Summary
Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için tasarlanmıştır
Abstract
Virüs partiküllerinin modifikasyonu gen tedavisi, onkolitik uygulamaları ve aşı geliştirme etkileyen yönelik muazzam bir potansiyele dikkat önemli bir miktar aldı. Çoğunlukla genetik tabanlı olduğu viral yüzeyler, değiştirmek amacıyla 1,2,3 Şu yaklaşımlar genellikle zayıflama muzdarip virüs üretim, enfektivite ve hücresel iletimi. 4,5 Kemoselektif click kimyası kullanarak, son derece esnek ve erişilebilir hem de kalan süre bu konularda sidesteps basit bir alternatif yaklaşım geliştirdik. 1,2
Bu protokolün amacı adenovirüs tip 5 parçacıkların yüzey değiştirme bioorthogonal tıklama kimyası ile etkinliğini göstermektir. Bu proteinler üzerine hedef moleküllerin, boyalar veya ilgi diğer moleküllerin Kemoselektif ligasyonu sağlayan bu iki adımlı süreç hem terapötik 1 veya analitik, 2,6 kullanılabilirazid etiketleri ile önceden etiketli. Bu yöntemin üç büyük avantajları (1) metabolik etiketleme viral spor üzerinde hiçbir etkisi, 1,7 az gösteriyor ki vardır (2) efektör ligandlar geniş bir yelpazede kullanılabilir, ve (3) oldukça hızlı, güvenilir ve kolay erişim. 1,2,7
Bu işlemin ilk adımda, adenovirüs partikülleri işlevsel bir azid (N-3) içermesi, her ikisi de azidohomoalanine (Aha, bir metiyonin vekil) veya doğal olmayan bir şeker O-bağlı N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ya taşıyan üretilir grubu. Azid-modifiye edilmiş virüs partiküllerinin saflaştırıldıktan sonra, flüoresan TAMRA parçasını içeren bir prob alkin önceden etiketlenmiş proteinleri veya glikoproteinleri bir Kemoselektif şekilde ligate edilir. Son olarak, bir SDS-PAGE ile analiz viral proteinlerin kapsid üzerine prob başarılı ligasyonu göstermek için gerçekleştirilir. Aha dahil tüm viral kapsid etiketlemek için gösterilirproteinleri (Hexon, Penton ve Fiber), sadece Fiber etiketlenmesi O-GlcNAz birleştirmeyecektir ederken.
Bu gelişen alanında, azid-alkin ligasyonu için birden çok yöntem başarıyla geliştirilmiştir, ancak biz en uygun olduğu tespit sadece iki tanesini burada gösterilmiştir - strain-terfi azid-alkin Siklokatılma (SPAAC) ve bakır-katalize azid-alkin Siklokatılma (CuAAC) deoxygenated atmosferi altında.
Protocol
Bu protokol başvurulan tüm medya, tamponlar ve çözümler hazırlanması için Tablo 1'e bakınız.
1. Aha-Etiketli Adenovirüs Üretimi
- Onlar 80 gelinceye kadar 37 ° C'de HEK 293 hücre büyüme ortamında tutulan insan embriyonik böbrek hücre onbir 100 mm doku kültürü yemekleri (HEK 293) (bkz. Tablo 1) hazırlayın -% 90 konfluense. (Not:.% 90 üzerinde konfluense ile Kültürler bulaştırmak ve istediğiniz gibi virüsler üretmek olmayabilir zor olabilir)
- İlk sonra tripsin-EDTA (1 ×) 1 ml bir dakika süreyle kuluçkaya hücreleri, TD tampon 5 ml ile bir kez durulama, büyüme medyumu kaldırarak tabaklar birinde hücreleri gevşetmek.
- HEK 293 hücre büyümesi orta 9 ml ekleyin ve bu yemeğin gelen hasat HEK 293 hücrelerinin sayısını saymak için bir hemositometre kullanın. Bir multiplicit kullanarak enfeksiyonu için gerekli adenovirus tip 5 (Ad5) miktarını hesaplamak için bu numarayı kullanın10 PFU / hücre enfeksiyon y (İçişleri Bakanlığı) değeri. Normal Ad5 için, enfektivite endeksi (partiküllerin sayısı ile bulaşıcı parçacıklar oranında) tipik olarak 1:20 olması için hesap.
- Enfeksiyonuna tampon 10 ml hazırlayın.
- Yavaşça TD tamponu, 5 ml ile yıkama, daha sonra kalan on kültür kaplarından HEK 293 hücre büyümesini orta kaldırın. 1 saat için 37 ° C'de her çanağı ve inkübe enfeksiyon tampon 1 ml ekleyin. Bu enfeksiyon dönemde, yavaşça 15 dakika aralıklarla tarafına her kültürün çanak tarafında sallayın.
- Enfeksiyondan sonra, 18 saat süreyle 37 ° C'de taze HEK 293 hücre büyümesi, orta ve inkübe 9 ml ilave edilir.
- Aha etiketleme ortamı (veya denetimi için kontrol orta Met), 100 ml hazırlayın. Etiketleme medya hazırlamadan önce bir 0.2-um steril enjektör filtre ile yoğun stok solüsyonlar filtre emin olun.
- Dikkatlice (böylece bulaşmış hücrelerin yıkayacak değil) 18 saat sonra bir HEK 293 hücre büyümesi orta kaldırmaknd TD tampon 5 ml her kültürün çanak yıkayın.
- TD tampon yıkama solüsyonu çıkarın ve her kültürün çanak Aha etiketleme orta 10 ml ekleyin. Bir kontrol için, metionin kontrolü orta bu aşamada yerine Aha etiketlenmesi ortamının kullanılması gerekir.
- 6 saat boyunca 37 ° C'da medium etiketlemede enfekte olmuş hücreler inkübe. Etiketleme 12 arasındaki herhangi bir zamanda yapılabilir - 24 saat post-enfeksiyonu, ancak süresi 6 saat daha uzun olmamalıdır. Sağlanması enfektivite önemli ölçüde azalarak değilken bu aralık viral yapısal protein çeviri ile örtüşen maksimize etmek için tespit edilmiştir. 7
- Dikkatle etiketleme orta kaldırmak böylece hücreleri bozmak için değil. Her bir çanak taze HEK 293 hücre büyümesi orta 10 ml ilave edilir ve bir başka 18 saat süreyle 37 ° C'de inkübe edilir hücreleri. Bu basamak sırasında enfekte olmuş hücreler kaybı minimize etmek için, bunun tamamıyla etiketleme çözeltisi kaldırmak için gerekli değildir. HEK 293 hücre büyüme ortamı M aşırı miktarda içerirve hangi herhangi bir kalıntı Aha outcompete olacaktır.
- Saflaştırma için 3. adıma geçin.
2. Azido-Şeker-Etiketli Adenovirüs Üretimi
- Kadar ve adım dahil olmak üzere 1.5 Aha-Etiketli Adenovirüs üretimi başlıklı prosedürü takip edin.
- Azido-şeker etiketleme orta 100 ml hazırlayın.
- 44 saat boyunca 37 ° C'de taze Azido-etiketleme şeker, orta ve inkübe 10 ml ile hücreleri kapsar.
3. Azid-Etiketli adenoviral Parçacıklarının Arıtma
- Her kültürün çanak ve konik tüpler için transfer enfekte hücre ile birlikte medya çıkarın. 4 azından 10 dakika süreyle 2000 g'de santrifüje ° C. Süpernatantı ve TD tampon pelet (10 yemekleri başına TD tampon 8 ml kullanarak) tekrar süspansiyon.
- Sıvı nitrojen ve bir 37 ° C arasında bir su banyosunda Dewar şişeye kullanılarak tekrarlandı (3 ya da daha fazla) dondurma-eritme çevrimi ile enfekte olmuş hücreler Lyse. 10 dk için 2000 g'de santrifüje4 ° C'de süpernatan gelen hücre enkazları ayırmak.
- Önce bir Ultra temizle santrifüj tüpüne 1.25 g / ml CsCl 2.5 ml çözelti pipet ile bir CsCl yoğunluk gradyanı santrifüj tüpüne hazırlayın. Sonra, yavaş gradyanı arayüz rahatsız özen, 1.4 g / ml solüsyon CsCl 2.0 ml eklemek için tüpün altında konumlandırılmış olan ucu ile bir pipetle kullanımı.
- CsCl yoğunluk gradiyenti tüpün üstüne adımı 3.2 süpernatan Pipeti ve tüp doldurmak için gerekli eklentiyi TD tampon durumunda. 15 de 1 saat süre ile 125,000 g azından bir sallanan bir kova rotor ° C bir ultrasantrifüjdeki in örnekleri santrifüjlenir.
- Ultrasantrifüj tamamlanmasından sonra, virüs partiküllerinin, iki CsCl çözeltilerinin arayüzüne bir kalın beyaz bir bant olarak görülmelidir. Çözeltisi damla damla akmasını sağlamak için steril bir iğne ile borunun alt kısmında küçük bir delikli edin.
- Kalınlığında beyaz bant toplayın, hangi dolaşıyor, etiketli Ad5 parçacıklar içermelidirg bakım aşırı CsCl çözümü dışlamak için. Virüs katman üzerinde açılımının teşvik edecek hücresel proteinlerin toplama kaçının. Ayrıca biraz kalın beyaz virüs bant üzerinde hafif bir tabaka oluşturur boş virion capsids değildir.
- İsteğe bağlı olarak, etiketlenmiş Ad5 partiküllerin üzerindeki bir nihai saflaştırma gerçekleştirmek. Adım 3,6 bir 4-ml ultrasantrifüjdeki tüpüne toplanan fraksiyonu ekleyin ve 1.35 g / ml CsCl çözeltisi ile tüp doldurun. 15 ° C'de 18 saat süreyle 125,000 g'de santrifüje ve adımları 3.5 ve 3.6 'da anlatıldığı gibi, borunun ortasında oluşturan kalın beyaz bir bant toplamak. (Viral titrenin düşükse, beyaz bir bant ikinci santrifüjlemeden sonra görünür olmayabilir, ve etiketli virüs kurtarmak için mümkün olmayacaktır dikkat ediniz).
- Uzun süreler boyunca virüs partiküllerinin depolanması için, toplanan virüsü ekstresinin diyaliz tamponu virüsü depolama karşı gerçekleştirilmelidir. -80 ° C'de diyalizlenmiş virüs numunelerinin Mağaza
4. LiGerilme-Promoted Azid-Alkinler Siklokatılma kullanarak Alkinler Probları Modifiye adenoviral Parçacıkların kolayca dolaşmak (SPAAC)
- Virüs depolama tampon içinde azit-değiştirilmiş Ad5 50 ul'lik bir çözeltisine, SPAAC etiketleme çözeltinin 0.25 ul ekleyin. (Ticari olarak mevcut gergin alkinlerin venders listesi için reaktiflerin tabloya bakın).
- Gece boyunca oda sıcaklığında devam etmek için gerginlik-terfi Siklokatılma tepki verin. Işığa duyarlı bir sonda (örn. TAMRA) kullanılması durumunda, alüminyum folyo ile tepkime kabına kapsamaktadır.
- 6. adıma göre etiketli virüs arındırın.
5.. Deoksijenize Atmosferde Bakır (I)-Katalizli Azid-Alkinler Siklokatılma (CuAAC) kullanarak Alkinler Probları Modifiye adenoviral Parçacıklarının Ligasyonu
- Bakır yerine 7,2 mg (I), bir Eppendorf tüpüne bromür (CuBr) toz, alüminyum folyo ile kaplanmıştır.
- Ikinci bir Eppendorf tüpüne DMSO pipetle 1 ml.
- HazırlamakÜçüncü bir Eppendorf tüpüne CuAAC etiketleme solüsyonu 50 ul. Alkin prob ışığa duyarlı ise alüminyum folyo ile sarın (örneğin TAMRA-Alkinler).
- 6 saat boyunca bir deoxygenated eldiven çanta içinde üç Eppendorf tüpleri, kapağını açıp, yerleştirin. Tüm numuneler CuAAC reaksiyon tamamlanıncaya kadar eldiven çanta içinde kalmalıdır.
- 5,4 adıma uygun olarak oksijeni edilmiş, her ikisi de, CuBr tozunun 7.2 mg DMSO 1 ml ilave edilerek CuBr bir 50 × stok çözeltisi hazırlayın.
- 5,4 adıma uygun olarak oksijeni edilmiştir CuAAC etiketleme çözeltisi, 50 ul Bu CuBr stok solüsyonu 1 ul pipet ile CuAAC reaksiyona girerler. Eldiven çanta içinde 12 saat devam etmek için tepki verin.
- 6. adıma göre etiketli virüs arındırın.
6. Etiketli Virüs Parçacıkların Arıtma ve Depolama
- Centri-Eyl jel filtrasyon Spin kullanarak c etiketli virüs numunelerinin arındırınüreticinin yönergelerine Virüs Depolama Buffer ile dengelenmiş olumns.
- Alternatif olarak, saflaştırma Virüs Depolama tampona karşı diyaliz ile gerçekleştirilebilir.
- Etiketli virüs partiküllerinin -80 ° C'de saklanabilir
7. Etiketli Adenovirüs ve Floresanlar Jel Tarama SDS-PAGE
- 10 dakika süre ile etiketlenmiş virüsü ve kaynamaya saflaştırılmış 20 ul 20 ul Laemmli numune tamponu (2 x) eklenir. Çökeltileri herhangi bir çözünmeyen kaldırmak için 30 saniye için örnekleri santrifüjleyin. Kalan bakır arıtma sonrası varsa, örnek kaynatarak görselleştirme sırasında zorluk, SDS-PAGE jel protein kalın çizgiler neden olabilir. Bu durumda, bu basamakta örneğin kaynama gelmemektedir.
- Elektroforez hücre jel kaset takın ve çalışan tampon ekleyin. Viral protein örnekleri ile kuyu gerekli sayıda yükleyin. Iyi öncesi stai yüklemek için birini kullanınned molekül ağırlığı işaretleri. 200, 1 saat boyunca jel çalıştırın V. süresi boyunca alüminyum folyo kaplı elektroforez hücre fluorofor etiketin photobleaching azaltmak için tutun.
- En iyi çözünürlük ve tüm özgür fluorofor kaldırmak için, izleme boya elektroforez sırasında jel dışında çalışmasına izin verin. Elektroforez durdurun ve hızlı bir floresan jel tarayıcıya jel aktarmak ve uygun dalga boyu (TAMRA için 574 nm) floresans emisyon için jel tarayın.
- Her bir partikül viral konjuge boya moleküllerin sayısı çeşitli standart TAMRA konsantrasyonlarının ölçülmesi ve floresans adım 7.3 örnek ile karşılaştırılarak ölçülebilir.
8. Temsilcisi Sonuçlar
SDS-PAGE ve TAMRA-konjuge Ad5 floresan jel tarama gözlemlenen Sonuçlar Şekil 3 içerisinde gösterilmiştir. Bu fluoresan jel taramaları örnekleri modifiye yapıldı rağmenprobları ile SPAAC ligate edilir olduğunda CuAAC yoluyla tanımladı, sonuç olarak benzer olması gerekir. Bu jel taramaları gösteriyor ki üç Ad5 kapsid proteinleri (Hexon, Penton ve Fiber) modifikasyonu ile Aha etiketleme sonuçları, şeker etiketleme sadece Fiber kapsid proteini değiştirir iken. Dahası, konsantrasyon Aha bir artış (4 mM vs 32 mM) Aha esas daha büyük bir ölçüde neden olan, fakat aynı zamanda enfektivite azaltmak için gösterilmiştir. Önce sonuçları 7 4mm üretilen Ad5 için Aha, maruz metiyonin sitelerin yaklaşık% 5 32 mM Aha kullanıldığında bu sayı% 10 artış ile, TAMRA-değiştirilmiş olduğunu göstermektedir. Bu sırasıyla yaklaşık 280 ve 510, Ad5 parçacık başına boya etiketli siteler karşılık gelir. Şeker-etiketleme 1 analizi kabaca 22 Ad5 üzerinde 36 glikozilasyon sitelerin bir azido şeker tarafından işgal ve daha sonra TAMRA etiketli belirtti.
Tarif edildiği gibi on doku kültür plakaları azit-değiştirilmiş Ad5 üretmek için kullanıldığı takdirde Bu protokolde, 200 - azit-değiştirilmiş virüsünün 300 ul yaklaşık 1.5 bir titresi x 10 12 parçacıklar / ml, 3.6 adım toplanan beyaz bir bant elde edilmelidir. Bu yöntemin yaygın bir zorluk düşük viral titre atfedilebilir bu arıtma adımı, bir viral grubun olmamasıdır. Enfeksiyondan sonra plakadan gevşetilmiş olur - ki - adım 1 sırasında yıkarken Bu genellikle aşırı ya da altında birleşmiş, ya da hücreleri yıkayarak olan hücrelerini enfekte bir sonucudur.
Şekil 1. Protokol genel bakış. Azid içeren Aha veya GalNAz ilk adenovirüs partikülleri içine dahil edilmiştir. Bir floresan alkin prob ile ligasyon sonra "klik" kimyası ile yapılır. Son olarak, SDS-PAGE flüoresan prob ligasyonu göstermek için kullanılır.
igure 2 "/>
Şekil 2,. Üzerine alkin prob Ligation azit-değiştirilmiş de-oksijenli altında (a) SPAAC, (b) CuAAC ve (c) oksijenli bir atmosfer üzeri virüsü.
Şekil 3. TAMRA-Alkinler ile CuAAC konjugasyon sonra azid etiketli adenovirus tip 5 (Ad5) SDS-PAGE Floresan tarar. (A) Aha iki farklı konsantrasyonu kullanılarak, Ad5 Aha-etiketli. Etiketleme artan Aha konsantrasyonu ile artan etiketleme derecesi ile, adenovirüs Hexon, Penton ve Fiber kapsid proteinleri meydana görünüyor. (B) Ac 4 GalNAz-etiketli adenovirüs sadece Fiber kapsid protein etiketli gibi görünüyor.
| Çözüm | Hazırlık | Notlar |
| Ad5 depolama tamponu | 5 mM Tris-HCl tampon (pH 8.0) ihtiva eden 0.5 mM MgCl2, 50 mM NaCl,% 25 (v / v) gliserol, ve% 0.05 (a / h) Bovine Serum Albumin (BSA) | -20 ° C'de deposunda |
| Ad5 enfeksiyonu tampon | 2% (v / v) sığır serumu, 1 × TC çözeltisi, Ad5 depolama tampon içinde (MOI bir 10 PFU / hücre ve 01:20 bir enfektivite indeksi kullanılarak belirlenir hacmi). TD tamponu kullanılarak nihai hacme çözüm getirmek | Ad5 konsantrasyon UV absorpsiyon yoluyla belirlenebilir. |
| TC çözüm (200 ×) | 136 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 | 4 at ° C'nin |
| TD tampon | 137 mM NaCl, 5 mM KCI, mM Na 2 HPO 4, ve 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 0.07 | 4 at ° C'nin |
| HEK 293 hücre büyüme ortamı | Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 10% (v / v) sığır serumu (BSC) ve 1% (v / v) Pen Strep ile desteklenmiş | 4 at ° C'nin |
| Cys stok solüsyonu (100 ×) | DMEM (-Met /-Cys) 200 mM L-sistein ile desteklenmiş | Kullanmadan önce bir 0.2-um steril şırınga filtresi ile taze ve filtre hazırlayın. |
| Aha stok solüsyonu (25 ×) | DMEM (-Met /-Cys) 100 mM L-Azidohomoalanine ile desteklenmiş | Kullanmadan önce bir 0.2-um steril şırınga filtresi ile taze ve filtre hazırlayın. |
| Aha etiketleme orta | DMEM (-Met /-Cys) 2 mM L-sistein% 10 MKC, Aha stok solüsyonu (1 x) ile desteklenmiş | Kullanmadan önce taze hazırlayın. Bu, bir 4 mM c tekabülAHA oncentration, farklı konsantrasyonlarda (Temsilcisi Sonuçlar bakınız) kullanılmakla beraber. |
| Met stok solüsyonu (25 ×) | DMEM (-Met /-Cys) L-Metionin 100 mM ile desteklenmiş | Kullanmadan önce bir 0.2-um steril şırınga filtresi ile taze ve filtre hazırlayın. |
| Met kontrolü orta | DMEM (-Met /-Cys) stok solüsyonu (1 x), Met,% 10 MKC ile desteklenmiş 2 mM L-sistein | Kullanmadan önce taze hazırlayın. |
| Ac 4 GalNAz stok solüsyonu (1.000 ×) | Metanol içinde 50 mM N-peracetylated azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) | 4 ° C'de depolamak Ac 4 GalNAz GlcNAz bir metabolik öncüsüdür. |
| Azido-şeker etiketleme orta | 100 ul Ac 4 GalNAz stok çözeltisi, 100 ml HEK 293 hücre büyüme ortamı | Metanol HEK 293 hücre büyümesi orta eklemeden önce buharlaşmasına izin verin. |
| Sezyum klorür çözümler | CsCl TD tampon içinde çözülmüş: 1.25 g / ml (18.08 g / 50 ml H2O) 1.35 g / ml (25.60 g / 50 ml H2O) 1.40 g / ml (31.00 g / 50 ml H2O) | Ultrasantrifüj için Yoğunluk gradyanlar |
| Virüs depolama tamponu | Fosfat CaCl2, 0.9 mM MgCl2 ve% 10 (v / v) gliserol ihtiva eden 0.5 mM, tuzlu su (PBS), pH 7.2 tampon | -20 ° C'de deposunda |
| TAMRA-BCN (SPAAC) etiketleme çözümü | DMSO içinde TAMRA-BCN:
| Gerilme-terfi alkin prob SDS-PAGE ile, yaklaşık 10 12 parçacıklar / ml 'lik bir viral titrenin önerilmiştir için |
| TAMRA-Alkinler (CuAAC) etiketleme çözümü | Virüs depolama tampon içinde azit-değiştirilmiş Ad5 (N Ad5 yukarıdaki gibi belirlenmiştir) 50 ul, 1.5 mM Batho fenantrolin disülfonat (yani 1.5 × son CuBr konsantrasyon), TAMRA-Alkinler. TAMRA-Alkinler molarite (M) kullanılarak belirlenmektedir: c Alk = 2 × 10 × 6 (N Ad5 / N Avo) (5. Basamak hazırlanan tepkime karışımı virion başına 100 alkin probları içerir, böylece) | Tris tampon bakır, rekabetçi bir önleyici ve ligand olarak da bilinir. 8 |
| Laemmli numune tamponu (2 ×) | 125 mM Tris-HCl (pH 6.8),% 4 (w / v) SDS, 20% (v / v) gliserol,% 10 (v / v) 2-merkaptoetanol, ve% 0.004 (w / v) Bromofenol mavi | |
| Tampon Koşu | 187 mM glisin, 19 mM Tris-HCl, H2O, 3,5 mM SDS | 4 at ° C'nin |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Azidler olanlar dahil Kemoselektif ve bioorthogonal tıklayın reaksiyonlar, gelişimi bir araştırma hızla gelişen bir alandır ve sonradan bioconjugation uygulamalar için seçim için bu reaksiyonlar giderek artan sayıda vardır. Biz kendi laboratuar ve tüm reaktifler ticari durumu çünkü onların kullanışlılığı seçildi yalnızca iki yöntem eklemek için bu protokol kapsamında sınırlama getirdik.
Bu tür ilk rotada - strain-terfi azid-alkin Siklokatılma (SPAAC) - alkin bir cyclooctyne halkası (Şekil 2a) içinde bulunur. Bu, son zamanlarda-geliştirilmiş yöntemi oksijenli bir atmosfer altında, bir bakır katalizör için gerek olmaksızın yürütülebilir. 9,10 Yakın zamana kadar, bu yöntem, bir dezavantajı, terminal alkinlerin kullanılan ile karşılaştırıldığında, bu süzme alkinlerin zahmetli sentezi ve azaltılmış ticari olarak durumu , bakır (I) katalizli azit-alkin siklo (CuAAC), ancak bu problar büyüyen bir kütüphane (reaktiflerin tabloya bakınız) artık piyasada mevcuttur. Bu nedenlerle, biz bu protokolü tercih yöntemi olarak SPAAC seçtiniz.
Ayrıca, bir şelatlama maddesi (Şekil 2b) gibi bathophenanthroline disülfonik asit disodyum tuzu (BDA) kullanılarak oksijeni giderilmiş atmosferinde CuAAC yoluyla azit-değiştirilmiş adenoviral parçacıkların ligasyon olup, bu protokolde tarif. Bu yöntem, BDA katalizör, ticari olarak mevcuttur ve pahalı olmayan hem de olduğunu da uygundur. Dahası, verim genellikle mevcut yöntemlerden yüksek olduğu, ve çözelti içinde reaktif oksijen türlerinin oluşumunu (cf. Aşağıda, CuAAC oksijenli) kaynaklanan komplikasyonlar önlenir bildirilmiştir. 8 Bununla birlikte, bakır (I) katalizör sitotoksik olduğu bilinmektedir, 11 ve bu prosedürün uygulanması için gerekli özel ekipman kullanarak bazı gruplar caydırmak olabilir. Bununla birlikte, biz bu yöntemi verimli ve faydalı bulabilirsinizAdenovirüs modifikasyonu.
CuAAC üçte yararlı bir yöntem son zamanlarda oksijenli atmosferik koşullar (Şekil 2c) altında çalışmak üzere geliştirilmiştir. 8 Bu yöntem BDA-şelat yaklaşım olarak aynı yararları sahiptir ancak oksidatif yıkımı olmadan atmosferik oksijen karşılamak için bir kıskaç ajan olarak yerine THPTA kullanır substrat. Bu şelatlama maddesinin basit sentez bildirilmiş olmasına rağmen bu yaklaşımın küçük bir dezavantajı, THPTA ticari durumu mevcut olmamasıdır. 8 bizim kendi sisteminde bu ligasyon yöntemi yapmamış olsa da, THPTA / CuAAC karşılaştırılabilir üretmek için beklenir oksijenli ortamda hoşgörü eklendi rahatlığı ile BDA / CuAAC, sonuçları.
Kasıtlı olarak piyasada bulunan malzemeler etrafında bu protokol gelişmekte rağmen, biz hala maliyet avantajları ve sentezleme esneklik tanımak isteyenazidler ve burada kullanılan alkin sondalar. Azidohomoalanine kadar az üç gün ve ticari kaynakları önemli ölçüde daha az hazırlıklı olabilirsiniz. 6,12 gergin alkin hazırlıkları daha 11 zor ama prob seçimi özgürlüğü daha göze olduğu bildirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz finansman (CBET-0.846.259) için NSF kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 | |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 | |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 | |
| Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 | |
| Cell culture CO2 incubator | |||
| Hemocytometer | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) | |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | ||
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| Sterile needle, 18 gauge | |||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | |||
| Dewar flask | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Electrophoresis cell | |||
| Fluorescent gel scanner | |||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| Methanol | |||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | |||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| 1M HCl | |||
| Glycerol | |||
| Bovine Serum Albumin | |||
| L-cysteine | |||
| L-methionine | |||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | |||
| 2-mercapt–thanol | |||
| Glycine | |||
| Bromophenol blue | |||
| Cesium Chloride (CsCl) | |||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | |||
| Potassium Chloride (KCl) | |||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | |||
| Alkyne probe for CuAAC* | |||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 | |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | |||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 | |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs. |
|||
References
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
- Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
- Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
- Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
- Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
- Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
- Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
