Summary
Adenovirus partikler er konstruert for å inneholde enten unaturlig aminosyren analoge azidohomoalanine eller azido sukker
Abstract
Modifikasjonen av viruspartikler har mottatt en betydelig mengde oppmerksomhet for sin enorme potensialet for å påvirke genterapi, oncolytic søknader og vaksineutvikling. 1,2,3 dagens tilnærminger til å endre viral overflater, som for det meste genetikk-baserte, ofte lider av demping virus produksjon, smittsomhet og cellulær transduksjon. 4,5 Bruke chemoselective klikk kjemi, har vi utviklet en grei alternativ tilnærming som sidesteps disse spørsmålene mens resterende både svært fleksibel og tilgjengelig. 1,2
Målet med denne protokollen er å demonstrere effekten av å bruke bioorthogonal klikk kjemi for å endre overflaten av adenovirus type 5 partikler. Denne to-trinns prosess kan brukes både terapeutisk 1 eller analytisk, 2,6 som det åpner for chemoselective ligation av målretting molekyler, fargestoffer eller andre molekyler av interesse på proteinerpre-merket med Azide tags. De tre store fordeler med denne metoden er at (1) metabolsk merking demonstrerer liten eller ingen innvirkning på viral fitness, 1,7 (2) et bredt spekter av effektor ligander kan utnyttes, og (3) det er bemerkelsesverdig rask, pålitelig og lett tilgang til. 1,2,7
I det første trinnet i denne fremgangsmåten, er adenovirus partikler produsert peiling enten azidohomoalanine (Aha, en metionin surrogat) eller unaturlig sukker O-forbundet N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), som begge inneholder natriumazid (-N 3) funksjonell gruppe. Etter rensing av azide-modifiserte viruspartikler, er en alkyne sonde som inneholder fluorescerende Tamra moiety ligated på en chemoselective måte til pre-merkede proteiner eller glykoproteiner. Til slutt, en SDS-PAGE-analyse utført for å demonstrere vellykkede ligation av sonden på de virale kapsid proteiner. Aha innlemmelse er vist å merke alle viral kapsidproteiner (Hexon, Penton og fiber), mens O-GlcNAz inkorporering resulterer i merking av Fiber bare.
I dette utvikler feltet, har flere metoder for azide-alkyne ligation blitt utviklet, men bare de to vi har funnet å være mest praktisk er demonstrert her - stamme-forfremmet azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) og kobber-katalysert azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosfære.
Protocol
Se tabell 1 for utarbeidelse av alle medier, buffere og løsninger refereres til i denne protokollen.
1. Produksjon av Aha-merket Adenovirus
- Forbered elleve 100-mm vevskulturstudier retter av humane embryonale nyre celler (HEK 293) opprettholdes i HEK 293 cellevekst medium (se tabell 1) ved 37 ° C til de har nådd 80 - 90% confluency. (Merk:. Kulturer med confluency over 90% kan være vanskelig å infisere og kan ikke produsere virus som ønsket)
- Løsne cellene i en av rettene ved først å fjerne vekst medium, skylling gang med 5 ml TD buffer, deretter ruger de cellene for en min i 1 ml trypsin-EDTA (1 ×).
- Legg 9 ml av HEK 293 cellevekst medium, og bruker en hemocytometer å telle antall høstet HEK 293 celler fra denne parabolen. Bruk dette nummeret til å beregne mengden av adenovirus type 5 (AD5) kreves for infeksjon med en multiplicity for infeksjon (MOI) verdi på 10 PFU / celle. Konto for det faktum at for normal AD5 er smittsomhet indeksen (forholdet mellom infeksiøse partikler til totalt antall partikler) typisk 01:20.
- Forbered 10 ml av infeksjon buffer.
- Fjern sakte HEK 293 cellevekst medium fra de ti resterende kultur retter, vask deretter med 5 ml TD buffer. Tilsett 1 ml av smitte buffer til hver rett og Inkuber ved 37 ° C i 1 time. I løpet av denne infeksjonen perioden, rist hver kultur rett side til side i 15-min intervaller.
- Etter infeksjon, tilsett 9 ml av frisk HEK 293 cellevekst medium og Inkuber ved 37 ° C i 18 timer.
- Forbered 100 ml av Aha merking medium (eller Met kontroll medium for kontroll). Sørg for å filtrere de konsentrerte stamløsninger med en 0,2-mikrometer steril sprøyte filter før utarbeidelsen av merking media.
- Nøye (for ikke å vaske bort den infiserte celler) fjerne HEK 293 cellevekst medium etter 18 hr ennd vaske hver kultur tallerken med 5 ml TD buffer.
- Fjern TD buffer vaskeløsningen og tilsett 10 ml av Aha merking medium til hver kultur parabolen. For en kontroll, bør metionin kontroll medium brukes i stedet for Aha merking medium på dette trinnet.
- Inkuber de infiserte cellene i merking medium ved 37 ° C i 6 timer. Merking kan utføres når som helst mellom 12 - 24 timer etter smitte, men bør ikke være lenger enn seks timer i varighet. Dette intervallet er innstilt på å maksimere overlapper med viral strukturelt protein oversettelse samtidig smittsomhet ikke er vesentlig redusert. 7
- Fjern forsiktig merking medium for ikke å forstyrre cellene. Tilsett 10 ml av frisk HEK 293 cellevekst medium til hver rett og Inkuber cellene ved 37 ° C for en annen 18 hr. For å minimere tap av infiserte celler under dette trinnet, er det ikke nødvendig å fjerne merkingen løsningen helt. Den HEK 293 cellevekst medium inneholder et overskudd av Met som vil utkonkurrere enhver gjenværende Aha.
- Fortsett til trinn 3 for rensing.
2. Produksjon av Azido-Sugar-merket Adenovirus
- Følg fremgangsmåten tittelen Produksjon av Aha-merket Adenovirus tom trinn 1.5.
- Forbered 100 ml Azido-sukker merking medium.
- Dekk cellene med 10 ml av frisk Azido-sukker merking medium og Inkuber ved 37 ° C i 44 timer.
3. Rensing av Azide-merkede adenoviral Partikler
- Fjern media sammen med de infiserte cellene fra hver kultur rett og overføring til koniske rør. Sentrifuger ved 2000 gi 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i TD buffer (med 8 ml TD buffer per 10 retter).
- Lyser de infiserte cellene ved gjentatte (3 eller flere) fryse-tine sykluser ved hjelp av en Dewar kolbe av flytende nitrogen og en 37 ° C vannbad. Sentrifuger ved 2000 gi 10 minved 4 ° C for å skille celleavfall fra supernatanten.
- Forbered en CsCl tettshetsgradient sentrifugerør ved første pipettere 2,5 ml av 1,25 g / ml CsCl løsning til en Ultra Clear sentrifugerør. Deretter bruker en pipette med spissen plassert på bunnen av røret for å sakte legge 2,0 ml 1,4 g / ml CsCl løsning, tar seg ikke å forstyrre gradient grensesnittet.
- Pipettering supernatanten fra trinn 3,2 på toppen av CsCl tettshetsgradient tube, og om nødvendig add TD buffer for å fylle røret. Sentrifuger prøvene i en svingende bøtte rotoren på 125 000 g for en time ved 15 ° C i en Ultrasentrifuger.
- Etter gjennomføring av ultracentrifugation, bør viruspartikler være synlig som en tykk hvit bandet i grenselandet mellom de to CSCL løsninger. Lag en liten perforering på bunnen av røret med en steril nål å la løsningen renne dropwise.
- Samle den tykke hvite båndet, bør som inneholder de merket AD5 partikler, Taking vare å utelukke overflødig CsCl løsning. Unngå å samle cellulære proteiner som vil bandet over viruset laget. I tillegg utelukke tomme virion capsids som danner en lighter lag litt over den tykke hvite viruset band.
- Alternativt utføre en siste renselse på de merkede AD5 partikler. Tilsett samlet fraksjonen fra trinn 3,6 til en 4-ml Ultrasentrifuger rør og fylle røret med 1,35 g / ml CsCl løsning. Sentrifuger ved 125 000 g for 18 timer ved 15 ° C og samle den tykke hvite båndet som dannes i midten av røret som beskrevet i trinn 3.5 og 3.6. (Merk at hvis viral titer er lav, kan en hvit bandet ikke være synlig etter den andre sentrifugering, og det vil ikke være mulig å gjenopprette merket virus).
- For lagring av viruspartikler over lange perioder, bør dialyse av den innsamlede viruset ekstrakt utføres mot virus lagring buffer. Oppbevar dialyzed virus prøver ved -80 ° C.
4. Linavigasjonsknappene av modifisert adenoviral Partikler med Alkyne Sonder Bruke Strain-Fremmes azid-Alkyne cycloaddition (SPAAC)
- Til en løsning av 50 mL av azide-modifisert AD5 i virus lagring buffer, tilsett 0,25 mL av SPAAC merking løsning. (Se tabellen av reagenser for en liste over venders av kommersielt tilgjengelige anstrengte alkyner).
- La belastningen-forfremmet cycloaddition reaksjon å fortsette natten i romtemperatur. Dersom en lysømfintlig probe (f.eks Tamra) brukes, dekke reaksjonen fartøyet med aluminiumsfolie.
- Renser merket viruset i henhold til trinn seks.
5. Ligation av modifisert adenoviral Partikler med Alkyne Sonder Bruke Copper (I)-katalysert azid-Alkyne cycloaddition (CuAAC) i deoxygenated Atmosphere
- Place 7,2 mg kobber (I) bromid (CuBr) pulver i en Eppendorf rør, dekket med aluminiumsfolie.
- Pipetter 1 ml DMSO til en andre Eppendorf rør.
- Forbered50 mL av CuAAC merking løsning i en tredje Eppendorf rør. Dekk med aluminiumsfolie hvis alkyne sonden er lysømfintlig (f.eks Tamra-Alkyne).
- Plasser de tre Eppendorf rør, uncapped, i en deoxygenated hanske bag for 6 hr. Alle prøver skal være inne i hansken posen inntil ferdigstillelse av CuAAC reaksjonen.
- Forbered en 50 × stamløsning av CuBr ved å legge en ml DMSO til 7,2 mg CuBr pulver, som begge har blitt deoxygenated henhold til trinn 5.4.
- Initiere CuAAC reaksjonen ved pipettere 1 mL av denne CuBr lager løsningen til 50 mL av CuAAC merking løsning, som har blitt deoxygenated henhold til trinn 5.4. La reaksjonen til å fortsette for 12 timer inne i hansken posen.
- Renser merket viruset i henhold til trinn seks.
6. Rensing og lagring av merket viruspartikler
- Renser merket viruset prøver ved hjelp Centri-Sep gel filtrering spin columns likevekt med Virus bagasje buffer, etter produsentens retningslinjer.
- Alternativt kan rensing utføres av dialyse Virus Storage buffer.
- De merket viruspartikler bør lagres ved -80 ° C.
7. SDS-PAGE av merket Adenovirus & Fluoriserende Gel Scanning
- Tilsett 20 mL Laemmli utvalg buffer (2 ×) til 20 mL av renset merket virus og kok i 10 min. Sentrifuger prøvene i 30 sekunder for å fjerne enhver uløselig bunnfall. Dersom gjenværende kobber er til stede etter rensing, kan koke utvalget resultere i tykke striper av protein på SDS-PAGE gel, forårsaker problemer i løpet av visualisering. I dette tilfellet forgo koking av utvalget i dette trinnet.
- Fest gel kassetten til elektroforese cellen og legg kjører buffer. Last inn det nødvendige antall brønner med viral protein prøvene. Bruk en godt for å laste pre-StaiEkte lyd molekylvekt markører. Kjør gel for en time ved 200 V. Hold elektroforese cellen dekket med aluminiumsfolie i hele perioden for å redusere photobleaching av fluoroforen etiketten.
- For best mulig oppløsning og for å fjerne all ledig fluoroforen, la sporing fargestoff til å kjøre ut av gel under elektroforese. Stopp elektroforese og raskt overføre gelen til en fluorescerende gel skanner og skanne gel for fluorescens utslipp på riktig bølgelengde (574 nm for Tamra).
- Antallet fargestoffer konjugert til hver viral partikkel kan kvantifiseres ved å måle fluorescens av flere standard Tamra konsentrasjoner og sammenlikne med prøven fra trinn 7.3.
8. Representative Resultater
De observerte resultatene av SDS-PAGE & fluorescerende gel skanning av Tamra-konjugert AD5 er vist i figur 3. Selv om disse fluorescerende gel søk ble utført på prøver Modifisert via CuAAC, bør resultatet være sammenlignbare når prober er ligated via SPAAC. Disse gel skanninger viser at Aha merking resulterer i endring av de tre AD5 kapsid proteiner (Hexon, Penton, og fiber), mens sukker merking modifiserer bare Fiber kapsid protein. Videre en økning i Aha konsentrasjon (4 mm mot 32 mm) resulterer i en større grad av Aha innlemmelse, men også har vist seg å redusere smittsomhet. Tidligere resultater 7 indikerer at for AD5 produsert i 4mm Aha, omtrent 5% av eksponerte metionin nettsteder er Tamra-modifisert, med dette nummeret økende til 10% når 32 mM Aha brukes. Dette tilsvarer ca 280 og 510, henholdsvis, dye-merkede nettstedene per AD5 partikkel. Analyse av sukker-merking 1 har indikert at omtrent 22 av de 36 glykosylering steder på AD5 er okkupert av en azido sukker og senere merket med Tamra.
Hvis ti vevskulturstudier plater brukes til å produsere azide-modifisert AD5 som beskrevet i denne protokollen, 200 - skal 300 mL av azide-modifiserte virus fås fra den hvite bandet samlet i takt 3.6, med en titer på ca 1,5 × 10 12 partikler / ml. En vanlig problemer med denne prosedyren er fraværet av en viral band på denne rensingen, som kan tilskrives lav viral titer. Dette er vanligvis et resultat av infisere celler som enten er over-eller under-konfluent, eller ved å vaske bort celler - som løsner fra platen etter smitte - under skyllingen under trinn 1.
Figur 1. Protokoll oversikt. Azide-holdig Aha eller GalNAz først innlemmet i adenovirus partikler. Ligation med en fluorescerende alkyne sonde utføres deretter via "klikk" kjemi. Endelig er SDS-PAGE brukes til å demonstrere ligation av fluorescerende probe.
igure 2 "/>
Figur 2. Hemorroider av alkyne sonde på azide-modifisert virus via (a) SPAAC, (b) CuAAC etter de-oksygenert og (c) oxygenated atmosfære.
Figur 3. Fluorescent skanninger av SDS-PAGE av azide-merket adenovirus type 5 (AD5) etter CuAAC konjugering med Tamra-Alkyne. (A) Aha-merket AD5, ved hjelp av to konsentrasjoner av Aha. Merking synes å oppstå på adenovirus Hexon, Penton og Fiber kapsid proteiner, med omfanget av merking øker med økt Aha konsentrasjon. (B) Ac 4 GalNAz-merket adenovirus ser ut til å merkes bare på Fiber kapsid protein.
| Oppløsning | Forberedelse | Merknader |
| AD5 lagring buffer | 5 mM Tris-HCl buffer (pH 8,0) som inneholder 0,5 mm 2 MgCl, 50 mM NaCl, 25% (v / v) glyserol, og 0,05% (w / v) Bovine serum albumin (BSA) | Lagres ved -20 ° C |
| AD5 infeksjon buffer | 2% (v / v) bovint kalv serum, en × TC løsning, AD5 i lagring buffer (volum bestemmes ved hjelp av en MOI på 10 PFU / celle og en smittsomhet indeks på 1:20). Bring løsningen på det endelige volumet ved hjelp av TD buffer | AD5 konsentrasjon kan bestemmes via UV-absorpsjon. |
| TC løsning (200 ×) | 136 mm 2 CaCl, 100 mM MgCl 2 | Oppbevares ved 4 ° C |
| TD buffer | 137 mM NaCl, 5 mm KCl, 0,07 mm Na 2 4 HPO, og 25 mM Tris-HCl, 7,5 pH | Oppbevares ved 4 ° C |
| HEK 293 cellevekst medium | Dulbecco modifiserte Eagle s Medium (DMEM) supplert med 10% (v / v) storfe kalveserum (BCS) og 1% (v / v) Pen Strep | Oppbevares ved 4 ° C |
| Cys stamløsning (100 ×) | DMEM (-Met /-Cys) supplert med 200 mm L-Cysteine | Forbered frisk og filter med en 0,2-mikrometer steril sprøyte filter før bruk. |
| Aha stamløsning (25 ×) | DMEM (-Met /-Cys) supplert med 100 mm L-Azidohomoalanine | Forbered frisk og filter med en 0,2-mikrometer steril sprøyte filter før bruk. |
| Aha merking medium | DMEM (-Met /-Cys) supplert med 10% BCS, Aha stamløsning (1 ×), 2 mm L-Cysteine | Forbered frisk før bruk. Dette tilsvarer en 4 mm Concentration av Aha, selv om ulike konsentrasjoner kan brukes (se Representative resultater). |
| Met stamløsning (25 ×) | DMEM (-Met /-Cys) supplert med 100 mm L-metionin | Forbered frisk og filter med en 0,2-mikrometer steril sprøyte filter før bruk. |
| Met kontroll medium | DMEM (-Met /-Cys) supplert med 10% BCS, Met stamløsning (1 ×), 2 mm L-Cysteine | Forbered frisk før bruk. |
| Ac 4 GalNAz stamløsning (1000 ×) | 50 mM peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) i metanol | Oppbevares ved 4 ° C. Ac 4 GalNAz er en metabolsk forløper til GlcNAz. |
| Azido-sukker merking medium | 100 mL Ac 4 GalNAz stamoppløsning, 100 ml HEK 293 cellevekst medium | La metanol fordampe før du legger HEK 293 cellevekst medium. |
| Cesium chloride løsninger | CsCl oppløst i TD buffer: 1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml H 2 O) 1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml H 2 O) 1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml H 2 O) | Tetthetsgradienter for ultracentrifugation |
| Virus lagring buffer | Fosfatbufret saltvann (PBS), 7,2 pH, inneholder 0,5 mm 2 CaCl, 0,9 mM MgCl 2, og 10% (v / v) glyserol | Lagres ved -20 ° C |
| Tamra-BCN (SPAAC) merking løsning | Tamra-BCN i DMSO:
| Strain-forfremmet alkyne probe For SDS-PAGE, en viral titer på ca 10 12 partikler / ml er foreslått |
| Tamra-Alkyne (CuAAC) merking løsning | 50 mL av azide-modifisert AD5 i virus lagring buffer (N AD5 bestemmes som ovenfor), 1,5 mm batho phenanthroline disulfonate (dvs. 1,5 × endelig CuBr konsentrasjon), Tamra-Alkyne. Tamra-Alkyne molariteten (i M) bestemmes ved hjelp av: c Alk = 2 × 10 6 × (N AD5 / N Avo) (Slik at reaksjonsblandingen utarbeidet i trinn 5 inneholder 100 alkyne prober per virion) | Tris-buffer er kjent for å være en konkurransedyktig og hemmende ligand av kobber. 8 |
| Laemmli utvalg buffer (2 ×) | 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w / v) SDS, 20% (v / v) glyserol, 10% (v / v) 2-mercaptoethanol, og 0,004% (w / v) Bromophenol blå | |
| Kjører buffer | 187 mM glysin, 19 mM Tris-HCl, 3,5 mm SDS i H 2 O | Oppbevares ved 4 ° C |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utviklingen av chemoselective og bioorthogonal klikk reaksjoner, inkludert de av azider, er en hurtig utviklende område av forskning, og deretter er det et økende antall av disse reaksjonene å velge fra for bioconjugation applikasjoner. Vi har begrenset omfanget av denne protokollen til å omfatte bare to metoder som ble valgt på grunn av nytten sin i vår egen lab og kommersiell tilgjengelighet av alle reagenser.
I den første slike rute - stamme-forfremmet azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) - den alkyne finnes innenfor en cyclooctyne ring (figur 2a). Dette nylig utviklet metode kan gjennomføres under oksygenrikt atmosfære og uten behov for en kobber katalysator. 9,10 Inntil nylig en ulempe med denne metoden var den møysommelige syntese og redusert kommersiell tilgjengelighet av disse anstrengte alkyner sammenlignet med terminalen alkyner brukes i kobber (I)-katalysert azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), men er en voksende bibliotek av disse sonder nå kommersielt tilgjengelig (se tabell av reagenser). Av disse grunner har vi valgt SPAAC som metode for valg i denne protokollen.
Også beskrevet i denne protokollen er det ligation av Azide-modifiserte adenoviral partikler via CuAAC i deoxygenated atmosfæren ved hjelp bathophenanthroline disulfonic syre disodium salt (BDA) som en chelaterende agent (Figur 2b). Denne metoden er praktisk i at BDA katalysatoren er både kommersielt tilgjengelig og billig. Videre rapporterte avlingene er generelt høyest av de tilgjengelige metoder, og komplikasjoner som følge av den generasjonen av reaktive oksygenforbindelser (jfr. oksygenert CuAAC, nedenfor) i løsningen unngås. 8 er imidlertid kobber (I) katalysator kjent for å være cytotoksisk, 11 og spesialisert utstyr som kreves for å gjennomføre denne prosedyren kan avskrekke noen grupper fra å bruke den. Likevel finner vi denne metoden effektiv og nyttig foradenovirus modifisering.
En tredje nyttig metode for CuAAC har nylig blitt utviklet for å arbeide under oksygenfattige atmosfæriske forhold (figur 2c). 8 Denne metoden har de samme fordelene som BDA-chelater tilnærming, men bruker i stedet THPTA som en chelaterende agent for å imøtekomme atmosfærisk oksygen uten oksidative ødeleggelse av underlaget. En liten ulempe med denne tilnærmingen er dagens mangel på kommersiell tilgjengelighet av THPTA, selv om enkle synteser av denne chelaterende agenten har blitt rapportert. 8 Selv om vi ikke har utført dette ligation metoden på vårt eget system, ville THPTA / CuAAC forventes å produsere sammenlignbare resultatene til BDA / CuAAC, med den ekstra fordelen av oksygenert atmosfære toleranse.
Til tross for forsettlig utvikle denne protokollen rundt kommersielt tilgjengelige materialer, vi likevel ønsker å gjenkjenne kostnadsfordeler og økt fleksibilitet for å syntetisere denazider og alkyne prober som brukes her. Azidohomoalanine kan tilberedes på så lite som tre dager og for betydelig mindre enn kommersielle kilder. 6,12 Rapportert anstrengt alkyne preparater er vanskeligere 11 men har råd til større handlefrihet sonde valg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker å anerkjenne NSF for finansiering (CBET-0846259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 | |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 | |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 | |
| Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 | |
| Cell culture CO2 incubator | |||
| Hemocytometer | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) | |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | ||
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| Sterile needle, 18 gauge | |||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | |||
| Dewar flask | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Electrophoresis cell | |||
| Fluorescent gel scanner | |||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| Methanol | |||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | |||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| 1M HCl | |||
| Glycerol | |||
| Bovine Serum Albumin | |||
| L-cysteine | |||
| L-methionine | |||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | |||
| 2-mercapt–thanol | |||
| Glycine | |||
| Bromophenol blue | |||
| Cesium Chloride (CsCl) | |||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | |||
| Potassium Chloride (KCl) | |||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | |||
| Alkyne probe for CuAAC* | |||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 | |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | |||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 | |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs. |
|||
References
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
- Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
- Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
- Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
- Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
- Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
- Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
