Summary
صممت جزيئات الفيروس الغدي لاحتواء إما غير طبيعي التماثلية الأحماض الأمينية azidohomoalanine أو السكر azido
Abstract
وقد تلقت لتعديل جزيئات الفيروس قدرا كبيرا من الاهتمام لإمكانياتها الهائلة في التأثير على العلاج الجيني، والتطبيقات oncolytic وتطوير لقاح. 1،2،3 النهج الحالية لتعديل أسطح الفيروسية، والتي هي في معظمها على أساس علم الوراثة، وغالبا ما تعاني من التوهين تنبيغ. 4،5 الإنتاج الفيروس، والعدوى والخلوية عن طريق chemoselective الكيمياء نقرة، قمنا بتطوير نهج بديل مباشر التي الالتفاف حول هذه القضايا على حد سواء في حين تبقى مرنة للغاية ويمكن الوصول إليها. 1،2
الهدف من هذا البروتوكول هو للتدليل على فعالية استخدام bioorthogonal كيمياء فوق لتعديل سطح من نوع اتش 5 الجسيمات. ويمكن استخدام هذه عملية من خطوتين سواء على المستوى العلاجي 1 أو تحليلي، 2،6 لأنها تسمح لربط chemoselective من الجزيئات التي تستهدف والأصباغ أو الجزيئات الأخرى ذات الاهتمام على البروتيناتمسبقا مع وصفت به أزيد. المزايا الثلاث الرئيسية لهذه الطريقة هي أن (1) وضع العلامات الأيضية يوضح شيئا يذكر لولا تأثير على اللياقة البدنية الفيروسية، 1،7 (2) يمكن أن تستخدم مجموعة واسعة من يغاندس المستجيب، و (3) فهي سريعة بشكل ملحوظ، وموثوق بها يسهل الوصول إليها. 1،2،7
في أول خطوة من هذا الإجراء، ويتم إنتاج جزيئات اتش تحمل إما azidohomoalanine (آها، مركب ميثيونين) أو السكر غير طبيعي O-N-مرتبط azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz)، وكلاهما والتي تحتوي على أزيد (N-3) وظيفية المجموعة. بعد تنقية للجزيئات الفيروس أزيد المعدلة، وligated تحقيقا آلكاين يحتوي على شاردة طمرة فلوري بطريقة chemoselective إلى البروتينات قبل المسمى أو بروتينات سكرية. أخيرا، يجري تحليل SDS-PAGE للتدليل على الربط الناجح للمسبار على البروتينات قفيصة الفيروسية. ويرد آها التأسيس لتسمية جميع قفيصة الفيروسيةالبروتينات (Hexon، بينتون والألياف)، في حين أن نتائج دمج O-GlcNAz في وضع العلامات من الألياف فقط.
في هذا المجال المتطور، وقد تم طرق متعددة لأزيد-آلكاين ربط نجحت في تطوير، ولكن فقط وهما أننا وجدنا أن يكون الأكثر ملاءمة وأثبت هنا - السلالة التي تروج لها أزيد-آلكاين الاضافه الحلقيه (SPAAC) والنحاس والمحفز الاضافه الحلقيه أزيد-آلكاين (CuAAC) تحت جو امؤكسج.
Protocol
الرجوع إلى الجدول رقم 1 لإعداد جميع المخازن، ووسائل الإعلام والحلول المشار إليها في هذا البروتوكول.
1. إنتاج آها المسمى اتش
- تعد زراعة الأنسجة 11 100 ملم أطباق من خلايا الكلى البشرية الجنينية (كلوة الجنين البشري 293) المحافظة على كلوة الجنين البشري في 293 خلية متوسطة النمو (انظر الجدول رقم 1) في 37 درجة مئوية حتى أنها وصلت إلى 80 - 90٪ confluency. (ملاحظة: مع الثقافات confluency أكثر من 90٪ قد يكون من الصعب نقل العدوى، وربما لا تنتج فيروسات على النحو المرغوب فيه)
- ترخي الخلايا في واحدة من الأطباق من خلال إزالة أول متوسط النمو، والشطف مرة واحدة مع 5 مل من عازلة TD، ثم احتضان خلايا لمدة دقيقة في 1 مل من EDTA-التربسين (1 ×).
- إضافة 9 مل من 293 كلوة الجنين البشري خلية متوسطة النمو، واستخدام عدادة الكريات لحساب عدد من الخلايا تحصد 293 كلوة الجنين البشري من هذا الطبق. استخدام هذا الرقم لحساب المبلغ من نوع اتش 5 (Ad5) اللازمة للعدوى باستخدام multiplicitذ من العدوى (وزارة الداخلية) بقيمة 10 PFU / الخلية. حساب لحقيقة أن لAd5 طبيعي، ومؤشر العدوى (نسبة الجزيئات المعدية إلى العدد الكلي للجسيمات) هو عادة 1:20.
- تحضير 10 مل من عازلة عدوى.
- إزالة ببطء نمو الخلية كلوة الجنين البشري 293 متوسطة من أطباق ثقافة 10 المتبقية، ثم غسل مع 5 مل من عازلة TD. إضافة 1 مل من عازلة العدوى إلى كل طبق واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. خلال هذه الفترة العدوى، ويهز بلطف كل جانب طبق ثقافة إلى جانب 15 دقيقة في فترات.
- بعد الإصابة، إضافة 9 مل من جديد كلوة الجنين البشري 293 خلية متوسطة النمو واحتضان على 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
- تحضير 100 مل من متوسط العلامات آها (أو التقى المتوسطة مراقبة للسيطرة). مما لا شك فيه لتصفية مخزون حلول مركزة مع فلتر 0.2 ميكرون محقنة معقمة قبل إعداد وسائل الاعلام وصفها.
- بعناية (حتى لا يغسل الخلايا المصابة) إزالة نمو الخلية كلوة الجنين البشري 293 المتوسطة بعد 18 ساعة 1الثانية وغسل كل طبق ثقافة مع 5 مل من عازلة TD.
- إزالة غسل العازلة TD حل وإضافة 10 مل من متوسط العلامات آها على كل طبق الثقافة. لعنصر تحكم، يجب استخدام ميثيونين المتوسطة سيطرة بدلا من متوسط العلامات آها على هذه الخطوة.
- احتضان الخلايا المصابة في وصفها في المتوسط 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعة. يمكن أن يتم وضع العلامات من أي وقت بين 12 - 24 ساعة بعد الاصابة ولكن لا ينبغي أن تكون أطول من 6 ساعات في المدة. وقد تم تحديد هذا الفاصل الزمني لتحقيق أقصى قدر من التداخل مع الفيروس ترجمة البروتين الهيكلي في حين لم يتم التأكد العدوى تقلصت إلى حد كبير. 7
- إزالة بعناية وسيلة وسم حتى لا تعطل الخلايا. إضافة 10 مل من جديد كلوة الجنين البشري 293 خلية متوسط النمو إلى كل طبق واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية لمدة ساعة 18. لتقليل الخسائر في الخلايا المصابة خلال هذه الخطوة، فإنه ليس من الضروري لإزالة حل الوسم تماما. نمو الخلية كلوة الجنين البشري يحتوي على 293 متوسطة وجود فائض من Mوآخرون والتي سوف تكومبيتي أي آها المتبقية.
- انتقل إلى الخطوة 3 لتنقية.
2. إنتاج اتش Azido-السكر المسمى
- اتبع الإجراء بعنوان إنتاج اتش آها المسمى وبما يصل إلى 1،5 خطوة.
- تحضير 100 مل من متوسط العلامات Azido السكر.
- تغطي الخلايا مع 10 مل من جديد متوسط العلامات Azido السكر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 44 ساعة.
3. تنقية الجزيئات أزيد المسمى الفيروسة الغدانية
- إزالة وسائل الإعلام جنبا إلى جنب مع الخلايا المصابة من كل صحن والثقافة، ونقل إلى أنابيب مخروطية الشكل. الطرد المركزي في 2000 جرام لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف وresuspend لبيليه في عازلة TD (باستخدام 8 مل من عازلة TD 10 في المائة أطباق).
- ليز الخلايا المصابة بواسطة المتكررة دورات تجميد ذوبان الجليد (3 أو أكثر) باستخدام قارورة ديوار من النيتروجين السائل والمياه 37 درجة مئوية حمام. الطرد المركزي في 2000 جرام لمدة 10 دقيقةفي 4 درجات مئوية في فصل حطام خلية من طاف.
- إعداد التدرج كثافة CSCL أنبوب الطرد المركزي التي pipetting 1 2.5 مل من محلول غ / مل 1،25 CSCL الى أنبوب الطرد المركزي واضح جدا. المقبل، واستخدام ماصة مع طرفها وضعه على الجزء السفلي من أنبوب لإضافة ببطء 2.0 مل من 1،4 جم / مل حل CSCL، مع الحرص على عدم تعكير صفو اجهة التدرج.
- ماصة طاف من 3،2 خطوة على رأس أنبوب كثافة التدرج CSCL، وإذا لزم الأمر العازلة TD إضافة لملء أنبوب. منبذة العينات في الدوار دلو يتأرجح في 125000 ز لمدة 1 ساعة على 15 درجة مئوية في منبذة فائقة.
- بعد الانتهاء من تنبيذ فائق، ينبغي أن جزيئات الفيروس تكون واضحة مثل فرقة بيضاء سميكة في واجهة من الحلين CSCL. جعل ثقب صغير في الجزء السفلي من أنبوب مع إبرة معقمة للسماح للحل لاستنزاف قطرة قطرة.
- جمع الفرقة بيضاء سميكة، والتي ينبغي أن تحتوي على جزيئات تسمى Ad5، تاكينز الرعاية لاستبعاد حل CSCL الزائدة. تجنب جمع البروتينات الخلوية التي سوف ألب فوق طبقة الفيروس. وبالإضافة إلى ذلك استبعاد capsids الفيريون الفارغة التي تشكل أخف طبقة أعلى قليلا من الفرقة فيروس بيضاء سميكة.
- اختياريا، تنفيذ عملية تنقية النهائي على جزيئات Ad5 المسمى. إضافة جزء الخطوة التي تم جمعها من 3.6 إلى أنبوب منبذة فائقة 4 مل وملء الأنبوب مع 1.35 جم / مل حل CSCL. الطرد المركزي في 125000 ز لمدة 18 ساعة عند 15 درجة مئوية، وجمع الفرقة سميك أبيض التي تشكل في منتصف أنبوب كما هو موضح في خطوات 3.5 و 3.6. (لاحظ أنه إذا كان عيار الفيروسية منخفضة، عصابة بيضاء قد لا تكون مرئية بعد الطرد المركزي الثانية، وأنه لن يكون من الممكن استعادة الفيروس المسمى).
- لتخزين جزيئات الفيروس على مدى فترات طويلة من الوقت، ينبغي القيام غسيل الكلى للاستخراج الفيروس التي تم جمعها ضد العازلة تخزين الفيروس. تخزين عينات فيروس مدال في -80 درجة مئوية.
4. لىgation من الجزيئات الفيروسة الغدانية التعديل مع تحقيقات آلكاين طريق الانفعال التي تروج لها أزيد-آلكاين الاضافه الحلقيه (SPAAC)
- في التوصل إلى حل من 50 ميكرولتر من أزيد المعدلة Ad5 في عازلة تخزين الفيروس، إضافة 0.25 ميكرولتر من حل وضع العلامات SPAAC. (راجع الجدول الكواشف للحصول على قائمة من بائعى الألكاينات المتوترة متوفرة تجاريا).
- السماح للتفاعل الاضافه الحلقيه السلالة التي تروج لها والمضي قدما بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. إذا تم استخدام مسبار الحساسة للضوء (مثل تمرة)، وتغطية وعاء التفاعل مع رقائق الألومنيوم.
- تنقية الفيروس المسمى وفقا لالخطوة 6.
5. ربط الجزيئات الفيروسة الغدانية التعديل مع تحقيقات آلكاين عن طريق النحاس (I)، كحافز لأزيد-آلكاين الاضافه الحلقيه (CuAAC) في جو غير المؤكسج
- مكان 7،2 ملغ من النحاس (I) بروميد (CuBr) مسحوق في أنبوب إيبندورف، مع تغطية احباط الالومنيوم.
- ماصة 1 مل من DMSO في أنبوب إيبندورف الثانية.
- إعداد50 ميكرولتر من حل وضع العلامات CuAAC في أنبوب إيبندورف الثالث. يغطى بورق الألومنيوم إذا كان التحقيق آلكاين غير حساسة للضوء (على سبيل المثال، طمرة آلكاين).
- وضع ثلاثة أنابيب إيبندورف، لم يسبق لهم اللعب، في كيس القفازات امؤكسج لمدة 6 ساعة. ينبغي لجميع العينات تبقى داخل كيس القفازات حتى الانتهاء من رد فعل CuAAC.
- إعداد 50 حل الأوراق المالية × من CuBr بإضافة 1 مل من DMSO إلى 7.2 ملغ من مسحوق CuBr، وكلاهما قد تم وفقا غير المؤكسج إلى الخطوة 5.4.
- الشروع في رد فعل من قبل CuAAC pipetting 1 ميكرولتر من هذا الحل الأوراق المالية CuBr إلى 50 ميكرولتر من حل وضع العلامات CuAAC، والتي تم وفقا غير المؤكسج إلى الخطوة 5.4. السماح للتفاعل والمضي قدما لمدة 12 ساعة داخل كيس القفازات.
- تنقية الفيروس المسمى وفقا لالخطوة 6.
6. تنقية وتخزين جزيئات الفيروس إعتبر
- تنقية عينات الفيروس المسمى باستخدام Centri سبتمبر ترشيح هلامي تدور جمعايرتها مع الواق التخزين فيروس olumns، في أعقاب المبادئ التوجيهية للشركة المصنعة.
- بدلا من ذلك، يمكن القيام بها لغسيل الكلى لتنقية ضد التخزين الاحتياطي فيروس.
- يجب أن يتم تخزينها في جزيئات الفيروس المسمى عند -80 درجة مئوية.
7. SDS-PAGE من اتش إعتبر ونيون مسح جل
- إضافة 20 عينة Laemmli ميكرولتر العازلة (2 ×) إلى 20 ميكرولتر من تنقية الفيروس المسمى وتغلى لمدة 10 دقيقة. منبذة العينات لمدة 30 ثانية لإزالة أي رواسب غير قابلة للذوبان. إذا النحاس المتبقية موجودة بعد تنقيتها، ويمكن غلي عينة يؤدي إلى خطوط سميكة من البروتين على هلام SDS-PAGE، مما يسبب صعوبة خلال التصور. في هذه الحالة، التخلي عن غليان من العينة في هذه الخطوة.
- نعلق كاسيت هلام إلى الخلية الكهربائي وإضافة العازلة على التوالي. تحميل العدد المطلوب من الآبار مع عينات البروتين الفيروسي. استخدام واحد جيد ليتم تحميلها مسبقا staiعلامات نيد الوزن الجزيئي. تشغيل هلام لمدة 1 ساعة بمعدل 200 خامسا الحفاظ على الخلية الكهربائي المغطى برقائق الألومنيوم خلال كامل الفترة للحد من photobleaching التسمية fluorophore.
- للحصول على أفضل قرار، وإزالة جميع fluorophore الحرة، والسماح للصبغ تتبع لنفد من هلام خلال الكهربائي. وقف الكهربائي ونقل بسرعة الجل إلى ماسح ضوئي هلام الفلورسنت ومسح هلام لانبعاث مضان في الطول الموجي المناسب (574 نانومتر لطمرة).
- يمكن قياس عدد جزيئات الصبغة مترافق إلى كل الجسيمات الفيروسية عن طريق قياس مضان من عدة تركيزات طمرة معيار ومقارنتها مع عينة من الخطوة 7.3.
8. ممثل النتائج
وأظهرت النتائج الملحوظة من SDS-PAGE ونيون مسح جل من طمرة، مترافق Ad5 في الشكل 3. وعلى الرغم من تنفيذ هذه بالاشعة هلام فلوري على عينات موديfied عبر CuAAC، وينبغي أن تكون النتائج مماثلة عندما و تربط تحقيقات عبر SPAAC. هذه بالاشعة هلام وضع العلامات تشير إلى أن النتائج آها في التعديل من البروتينات الثلاثة Ad5 قفيصة (Hexon، بينتون، والألياف)، في حين وضع العلامات السكر يعدل فقط قفيصة الألياف والبروتين. وعلاوة على ذلك، زيادة في تركيز آها (4 ملم مقابل 32 ملم) عن نتائج في درجة أكبر من دمج آها، لكنه أيضا لم تظهر لخفض العدوى. النتائج السابقة تشير إلى أن 7 لAd5 المنتجة في 4mM آها، ما يقرب من 5٪ من المواقع ميثيونين تتعرض هي تمرة، تعديل، مع هذا العدد المتزايد إلى 10٪ عند استخدام 32 ملم آها. وهذا يتوافق مع ما يقرب من 280 و 510، على التوالي، وصبغ وصفت مواقع في Ad5 جسيم. وقد أشار تحليل لوضع العلامات السكر (1) التي تشغل ما يقرب من 22 من مواقع ارتباط بالغليكوزيل 36 في Ad5 من قبل سكر azido وصفت في وقت لاحق مع تمرة.
إذا تم استخدام 10 لوحات زراعة الأنسجة لإنتاج أزيد المعدلة Ad5 كما هو موضح في هذا البروتوكول، 200 - وينبغي الحصول على 300 ميكرولتر من أزيد المعدلة الفيروس من الشريط الأبيض التي تم جمعها في الخطوة 3.6، مع ما يقرب من عيار 1.5 × 10 12 جزيئات / مل. وثمة صعوبة مشترك من هذا الإجراء هو عدم وجود فرقة الفيروسية في تنقية هذه الخطوة، التي يمكن أن تعزى إلى عيار فيروسي منخفض. هذا هو عموما نتيجة للاصابة الخلايا التي هي إما الإفراط أو تحت متموجة، أو عن طريق غسل بعيدا الخلايا - والتي أصبحت خففت من لوحة بعد الإصابة - في حين الشطف خلال الخطوة 1.
نظرة عامة على البروتوكول رقم 1. أدرج 1 أزيد المحتوية على آها أو GalNAz الى جزيئات اتش. ثم يتم إجراء ربط مع التحقيق الذي تجريه آلكاين فلوري عن طريق الكيمياء "فوق". أخيرا، يتم استخدام SDS-PAGE لإظهار الربط من لجنة التحقيق فلوري.
igure 2 "/>
الشكل 2. ربط من تحقيق آلكاين على أزيد معدلة والفيروس عن طريق (أ) SPAAC CuAAC (ب)، تحت دي المؤكسج و (ج) جو الاوكسيجين.
الشكل 3. بالاشعة نيون من SDS-PAGE-أزيد من تسمية نوع اتش 5 (Ad5) بعد اقتران CuAAC مع تمرة، آلكاين. (أ) آها المسمى Ad5، باستخدام اثنين من تركيزات آها. وضع العلامات ويبدو أن تحدث على Hexon اتش، والبروتينات والالياف بينتون قفيصة، مع قدر من العلامات المتزايدة مع تركيز آها المتزايدة. (ب) AC 4 اتش GalNAz المسمى يبدو أن المسمى فقط على الألياف البروتين قفيصة.
| حل | إعداد | ملاحظات |
| Ad5 تخزين العازلة | 5 مم تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة (درجة الحموضة 8.0) تحتوي على 0.5 مم MgCl 2، 50 مم كلوريد الصوديوم، و 25٪ (V / V) الجلسرين، و 0.05٪ (W / V) ألبومين المصل البقري (BSA) | متجر في -20 درجة مئوية |
| Ad5 عدوى العازلة | 2٪ (V / V) الأبقار عجل المصل، 1 × TC حل، Ad5 في العازلة التخزين (حجم تحدد باستخدام وزارة الداخلية من 10 خلية / PFU وفهرس العدوى من 1:20). تقديم حل نهائي لحجم استخدام TD العازلة | ويمكن تحديد Ad5 تركيز امتصاصا للأشعة فوق البنفسجية. |
| TC حل (200 ×) | 136 CaCl 2 مم، 100 مم MgCl 2 | تخزين في 4 درجات مئوية |
| TD العازلة | 137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 0.07 مم نا 2 هبو 4، و 25 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5 | تخزين في 4 درجات مئوية |
| كلوة الجنين البشري نمو الخلايا المتوسطة 293 | متوسطة Dulbecco ومعدلة النسر (DMEM) تستكمل مع 10٪ (V / V) الأبقار عجل المصل (BCS) و 1٪ (V / V) القلم بكتيريا | تخزين في 4 درجات مئوية |
| السيستئين حل الأوراق المالية (100 ×) | DMEM (-الأرصاد الجوية /-السيستئين) تستكمل 200 مم L-سيستين | إعداد الطازجة وفلتر مع فلتر 0.2 ميكرون محقنة معقمة قبل الاستخدام. |
| آها الأسهم الحل (25 ×) | DMEM (-الأرصاد الجوية /-السيستئين) تستكمل مع 100 ملي مول L-Azidohomoalanine | إعداد الطازجة وفلتر مع فلتر 0.2 ميكرون محقنة معقمة قبل الاستخدام. |
| آها وضع العلامات المتوسطة | DMEM (-الأرصاد الجوية /-السيستئين) تستكمل مع BCS 10٪، آها الأسهم حل (1 ×)، 2 مم L-سيستين | إعداد الطازجة قبل استخدامها. هذا يتوافق مع ج 4 ملمoncentration من آها، على الرغم من أن يمكن استخدام تركيزات مختلفة (انظر نتائج الممثل). |
| التقى الأسهم حل (25 ×) | DMEM (-الأرصاد الجوية /-السيستئين) تستكمل مع 100 ملي مول L-الميثيونين | إعداد الطازجة وفلتر مع فلتر 0.2 ميكرون محقنة معقمة قبل الاستخدام. |
| التقى سيطرة المتوسطة | DMEM (-الأرصاد الجوية /-السيستئين) تستكمل مع BCS 10٪، التقى حل الأوراق المالية (1 ×)، 2 مم L-سيستين | إعداد الطازجة قبل استخدامها. |
| AC الأسهم GalNAz 4 حل (1،000 ×) | 50 ملي peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (ميلان 4 GalNAz) في الميثانول | تخزن في درجة مئوية 4 ميلان 4 GalNAz خطوة تمهيدية لGlcNAz الأيض. |
| Azido السكر في وضع العلامات المتوسطة | 100 ميكروليتر المتردد الأسهم GalNAz 4 حل، 100 مل كلوة الجنين البشري نمو الخلايا المتوسطة 293 | تسمح الميثانول لتتبخر قبل مضيفا كلوة الجنين البشري نمو الخلايا المتوسطة 293. |
| حلول كلوريد السيزيوم | CSCL الذائبة في عازلة TD: 1.25 جم / مل (18.08 جم / 50 مل H 2 O) 1.35 جم / مل (25.60 جم / 50 مل H 2 O) 1.40 جم / مل (31.00 جم / 50 مل H 2 O) | التدرجات كثافة للتنبيذ فائق |
| فيروس تخزين العازلة | الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة 7.2، التي تحتوي على 0.5 مم CaCl 2، 0.9 مم MgCl 2، و 10٪ (V / V) الجلسرين | متجر في -20 درجة مئوية |
| طمرة-BCN حل وضع العلامات (SPAAC) | طمرة-BCN في DMSO:
| السلالة التي تروج لها مسبار آلكاين ليقترح SDS-PAGE، وعيار الفيروسية من حوالي 10 12 جزيئات / مل |
| طمرة، آلكاين حل وضع العلامات (CuAAC) | 50 ميكرولتر من أزيد المعدلة Ad5 في عازلة تخزين فيروس (N Ad5 كما هو محدد أعلاه)، و 1.5 ملي batho phenanthroline disulfonate (أي 1.5 × نهائي تركيز CuBr)، طمرة، آلكاين. يتم تحديد طمرة-آلكاين molarity (في M) باستخدام: ج ALK = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N آفو) (بحيث خليط التفاعل أعدت في الخطوة 5 يحتوي على 100 تحقيقات آلكاين في الفيريون) | ومن المعروف تريس العازلة لتكون قادرة على المنافسة ويجند المثبطة للنحاس. 8 |
| Laemmli العازلة عينة (2 ×) | 125 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 6.8)، 4٪ (W / V) SDS، 20٪ (V / V) الجلسرين، و 10٪ (V / V) 2-المركابتويثانول، و 0.004٪ (W / V) زرقة البروموفينول | |
| تشغيل العازلة | 187 ملي جليكاين، 19 مم تريس، حمض الهيدروكلوريك، 3.5 ملم SDS في H 2 O | تخزين في 4 درجات مئوية |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تطور ردود الفعل فوق chemoselective وbioorthogonal، بما فيها تلك التي من أزيدات، هو منطقة التطور السريع للبحوث، وبعد ذلك هناك عدد متزايد من ردود الفعل هذه للاختيار من بينها لتقديم الطلبات bioconjugation. قيدت نحن في نطاق هذا البروتوكول لتشمل اثنين فقط من الأساليب التي تم اختيارها بسبب فائدتها في مختبرنا الخاص والتجاري لجميع الكواشف.
في الطريق الأول من نوعه - السلالة التي تروج لها أزيد-آلكاين الاضافه الحلقيه (SPAAC) - يرد آلكاين ضمن حلقة cyclooctyne (الشكل 2A). ويمكن إجراء هذه الطريقة التي وضعت مؤخرا تحت جو الاوكسيجين ودون الحاجة إلى وجود حافز النحاس. 9،10 وحتى وقت قريب، عيب واحد من هذه الطريقة هو توليف شاقة وتوافر التجارية المخفضة لهذه الألكاينات المتوترة مقارنة مع الألكاينات المستخدمة في المحطة النحاس (I)، المحفز أزيد-آلكاين الاضافه الحلقيه (النحاسAAC)، ولكن مكتبة متزايد من هذه التحقيقات الآن متاحة تجاريا (انظر الجدول من الكواشف). لهذه الأسباب، اخترنا SPAAC كأسلوب من خيار في هذا البروتوكول.
كما وصفت في هذا البروتوكول هو ربط الجسيمات أزيد معدلة والفيروسة الغدانية عبر CuAAC في الجو باستخدام امؤكسج bathophenanthroline disulfonic حامض الصوديوم ملح (BDA) كعامل شيلاتينغ (الشكل 2B). هذا الأسلوب هو مناسب في هذا المحفز BDA على حد سواء المتاحة تجاريا وغير مكلفة. وعلاوة على ذلك، أفادت غلة عادة ما تكون أعلى من الأساليب المتاحة، ويتم تجنب المضاعفات الناجمة عن الجيل من أنواع الاكسجين التفاعلية (راجع المؤكسج CuAAC، أدناه) في حل. 8 ولكن من المعروف أن النحاس (I) ليكون حافزا السامة للخلايا، قد (11) والمعدات المتخصصة اللازمة لتنفيذ هذا الإجراء ردع بعض الفئات من استخدامه. ومع ذلك، فإننا نجد هذه الطريقة فعالة ومفيدة للاتش تعديل.
لقد كان هذا الأسلوب الثالث من المفيد CuAAC وضعت مؤخرا على العمل في ظل الظروف الجوية الاوكسيجين (الشكل 2C). (8) هذا الأسلوب يتمتع بنفس المزايا التي النهج BDA-بالكلاب ولكن بدلا من ذلك يستخدم THPTA كعامل شيلاتينغ لاستيعاب الاوكسجين في الغلاف الجوي من دون تدمير الأكسدة من الركيزة. عيب واحد صغير من هذا النهج هو النقص الحالي في توافر التجاري لTHPTA، على الرغم من أن تم الإبلاغ عن خلاصات واضحة من هذا وكيل شيلاتينغ. 8 على الرغم من أننا لم نقم بهذه الطريقة الربط في نظام منطقتنا، وسيكون من المتوقع THPTA / CuAAC لانتاج مماثل النتائج إلى BDA / CuAAC، مقارنة مع الراحة جو من التسامح الاوكسيجين.
على الرغم من وضع عمدا هذا البروتوكول حول المواد المتاحة تجاريا، ونحن لا تزال ترغب في التعرف على مزايا من حيث التكلفة وزيادة المرونة من توليفأزيدات وتحقيقات آلكاين المستخدمة هنا. يمكن إعداد Azidohomoalanine في اقل من ثلاثة أيام وأقل بكثير من مصادر تجارية. 6،12 رواه الاستعدادات آلكاين توترت أكثر صعوبة تحمل 11 ولكن حرية أكبر في اختيار التحقيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نعترف جبهة الخلاص الوطني للتمويل (CBET-0846259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 | |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 | |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 | |
| Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 | |
| Cell culture CO2 incubator | |||
| Hemocytometer | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) | |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | ||
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| Sterile needle, 18 gauge | |||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | |||
| Dewar flask | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Electrophoresis cell | |||
| Fluorescent gel scanner | |||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| Methanol | |||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | |||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| 1M HCl | |||
| Glycerol | |||
| Bovine Serum Albumin | |||
| L-cysteine | |||
| L-methionine | |||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | |||
| 2-mercapt–thanol | |||
| Glycine | |||
| Bromophenol blue | |||
| Cesium Chloride (CsCl) | |||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | |||
| Potassium Chloride (KCl) | |||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | |||
| Alkyne probe for CuAAC* | |||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 | |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | |||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 | |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs. |
|||
References
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
- Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
- Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
- Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
- Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
- Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
- Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
