Эксплантов анализа для оценки сотовой поведение черепно Мезенхима

Summary

Черепной мезенхимы происходят драматические движения морфогенный которые, вероятно, представляет собой движущую силу для возвышения нервных складок

Abstract

Центральной нервной системы происходит от нервной пластинки, что претерпевает ряд сложных движений морфогенетических приводит к образованию нервной трубки в процессе, известном как нейруляции. Во время нейруляции, морфогенез мезенхимы, что лежит в основе нервной пластинки Считается, что управлять нейронных раза высоте. Черепной мезенхимы состоит из параксиальной мезодермы и клеток нервного гребня. Клетки мезенхимы форме черепа pourous сетчатая структура состоит из звездчатых клеток формы и смешения внеклеточного матрикса (ECM) нитей, которые поддерживают нервную складки. Во время нейруляции, черепно мезенхимы происходят стереотипно перестройки в результате его расширения и эти движения, как полагают, обеспечивают движущую силу для нейронных раза высоте. Тем не менее, пути и клеточные поведения, которые ведут черепно морфогенеза мезенхимы остаются плохо изученными. Взаимодействие между ECM и клеток мезенхимы черепно лежащие Фесповедение электронной ячейки. Здесь мы опишем простой бывших естественных условиях эксплантов анализа разработан для характеристики поведения этих клеток. Этот анализ является исправимый к фармакологической манипуляции, чтобы анализировать сигнальные пути участвуют и живой анализа изображений для дальнейшего характеризуют поведение этих клеток. Мы представляем представитель эксперимент демонстрирует полезность этого анализа для характеристики миграционных свойств черепно мезенхимы на различные компоненты ECM.

Introduction

Закрытие нервной трубки в краниальной области происходит между эмбриональными день 8,5 (E8.5) и 9,5 у эмбрионов мышей. Неправильное закрытие нервной трубки в голову результатов в анэнцефалия, общих структурных врожденных дефектов у человека и несовместима с жизнью. Сил, которые управляют головной закрытия нервной трубки формируются как из нервной ткани себе и окружающим эпидермиса и мезенхимы ^3. В частности, расширение черепных мезенхимы, как считается, необходимы для возвышения черепно нейронных ^1,2 складок. Черепной мезенхимы богат белками ECM, в частности, гликозилированного белка, такие как гепарин сульфат протеогликаны, хондроитин сульфаты и гиалуронат ^4-8.

В отличие от куриных эмбрионов, где клетки нервного гребня эмигрировать из дорсальной части нервной трубки после закрытия нервной трубки, нервного гребня у эмбрионов мышей мигрирует в то же время, что нервные складки начинают гISE (после 5 сомитов). Таким образом, во время нейруляции у эмбрионов мышей, черепно мезенхимы состоит из клеток, полученных из нервного гребня и параксиальной мезодермы. Нервного гребня и параксиальной мезодермы населения вызываются в различные периоды развития; локализованы на различных должностях в зародыше и развиваться в различных структурах ^9,10. Параксиальной мезодермы происходит из первичной полоски и мигрирует в передней части зародыша, лежит в основе предполагаемого нервной пластинки. Нервного гребня индуцируется на стыке нервной пластинки и эпидермальных эктодермы, проходит в эпителиальных мезенхимы перехода и расслаивается только до высоты нейронных раза в грызунах эмбриона. Клетки нервного гребня мигрируют вдоль стереотипные пути в мезодерма subectodermal параксиального к жаберной дуге, лобно-носовой и периокулярной мезенхимы. Параксиальной мезодермы будет способствовать некоторые из костей свода черепа и мышц лица, в то время гоэлектронной нервного гребня будет способствовать других костей черепа и лица в дополнение к черепных нервов ^9-11. Параксиальной мезодермы и нервной линий гребня может быть дифференциально отмечены Mesp1-Cre и Wnt1-Cre линий трансгенных мышей, соответственно, ^9.

Существенную роль черепной мезенхимы в закрытие нервной трубки были выведены из экспериментов, где лечение грызунов эмбрионов с ECM нарушая агентов, таких как гиалуронидаза, хондроитиназы ABC, heparitinase или Diazo-оксо-норлейцин (ДОН) во время нейруляции нарушение закрытия нервной трубки ^{7, 12-14.} В этих экспериментах, гистологический анализ статических разделов после нейруляции показали, связанных dysmorphogeneis черепной мезенхимы ^7,12-14. Однако, поскольку тератогенный агент имел доступ к нескольким тканей, остается определить, если черепно мезенхимы действительно ткани-мишени. В поддержку выводу, что эта тканьимеет важное значение для нейруляции, черепно мезенхимы кажется ненормальным на гистологических анализов в некоторых мышей мутантов с экзенцефалия ^15-17. Тем не менее, в большинстве случаев, влияние мутации на клеточном поведение черепно мезенхимы не рассматривался.

Мы разработали бывшего анализ эксплантов естественных условиях непосредственного изучения следствием генетической мутации или фармакологических манипуляций на поведение черепно-мозговых клеток мезенхимы ^15. Этот тест похож на опубликованный Tzahor и др., 2003 для доступа к дифференциации потенциал черепно мезенхимы, лежащей в основе ромбомеры ^18, кроме мы изменили эксплантов рассечение для изучения миграционных свойств более передней черепной населения мезенхимы, которые лежат в передней части нервной пластину. Наш метод также модификация эксплантов анализы выполняются в куриных эмбрионов для анализа миграционного поведения нервного гребня с кеУ различий. Предыдущий препараты эксплантированных нервного гребня или более задних параксиальной мезодермы ^19,20. Кроме того, в нейронных раза высот в курином эмбрионе, нервного гребня еще не эмигрировал из дорсальной части нервной трубки и, таким образом эксплантов принимать во внимание переднего параксиальной мезодермы не будет содержать клетки нервного гребня. В нашем анализе, черепно эксплантов мезенхимы, состоящий из параксиальной мезодермы, нервного гребня и поверхности эктодермы готовят и наносят на подложку. Экспериментальные манипуляции в том числе изоляции эксплантов от генетических мутантов, покрывая эксплантов на разных ECM или фармакологические методы лечения могут быть выполнены. Клетки мигрируют из эксплантов и расстояние, количество и поведение могут быть проанализированы и сравнены между группами лечения. Кроме того, этот препарат исправимый для анализа клеточной миграции живой методов визуализации. После миграции эксперимент, эксплантов могут быть установлены и подвергнуты иммуногистохимического анализа для мехаТам выяснения влияния лечения. В целом, протокол представленные здесь простой анализ естественных бывший исследовать поведение черепной мезенхимы. Как представитель эксперимент, мы используем этот анализ для изучения миграции черепно мезенхимы на различные внеклеточные субстраты.

Protocol

1. Подготовка ECM покрытием Посуда культуры или Покровные

1. Подготовка ECM раствор путем растворения ECM субстрата в PBS (Дульбекко фосфатно-солевой буфер, Invitrogen, # 14040-133). Фильтр помощью шприца 0,2 мм фильтр (VWR, # 28145-495) и замораживание аликвоты при -80 ° C.
2. Развести ECM раствор в PBS до нужной концентрации. Для MaxGel, развести в DMEM (Дульбекко изменения Eagle Medium, Invitrogen, # 11995-065).
3. Если иммунофлюоресценции будет выполнена, стерилизовать 12 мм кругового покровные стекла (VWR, # 89015-724) путем погружения в этаноле и дайте высохнуть на воздухе. Это должно быть сделано в стерильном ламинарном. Если иммунофлюоресценции не будет выполнена перейдите к шагу 1.5.
4. Место стерилизованные покровные в каждую лунку 24-луночный планшет (Corning, # 3526).
5. Добавить 0,5 мл разведенного раствора субстрата в каждую лунку 24-луночный планшет и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 часов.
6. Аспирируйте от решения ECM и мыть Автошоуе раз в PBS.
7. Аспирируйте с PBS и использовать сразу или завернутые в парафильмом и хранили при 4 ° C в течение 2 недель.

2. Подготовка Dissection инструменты

Sylgard пластин с добавлением древесного угля подготовлено в соответствии с протоколом производителя. Устойчивыми черном фоне этих плит обеспечивает поддержку сковав эмбриона и цвет обеспечивает хорошую контрастность, которая способствует визуализации полупрозрачных эмбриона.

1. Для подготовки пластин весит непосредственно в три-влить стакан на весах 150 г Часть жидкого 15 г Части B и 1 г угольного порошка (инструменты Всемирного Precision, # SYLG184). Смешать с помощью деревянной палочки эскимо или шпателя. Налейте в стеклянную или пластиковую 100 блюд см. Используйте маленький факел бутана состоялось 10 до 12 дюймов выше блюда, чтобы сжечь любые пузыри. Место крышки на пластинках и пусть сидят в течение по крайней мере 24 часа в сутки, чтобы установить.
2. Для подготовки рассечение инструментов вставки Minutien контактный (0,1 мм diameteг) в контактный держатель (Fine научных инструментов, # 26002-10 и № 26018-17, соответственно) в качестве альтернативы 26 калибровочных иглы (BD, # 309597) согнуты под прямым углом с помощью пинцета можно использовать в качестве рассекающих инструментов. Заостренный Студенческая Дюмон # 5 пинцет (Fine Инструменты наук, # 91150-20) с использованием точильный камень (Fine научных инструментов, # 29008-22).
3. Стерилизовать всех рассечение инструментов с 70% этанола перед использованием.

3. Коллекция эмбрионов

1. Усыпить приурочен беременных мышей в 8,5 coitum сообщению дней в зависимости от животного правил использования комитетов и удалить матку.
2. Место матки в пластиковой чашке Петри стерильной PBS.
3. Вымойте матки раза стерильной PBS.
4. Под микроскопом рассечение осторожно удалить эмбрион от deciduas с помощью пары щипцов.
5. Удалить внеэмбриональной мембраны и сохранить для генотипирования, если необходимо.
6. Этап эмбриона путем подсчета сомитов. Идеальный этапы, чтобы сделать эксплантов для анализа сотовой БехAvior во время нейронные раза высота будет между 6 и 10 сомитов стадиях, когда нервные валики только начинают, чтобы поднять и перед главным морфогенеза черепа мезенхимы происходит.
7. Вымойте эмбриона в PBS. Место в черной пластины Sylgard с DMEM, который не содержит фенола красного (Invitrogen, # 21063-029). Снимите внеэмбриональной мембраны и сохранить для генотипирования, если необходимо.

4. Подготовка Экспланты

1. Refocus микроскопом на самом высоком увеличении над головой область зародыша.
2. Сделайте разрезы с рассечения иглы в каждой руке. Использование одной иглы для хранения ткани на месте, а другой, чтобы сделать разрезы.
3. Отрежьте голову эмбриона впереди ромбомеры.
4. Разрежьте вдоль средней линии, чтобы разделить пополам голову на две равные половины.
5. Вырезать вокруг внешних краях головы и средней линии. Эти сокращения удалить premigratory гребня и поверхности эктодермы на внешней границе ипрехордальной пластинки в средней линии. Остальные ткани будет эксплантов и будет содержать миграции черепно нервного гребня, параксиальной мезодермы и эктодермы поверхности.
6. Как ткани вырезать, удалить мусор из расчлененных блюдо с помощью стерильной пипетки Пастера. Это позволяет избежать путаницы эксплантов с расчлененным мусора.
7. Осторожно промыть эксплантов на пипетировать вверх и вниз с 20 мкл пипетки и Pipetman. Это позволит удалить слабо прикрепленные клетки и предотвратить неровными краями на эксплантов.
8. Тщательно подобрать каждому эксплантов примерно 10 мкл жидкости, используя 20 мкл пипетки и Pipetman и место в центре покрытием культуру.
9. Добавить 20 мкл культуральной среде, дополненной 15% FBS, чтобы покрыть эксплантов.
10. Место пластины в увлажненной тканью культуры инкубаторе (5% CO _2, 37 ° C) в течение 1-2 часов, чтобы позволить эксплантов прикрепить к нижней части блюда. Просмотр периодически, чтобы гарантировать, что эксплантов не сушитиз.
11. Когда эксплантов придает, осторожно добавить в каждую лунку по 250 мкл DMEM с добавлением 10% FBS, который был нагревают до 37 ° С на водяной бане. После эксплантов приложил они не будут двигаться, когда пластина осторожно встряхивают под микроскопом.
12. Вернуться блюдо в культуре ткани инкубатора.
13. После 24 часов, эксплантов будут прочно прикреплены и клетки начнут эмигрировать. В это время фармакологические препараты могут быть добавлены к средствам массовой информации.
14. 48 ч после посева, клетки мигрировали из эксплантов. Расстояние миграции могут быть визуализированы и образ. Обычно мы остановить культуры в этот момент, так как эксплантов начинают проявлять признаки снижения жизнеспособности с более инкубации. Жизненно важные пятна, такие как акридинового оранжевого или синего трипанового также может быть использована для проверки жизнеспособности эксплантов.
15. В этот момент изображение может быть приобретен к документу расстояние и количество клеток, которые мигрируют из эксплантов. Кроме того, если эксплантов высевали на покровные стекла,они могут быть установлены и иммуногистохимических анализов, чтобы визуализировать белки интерес.

Критические шаги в протокол

1. Вырезать эксплантов примерно такого же размера.
2. Очистить все рассечение мусора с рассечения пластины, как вы рассечения, чтобы избежать запутанной мусора с желаемым эксплантированных ткани.
3. Когда покрытие эксплантов в колодцах или на покровные убедитесь, что поместили каплю среды с эксплантов в центре хорошо.
4. Разрешить эксплантов достаточно времени, чтобы прикрепить до наводнения также со средствами массовой информации.
5. Лечение условия должны быть стандартизированы для каждой подложки и фармакологических тестов агента.
6. Два эксплантов могут быть сделаны из каждого эмбриона (один слева и один справа от нервной трубки).
7. При тестировании миграции клеток из мутантные линии мышей при различных экспериментальных условиях, положите один мутантный эксплантов в контрольной группе, а другая в группе, получавшей лечение.

Поиск и устранение неисправностей

1. Если эксплантов не в состоянии приложить, увеличить отведенное время для вложений. По нашему опыту, примерно половина из эксплантов не придают и больше эксплантов придерживаться более эффективно.
2. Если эксплантов приложить к периферии хорошо они будет трудно изображения. Будьте уверены, чтобы разместить эксплантов в центре хорошо.
3. В идеале эксплантов будет примерно такого же размера. Тем не менее, расхождения в размере эксплантов могут быть скорректированы для использования диаметр эксплантов в качестве поправочного коэффициента quanitating миграции клеток из эксплантов.
4. Если заражение происходит обязательно стерильные условия труда используется. Все инструменты и рабочие поверхности должны быть стерилизованы с 70% этанола. Пипец и чашки Петри должно быть новым и стерильным.
5. Если экспланты заблудиться во время вскрытия, периодически удалять мусор, чтобы не потерять эксплантов.
6. Освоение рассечение занимает много времени и требует практики. Optiмал увеличение, острые инструменты диссекции и иглы помощь.

Representative Results

Появление клетки мигрируют из черепной эксплантов мезенхимы показано на рисунке 2. Мы протестировали миграции на различных подложках ECM, которые присутствуют в черепной мезенхимы во время нейруляции в том числе фибронектина (100 мг / мл, Sigma # F1141), Ламинин (100 мг / мл, Sigma # L2020), MaxGel ECM (1:500 разведение в DMEM , Sigma # E0282) и гиалуроновая кислота (1 мг / мл, Sigma, # 53747). Клетки не мигрируют из эксплантов, когда не присутствует ECM (данные не представлены), и все субстраты испытания поддерживает миграцию клеток. Обе формы, а также размеров клеток, которые мигрируют из эксплантов зависит от субстрата. Ожидается, что это, как и предыдущие исследования показали, что механические силы, возникающие при взаимодействии клеток с различными ECM влияет как на форму и миграционные свойства клеток ^21.

Рисунок 1. Подготовка эксплантов. (A) Для подготовки эксплантов, E8.5 эмбрионов расчлененный от deciduas и внеэмбриональной тканей. (B) Эмбрион головы расчлененного тела от переднего к ромбомеры. Экспланты получают путем удаления ткани от средней линии и внешние края головы, чтобы удалить прехордальной пластинки в средней линии и premigratory нервного гребня и поверхности эктодермы на границе, соответственно. (C) Экспланты получают путем срезания тканей от средней линии и внешние края головы, чтобы удалить прехордальной пластинки в средней линии и premigratory нервного гребня и поверхности эктодермы на границах. (D) Экспланты помещаются в небольшом объеме средств массовой информации на ECM покрытием блюда / покровные и позволили прикрепить перед добавлением больше информации.

Рисунок 2. Миграция черепно-мозговых клеток мезенхимы из эксплантов высевают на различных подложках. Экспланты высевали на фибронектин, ламинин, MaxGel ECM или гиалуроновая кислота и сфотографировали после 48 ч в культуре. Размер бар = 200 мм.

Discussion

Метод применяется здесь обеспечивает мощный анализа для изучения поведения черепно-мозговых клеток мезенхимы. В дополнение к статическому анализу, представленные здесь, живут изображений эксперименты в светлом поле или в сочетании с экспрессией GFP-меченых белков могут быть использованы для изучения поведения клеток в реальном времени, как они мигрируют из эксплантов. Для живых экспериментов с изображениями, эксплантов можно было бы назвать с DiI или различать миграцию клеток нервного гребня от параксиальной мезодермы, ROSA-YFP; Mesp1-Cre или ROSA-YFP; Wnt1-Cre или других трансгенных линий могут быть использованы. Черепно-мезенхимы ECM взаимодействия также может быть рассмотрено использование этого эксплантов анализа. Здесь мы пластину эксплантов на различных подложках ECM, которые присутствуют в краниальной мезенхиме, чтобы показать, что клетки мигрируют на этих в разной степени, и что ECM влияет на морфологию клеток. Кроме того, эксплантов могут быть встроены в трехмерную матрицу для перехода к поведению челLs в этом контексте. Это эксплантов анализа является исправимый на анализ влияния генетических и фармакологических манипуляций с черепно поведения мезенхимы, чтобы проанализировать внутренние и внешние сигналы, которые могут регулировать и изменять миграции. Например, мы использовали этот анализ в наших исследованиях выявить роль избыточной секрецией Hsp90 в ненормальном сотовой поведения в Hectd1 мутант черепно мезенхимы ^15. В этих экспериментах мы рассматривали эксплантов с анти-Hsp90 антитела, белки Hsp90, гелданамицина и DMA (диметил amelioride), чтобы блокировать секрецию Hsp90, чтобы продемонстрировать, что аномальное поведение Hectd1 мутантных клеток происходит из-за избыточного внеклеточный Hsp90 ^15. Аналогичные подходы могут быть использованы для фармакологической препарировать дополнительные пути, лежащие в основе нормальной или ненормальной морфогенеза черепа мезенхимы. Когда анализ будет завершен, эксплантов и мигрирующих клеток может быть проанализирован целый ряд методов. Например, иммуногистохимического анализа сбыть использованы для изучения локализации белков важны для клетки движений. Транскриптома анализ также может быть использован для определения того, как лечение влияет на экспрессию генов.

Одним из существенных ограничений этого метода является то, что она не модель поведения в трех измерениях, как они будут происходить в естественных условиях. Модификация протокол, в котором эксплантов, внедренные в трехмерной матрице (например, матригель) наряду с выражением флуоресцентного белка заметно сотовой отсеки могут быть использованы необходимые для решения этого вопроса. Даже если эти изменения были проведены дальнейшие эксперименты, чтобы соотносить поведение видели в этой бывшей анализа естественных условиях с теми, в естественных условиях будет необходимо. Другие ограничения включают в себя большое количество эмбрионов, необходимые для создания количестве, достаточном для создания статически значимых данных. Самое главное, что рассечение относительно проста, она требует практики, чтобы хозяин.