要放在液滴的媒体中心以及与外植体。
4. 允许植足够的时间来连接洪水以及与媒体之前，。
5. 每一个测试基板和药理活性剂处理条件应该是标准化的。
6. 两个每个胚胎外植体可以由（一个从左边和从右侧的神经管中的一个）。
7. 当测试迁移的细胞突变小鼠品系不同实验条件下，把一个突变的外植体在对照组和治疗组。

故障排除

1. 如果外植体无法连接，增加附件规定的时间。根据我们的经验，约一半的外植体不附加和较大的外植体更有效地附着。
2. 如果外植体附加到井的周围，它们将难以图像。请务必将外植体中心的良好。
3. 理想的情况下，外植体是大致相同的尺寸。然而，外植体大小的差异可以被校正为在quanitating从外植体的细胞的迁移时，使用的外植体的直径作为校正因子。
4. 如果发生污染确保消毒工作条件正在使用。所有的工具和工作表面应用70％乙醇消毒。移液管和培养皿应该是新的和不育。
5. 如果外植体迷路的解剖过程中，要定期清除杂物，以防止丢失的外植体。
6. 掌握解剖非常耗时，而且需要练习。优化正常的放大倍率，锐性剥离的工具和针帮助。

Representative Results

从颅间充质细胞的外植体的细胞迁移的外观如图2所示。我们测试了在不同的的ECM基板，是在颅间充质细胞在神经胚形成包括纤维连接蛋白，层粘连蛋白（100毫克/毫升;西格玛L2020），（100毫克/毫升;西格玛F1141）MaxGel ECM（1:500稀释的DMEM迁移;西格玛＃E0282）和透明质酸（1毫克/毫升，Sigma公司，＃53747）。细胞不能迁移从外植体时，没有ECM存在（数据未示出）和测试的所有基板支持的迁移的细胞。的形状，以及从外植体的细胞迁移的大小取决于基板。这是预期的，因为以前的研究表明，细胞与不同的ECM的相互作用所产生的机械力的影响的形状和迁徙性的细胞^21。

图1。外植体的制备。（A）编制外植体，E8.5胚胎蜕膜组织和胚外组织的解剖。 （B）胚胎头从身体左前菱解剖。外植体的制备是通过从中线和头部的外边缘的移除prechordal的板分别在中线和premigratory的神经嵴和在边界表面外胚层，除去组织。 （C）的外植体的制备是通过切去组织从中线边缘和外边缘的头部移除prechordal板中线和premigratory的神经嵴和在边界表面外胚层。 （D）的外植体放置在一个小体积培养基在ECM涂覆的菜/盖玻片和允许连接之前，除了更多的介质。

图2。从不同衬底上镀的外植体的颅间充质细胞的迁移。外植体接种于纤维连接蛋白，层粘连蛋白，MaxGel ECM或透明质酸和文化拍下后48小时。大小酒吧= 200毫米。

Discussion

采用的方法提供了一个功能强大的检测，检查颅骨间充质细胞的行为。在除了这里介绍的静态分析，在明亮的字段或组合住成像实验与GFP-标记的蛋白质的表达，可以采用实时检查细胞的行为，因为它们从外植体中迁移。对于实时成像实验中，外植体可以用DiI标记或分化的神经嵴细胞的迁移，从近轴中胚层，ROSA-YFP Mesp1创建或ROSA-YFP; WNT1中铁快运或其他转基因株系可以使用。颅间充质细胞-ECM相互作用也可以利用此外植体的分析研究。在这里，我们，本的颅间充质中表明，细胞对这些迁移到不同的程度，ECM的影响的细胞的形态的不同的ECM基板的板外植体对。此外，外植体可以被嵌入在一个三维矩阵存取的行为大公LS在这种情况下。此外植体检测是可以改变的遗传学和药理学的操作的颅间充质行为来分析内在的和外在的线索，可以调节和修改迁移的影响分析。例如，我们在我们的研究中利用该测定辨别Hectd1突变颅间充质¹⁵中的异常细胞的行为的过量的热休克蛋白90（Hsp90）分泌的作用。在这些实验中，我们处理的外植体与抗-Hsp90的抗体，格尔德霉素和DMA（二甲基amelioride），热休克蛋白90（Hsp90）蛋白阻止分泌的热休克蛋白90（Hsp90），表明异常行为的Hectd1突变的细胞是由于过量的细胞外热休克蛋白^{90（Hsp90）15。}类似的方法可用于药理学解剖颅间充质细胞的正常或异常的形态发生的基本的附加通路。测定完成后，外植体和迁移的细胞可以分析由一个主机的方法。例如，免疫组化分析C可检查本地化的关键细胞运动的蛋白质。转录组分析也可以治疗，以确定如何影响基因的表达。

这种技术的一个显着的限制是，它不会在三维模型的行为，因为它们将在体内发生。的协议，其中外植体被嵌入在一个三维的矩阵（ 例如，基质胶）以及表达荧光蛋白标记的细胞区室的变形例，可以采用必要的，以解决这个问题。即使进行这些修改，这与在体内的体外测定中看到的行为相关联的进一步的实验来将是必要的。其他限制包括大量的胚胎需要产生足够数量的来生成静态显著数据。最重要的是，夹层是相对简单的，它需要练习才能熟练掌握。