Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kemoselektiv Modifikation af virale overflader via Bioorthogonal klik kemi

doi: 10.3791/4246 Published: August 19, 2012

Summary

Adenoviruspartikler er manipuleret til at indeholde enten naturlig aminosyre analog azidohomoalanine eller azido sukker

Abstract

Ændringen af viruspartikler har modtaget en betydelig opmærksomhed for sit enorme potentiale for at påvirke genterapi, onkolytiske applikationer og udvikling af vacciner. 1,2,3 nuværende tilgange til at ændre virale overflader, som for det meste genetik-baserede, ofte lider af dæmpning af virus produktion, infektivitet og celletransduktion. 4,5 Brug kemoselektive klik kemi, har vi udviklet en simpel alternativ metode, som forbigås disse spørgsmål, mens de resterende både meget fleksibel og tilgængelig. 1,2

Målet med denne protokol er at demonstrere effektiviteten af ​​at anvende bioorthogonal klik kemi at modificere overfladen af ​​adenovirus type 5-partikler. Denne to-trins proces, kan anvendes både terapeutisk 1 eller analytisk, 2,6, da det tillader kemoselektiv ligering af målsøgningsmolekyler, farvestoffer eller andre molekyler af interesse på proteinerforudmærket med azid tags. De tre vigtigste fordele ved denne metode er, at (1) metabolisk mærkning viser ringe eller ingen indvirkning på vira, 1,7 (2) en bred vifte af effektor ligander kan anvendes, og (3) er det bemærkelsesværdigt hurtigt, pålideligt og nemt at få adgang. 1,2,7

I det første trin af denne procedure er adenoviruspartikler fremstilles under enten azidohomoalanine (Aha, en methionin surrogat) eller unaturlige sukker O-bundet N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), som begge indeholder azidet (-N3) funktionel gruppe. Efter oprensning af azid-modificerede viruspartikler er en alkyn probe indeholdende fluorescerende TAMRA del ligeres i en kemoselektiv måde til præ-mærkede proteiner eller glycoproteiner. Endelig er en SDS-PAGE-analyse udført for at demonstrere den vellykkede ligering af proben på de virale capsidproteiner. Aha inkorporering er vist at mærke alle virale capsidproteiner (Hexon, Penton og Fiber), mens O-GlcNAz inkorporering resulterer i mærkning af Fiber alene.

I denne udvikling område er flere metoder til azid-alkyn ligering med held blevet udviklet, men kun de to vi har fundet at være mest hensigtsmæssigt demonstreres heri - stamme-fremmet azid-alkyn cycloaddition (SPAAC) og kobber-katalyseret azid-alkyn cycloaddition (CuAAC) under afiltet atmosfære.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Se tabel 1 for fremstilling af alle medier, buffere og løsninger henvises til i denne protokol.

1. Produktion af Aha-mærket Adenovirus

  1. Fremstille elleve 100 mm vævskulturskåle af humane embryonale nyreceller (HEK 293) opretholdes i HEK 293 cellevækstmedium (se tabel 1) ved 37 ° C, indtil de har nået 80 - 90% konfluens. (Bemærk:. Kulturer med konfluens over 90% kan være vanskeligt at inficere og kan ikke producere virus som ønsket)
  2. Løsne cellerne i en af ​​pladerne ved først at fjerne vækstmediet, skylning én gang med 5 ml TD buffer og derpå inkubere cellerne i et minut i 1 ml trypsin-EDTA (1 x).
  3. Tilsættes 9 ml HEK 293 cellevækstmedium, og anvender et hæmocytometer at tælle antallet af høstede HEK 293-celler fra denne skål. Brug dette nummer til at beregne mængden af ​​adenovirus type 5 (Ad5), der kræves for infektion ved hjælp af en multiplicity af infektion (MOI) værdi på 10 PFU / celle. Højde for den omstændighed, at normal Ad5 infektiviteten (forholdet af infektiøse partikler til det samlede antal partikler) er typisk 01:20.
  4. Fremstilling af 10 ml af infektion puffer.
  5. Langsomt fjernes HEK 293 cellen vækstmedium fra de ti resterende dyrkningsskålene og derefter skylles med 5 ml af TD-buffer. Tilsæt 1 ml af infektion puffer til hver skål, og inkuber ved 37 ° C i 1 time. I løbet af denne infektion periode vippe forsigtigt hver dyrkningsskål side til side på 15-minutters intervaller.
  6. Efter infektion tilsættes 9 ml frisk HEK 293 celler vækstmedium og inkuberes ved 37 ° C i 18 timer.
  7. Fremstilling af 100 ml Aha mærkning medium (eller Met kontrol medium til kontrol). Sørg for at filtrere de koncentrerede stamopløsninger med en 0,2-um steril sprøjte filter, før der udarbejdes etiketmediet.
  8. Omhyggeligt (for ikke at bortvaske de inficerede celler) fjerne HEK 293 cellen vækstmedium efter 18 timer ennd vask hver dyrkningsskål med 5 ml TD puffer.
  9. Fjern TD buffervask, og der tilsaettes 10 ml Aha mærkning medium til hver kultur fad. En kontrol bør methionin kontrolmedium anvendes i stedet for AHA mærkning mediet på dette trin.
  10. Inkuber de inficerede celler i mærkning medium ved 37 ° C i 6 timer. Mærkning kan udføres når som helst mellem 12-24 timer efter infektion, men bør ikke være længere end 6 timer i varighed. Dette interval er fastlagt til at maksimere overlapning med viral strukturelt protein oversættelse og samtidig sikre, infektivitet ikke er væsentligt formindsket. 7
  11. Fjernes forsigtigt mærkning medium for ikke at forstyrre cellerne. Der tilsættes 10 ml frisk HEK 293 cellen vækstmedium til hver skål, og der inkuberes cellerne ved 37 ° C i yderligere 18 timer. At minimere tab af inficerede celler under dette trin, er det ikke nødvendigt at fjerne etiketten opløsningen fuldstændig. HEK 293 celler vækstmedium indeholder et overskud af Met hvilket vil udkonkurrere eventuelt tilbageværende Aha.
  12. Fortsæt til trin 3 til rensning.

2. Produktion af azido-Sukker-mærket Adenovirus

  1. Følg proceduren titlen Produktion af Aha-mærket Adenovirus op til og med trin 1,5.
  2. Fremstilling af 100 ml azido-sukker mærkning medium.
  3. Dækker cellerne med 10 ml frisk azido-sukker mærkning medium og inkuberes ved 37 ° C i 44 timer.

3. Oprensning af azid-mærkede adenovirale partikler

  1. Fjerne mediet sammen med de inficerede celler fra hver dyrkningsskål og overføres til koniske rør. Centrifuger ved 2000 g i 10 minutter ved 4 ° C. Fjernes supernatanten og resuspender pelleten i TD-puffer (ved anvendelse af 8 ml TD puffer af 10 retter).
  2. Lysering af de inficerede celler ved gentaget (3 eller mere) fryse-tø-cykler under anvendelse af en Dewar-kolbe med flydende nitrogen og et 37 ° C vandbad. Centrifuger ved 2000 g i 10 minved 4 ° C for at adskille cellerester fra supernatanten.
  3. Fremstilling af en CsCI densitetsgradient centrifugeglas ved først at pipettere 2,5 ml 1,25 g / ml CsCl-opløsning i en Ultra Clear centrifugerør. Dernæst anvendes en pipette med sin spids placeret ved bunden af ​​røret langsomt tilsættes 2,0 ml af 1,4 g / ml CsCl-opløsning, idet man ikke at forstyrre gradient grænsefladen.
  4. Pipettere supernatanten fra trin 3,2 ovenpå CsCl densitetsgradient rør, og om nødvendigt tilsættes TD buffer til fyldning af røret. Centrifugeres prøverne i en svingende spand-rotor ved 125 tusind g i 1 time ved 15 ° C i en ultracentrifuge.
  5. Efter færdiggørelse af ultracentrifugering, bør viruspartikler være synlig som en tyk hvid bånd ved grænsefladen mellem de to CsCl opløsninger. Foretage en lille perforering i bunden af ​​røret med en steril nål for at tillade opløsningen at dræne dråbevis.
  6. Saml den tykke hvide bånd, som bør indeholde de mærkede Ad5 partikler, Taking pleje for at udelukke overskydende CsCl-opløsning. Undgå opsamling cellulære proteiner, som bånd over virus lag. Derudover udelukker tomme virioncapsids som danner en lighter lag lidt over den tykke hvide virus bånd.
  7. Eventuelt udføre en endelig oprensning på de mærkede Ad5 partikler. Tilføje opsamlede fraktion fra trin 3,6 til 4 ml ultracentrifugerør og fylde røret med 1,35 g / ml CsCl-opløsning. Centrifugeres ved 125.000 g i 18 timer ved 15 ° C og opsamle den tykke hvide bånd, som dannes i midten af ​​røret, som beskrevet i trin 3.5 og 3.6. (Bemærk, at hvis den virale titer er lav, kan et hvidt bånd ikke kunne ses efter den anden centrifugering, og det vil ikke være muligt at genvinde det mærkede virus).
  8. Til opbevaring af viruspartiklerne over lange perioder, bør dialyse af den opsamlede virus ekstrakten udføres mod virus opbevaringsbuffer. Gemme dialyserede virusprøver ved -80 ° C.

4. Ligelse af modificerede adenovirale partikler med alkyn prober under anvendelse Stamme-Promoted azid-alkyn Cycloaddition (SPAAC)

  1. Til en opløsning af 50 ul af azid-modificeret Ad5 i virus opbevaringsbuffer, 0,25 ul SPAAC mærkning opløsning tilsættes. (Se tabellen af ​​reagenser til en liste over venders af kommercielt tilgængelige anstrengte alkyner).
  2. Tillade stamme fremmes cycloaddition forløbe natten over ved stuetemperatur. Hvis en lysfølsom føler (f.eks TAMRA) anvendes, omfatter reaktionsbeholderen med aluminiumsfolie.
  3. Oprense mærkede virus ifølge trin 6.

5. Ligering af modificerede adenovirale partikler med alkyn Probes anvendelse af kobber (I)-katalyseret azid-alkyn Cycloaddition (CuAAC) i deoxygeneret atmosfære

  1. Sted 7,2 mg kobber (I) bromid (CuBr) pulver i et Eppendorf-rør, dækket med aluminiumsfolie.
  2. Pipette 1 ml DMSO til et andet Eppendorf-rør.
  3. Forbered50 ul CuAAC mærkning opløsning i en tredje Eppendorf-rør. Dæk med aluminiumsfolie, hvis alkyn proben er lysfølsomt (f.eks TAMRA-alkyn).
  4. Placere tre Eppendorf rør, reducerede i en deoxygeneret handskepose i 6 timer. Alle prøver bør forblive inden i handskepose, indtil færdiggørelse af CuAAC reaktionen.
  5. Fremstilling af en 50 x stamopløsning af CuBr ved tilsætning af 1 ml DMSO til 7,2 mg CuBr pulver, som begge er blevet deoxygeneret ifølge trin 5.4.
  6. Indlede CuAAC reaktionen ved pipettering af 1 ul af denne CuBr stamopløsning til 50 ul af CuAAC mærkning opløsningen, som er blevet deoxygeneret ifølge trin 5.4. Tillade reaktionen at forløbe i 12 timer inde i handskepose.
  7. Oprense mærkede virus ifølge trin 6.

6. Rensning og opbevaring af mærkede Viruspartikler

  1. Oprense mærkede virusprøver hjælp Centri-Sep gelfiltrering centrifugering columns ækvilibreret med Virus opbevaringsbuffer, efter producentens retningslinier.
  2. Alternativt kan oprensning udføres ved dialyse mod virus opbevaringsbuffer.
  3. De mærkede viruspartikler skal opbevares ved -80 ° C.

7. SDS-PAGE af mærket Adenovirus & Fluorescerende Gel Scanning

  1. Tilsæt 20 ul Laemmli-prøvepuffer (2 ×) til 20 ul renset mærket virus og kog i 10 min. Centrifugeres prøverne i 30 sek at fjerne eventuelt uopløseligt bundfald. Hvis resterende kobber er til stede efter rensning, kan kogning af prøven resulterer i tykke striber af protein på SDS-PAGE-gel, forårsager vanskeligheder ved visualisering. I dette tilfælde give afkald kogning af prøven i dette trin.
  2. Fastgøre gelkassetten for elektroforese cellen, og der tilsættes kørselsbuffer. Indlæse det ønskede antal brønde med det virale protein prøver. Brug en god til at indlæse pre-staiNed molekylvægtsmarkører. Kør gelen i 1 time ved 200 V. Hold elektroforesecelle dækket med aluminiumfolie i hele perioden for at reducere fotoblegning af fluoroforen etiketten.
  3. For den bedste opløsning og fjerne alt frit fluorofor, tillader sporing farvestoffet at løbe ud af gelen under elektroforesen. Standse elektroforese og hurtigt overføres gelen til en fluorescerende gel scanner og scanner gelen for fluorescensemission ved den passende bølgelængde (574 nm til TAMRA).
  4. Antallet af farvestofmolekyler konjugeret til hver viral partikel kan kvantificeres ved at måle fluorescensen af ​​adskillige standardfremgangsmåder TAMRA koncentrationer og sammenligning med prøven fra trin 7.3.

8. Repræsentative resultater

De observerede resultater af SDS-PAGE og fluorescerende gel-scanning af TAMRA-konjugerede Ad5 er vist i figur 3. Selv om disse fluorescerende gel scanninger blev udført på prøver modifificeret via CuAAC, skal resultaterne sammenlignes, når proberne er ligeret via SPAAC. Disse gel scanninger viser, at Aha mærkning resulterer i modifikation af de tre Ad5 capsidproteiner (Hexon, Penton og Fiber), mens sukker mærkning modificerer kun Fiber capsidprotein. Endvidere en stigning i Aha koncentration (4 mM vs 32 mM) resulterer i en større grad af Aha inkorporering, men det har også vist sig at falde infektivitet. Tidligere resultater 7 viser, at for Ad5 fremstillet i 4 mM Aha, ca 5% af de eksponerede methionin sites er TAMRA-modificeret med dette antal stigende til 10%, når 32 mM Aha anvendes. Dette svarer til ca 280 og 510, henholdsvis farvning-mærkede steder pr Ad5 partikel. Analyse af sukker-mærkning 1 har vist, at omkring 22 af de 36 glycosyleringsstederne på Ad5 er besat af en azido sukker og efterfølgende mærket med TAMRA.

Hvis ti vævskulturplader anvendes til fremstilling af azid-modificeret Ad5 som beskrevet i denne protokol, 200 - bør 300 pi azid-modificerede virus kan opnås fra det hvide bånd opsamlet i trin 3.6, med en titer på ca 1,5 x 10 12 partikler / ml. En fælles problem med denne procedure er fraværet af en viral bånd ved denne oprensningstrin, der kan tilskrives til lav viral titer. Dette er generelt et resultat af infektion af celler, som er enten over-eller under-konfluente, eller ved at bortvaske celler - som bliver løsnet fra pladen efter infektion - under skylningen i trin 1.

Figur 1
Figur 1. Protokol overblik. Azid-holdig Aha eller GalNAz først inkorporeret i adenoviruspartikler. Ligering med et fluorescerende alkyn probe udføres derefter via "klik" kemi. Endelig SDS-PAGE til at påvise ligering af den fluorescerende probe.

IGUR 2 "/>
Figur 2. Ligering af alkyn probe på azid-modificeret virus via (a) SPAAC, (b) CuAAC under oxygeneret de-og (c) oxygeneret atmosfære.

Figur 3
Figur 3. Fluorescerende scanninger af SDS-PAGE af azid-mærket adenovirus type 5 (Ad5) efter CuAAC konjugering med TAMRA-alkyn. (A) Aha-mærket Ad5, under anvendelse af to koncentrationer af Aha. Mærkning synes at forekomme på adenovirus Hexon, Penton og Fiber capsidproteiner med graden af ​​mærkning stiger med forøget Aha koncentration. (B) Ac 4 GalNAz-mærket adenovirus synes at være mærkes kun på fiberen capsidproteinet.

Opløsning Forberedelse Noter
Ad5 opbevaringspuffer 5 mM Tris-HCl puffer (pH 8,0) indeholdende 0,5 mM MgCl2, 50 mM NaCI, 25% (v / v) glycerol og 0,05% (w / v) bovint serumalbumin (BSA) Opbevar ved -20 ° C
Ad5 infektion puffer 2% (v / v) bovint kalveserum, 1 × TC opløsning Ad5 i opbevaringsbuffer (volumen bestemt ved anvendelse af en MOI på 10 PFU / celle og en infektivitet indeks på 01:20). Opløsningen bringes til slutvolumenet med TD-puffer Ad5 koncentration kan bestemmes via UV-absorption.
TC opløsning (200 ×) 136 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 Opbevares ved 4 ° C
TD buffer 137 mM NaCl, 5 mM KCI, 0,07 mM Na2 HPO4 og 25 mM Tris-HCI, pH 7,5 Opbevares ved 4 ° C
HEK 293 cellevækstmedium Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% (v / v) bovint kalveserum (BCS) og 1% (v / v) Pen Strep Opbevares ved 4 ° C
Cys stamopløsning (100 ×) DMEM (-Met /-Cys) suppleret med 200 mM L-cystein Fremstil frisk og filtreres med et 0,2 um steril sprøjte filter før brug.
Aha stamopløsning (25 ×) DMEM (-Met /-Cys) suppleret med 100 mM L-Azidohomoalanine Fremstil frisk og filtreres med et 0,2 um steril sprøjte filter før brug.
Aha mærkning medium DMEM (-Met /-Cys) suppleret med 10% BCS, Aha stamopløsning (1 x), 2 mM L-cystein Fremstil frisk før brug.
Dette svarer til en 4 mm Concentration af Aha, selv om forskellige koncentrationer kan anvendes (se Repræsentative resultater).
Met stamopløsning (25 ×) DMEM (-Met /-Cys) suppleret med 100 mM L-methionin Fremstil frisk og filtreres med et 0,2 um steril sprøjte filter før brug.
Met kontrolmedium DMEM (-Met /-Cys) suppleret med 10% BCS, Met stamopløsning (1 x), 2 mM L-cystein Fremstil frisk før brug.
Ac 4 GalNAz stamopløsning (1.000 ×) 50 mM peracetylerede N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) i methanol Opbevares ved 4 ° C. Ac 4 GalNAz er en metabolisk forløber for GlcNAz.
Azido-sukker mærkning medium 100 ul Ac 4 GalNAz stamopløsning, 100 ml HEK 293 cellevækstmedium Tillader methanol fordampe før tilsætning HEK 293 cellevækstmediet.
Cesiumchlorid opløsninger CsCI opløst i TD-buffer:
1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml H2O)
1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml H2O)
1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml H2O)
Densitetsgradienter for ultracentrifugering
Virus opbevaringspuffer Phosphatbufret saltvand (PBS), pH 7,2, indeholdende 0,5 mM CaCl2, 0,9 mM MgCI2 og 10% (v / v) glycerol Opbevar ved -20 ° C
TAMRA-BCN (SPAAC) mærkning løsning TAMRA-BCN i DMSO:
  1. Brug UV absorbance (OD 260 Assay) til bestemmelse af titeren af virus-opløsning i trin 4.1
  2. Bestemme det samlede antal af virale partikler i 50 ul aliquot (N Ad5)
  3. Den TAMRA-BCN molariteten (i M) bestemmes ved hjælp af:
    c BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Avo)
    N Avo = 6,022 × 10 23
    (Således at reaktionsblandingen fremstillet i Trin 4 indeholder 100 alkyn prober pr virion)
Stamme fremmes alkyn probe
Til SDS-PAGE, en viral titer på ca 10 12 partikler / ml foreslås
TAMRA-Alkyn (CuAAC) mærkning løsning 50 ul af azid-modificeret Ad5 i virus opbevaringsbuffer (N Ad5 bestemt som ovenfor), 1,5 mM batho phenanthrolin disulfonat (dvs. 1,5 × endelig CuBr koncentration), TAMRA-alkyn.
TAMRA-Alkyn molariteten (i M) bestemmes ved hjælp af:
c Alk = 2 x 10 6 × (N Ad5 / N Avo)
(Således at reaktionsblandingen fremstillet i Trin 5 indeholder 100 alkyn prober pr virion)
Tris-buffer vides at være en kompetitiv og inhiberende ligand af kobber. 8
Laemmli prøvebuffer (2 x) 125 mM Tris-HCI (pH 6,8), 4% (w / v) SDS, 20% (v / v) glycerol, 10% (v / v) 2-mercaptoethanol og 0,004% (vægt / volumen) bromphenolblåt
Løbende buffer 187 mM glycin, 19 mM Tris-HCI, 3,5 mM SDS i H2O Opbevares ved 4 ° C
t "> Tabel 1. Fremstilling af buffere og opløsninger, der kræves i denne protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Udviklingen af ​​kemoselektive og bioorthogonal klik reaktioner, herunder azider, er en hastigt udviklende område af forskning, og efterfølgende er der et stigende antal af disse reaktioner for at vælge imellem for bioconjugation applikationer. Vi har begrænset rækkevidden af ​​denne protokol til kun at omfatte to metoder, der blev valgt på grund af deres anvendelighed i vores eget laboratorium og kommercielle tilgængelighed af alle reagenser.

I den første vej - stamme-fremmet azid-alkyn cycloaddition (SPAAC) - alkynen er indeholdt i en cyclooctyne ring (figur 2a). Denne nyligt udviklede metode kan udføres under oxygeneret atmosfære og uden behov for en kobberkatalysator. 9,10 Indtil for nylig var en ulempe ved denne fremgangsmåde arbejdskrævende syntese og reduceret kommercielle tilgængelighed af disse belastede alkyner sammenlignet med den terminale alkyner anvendes i kobber (I)-katalyseret azid-alkyn cycloaddition (CuAAC), men en voksende bibliotek af disse prober er nu kommercielt tilgængelig (se tabel af reagenser). Af disse grunde har vi valgt SPAAC som den foretrukne fremgangsmåde i denne protokol.

Også beskrevet i denne protokol, er ligering af azid-modificerede adenovirale partikler via CuAAC i deoxygeneret atmosfæren ved hjælp bathophenanthroline disulfonsyre dinatriumsalt (BDA) som et chelateringsmiddel (figur 2b). Denne fremgangsmåde er praktisk at BDA katalysatoren er begge kommercielt tilgængelige og billige. Endvidere rapporterede udbytter er generelt højest af de tilgængelige metoder og komplikationer som følge af dannelsen af reaktive oxygenarter (jf. oxygeneret CuAAC nedenfor) i opløsning, undgås. 8 er imidlertid kobber (I)-katalysator kendt for at være cytotoksiske, 11 og specialiseret udstyr, der kræves for at gennemføre denne procedure, kan afholde nogle grupper fra at bruge den. Ikke desto mindre finder vi denne metode effektiv og nyttig tiladenovirus modifikation.

En tredje nyttig fremgangsmåde til CuAAC er for nylig blevet udviklet til at arbejde under oxygenerede atmosfæriske betingelser (figur 2C). 8. Denne fremgangsmåde har de samme fordele som den BDA-chelaterede fremgangsmåde, men anvender i stedet THPTA som et chelateringsmiddel for at rumme atmosfæriske oxygen uden oxidativ ødelæggelse af substratet. En lille ulempe ved denne metode er den nuværende mangel på kommercielle tilgængelighed af THPTA, selv om enkle synteser af denne chelatdanner er blevet rapporteret. 8 Selvom vi ikke har udført denne ligatur metode på vores eget system, ville THPTA / CuAAC forventes at producere sammenlignelige resultater til BDA / CuAAC, med den ekstra bekvemmelighed af iltet atmosfære tolerance.

Trods vilje udvikle denne protokol omkring kommercielt tilgængelige materialer, vi stadig ønsker at anerkende de omkostningsfordele og øget fleksibilitet i syntese afazider og alkyn prober anvendt heri. Azidohomoalanine kan være forberedt på så lidt som tre dage, og betydeligt mindre end kommercielle kilder. 6,12 Rapporterede anstrengt alkyn præparater er vanskeligere 11, men giver større frihed sonde valg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende NSF til finansiering (CBET-0.846.259).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene BCBC 391
Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells ATCC CRL-1573
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose Invitrogen 11965-092
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose Invitrogen 21013-024
Bovine Calf Serum Invitrogen 16170-078
Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) Invitrogen 15140-122
0.5% Trypsin-EDTA (10×) Invitrogen 15400-054
100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene BD Falcon 353003
Cell culture CO2 incubator
Hemocytometer
Biosafety cabinet
Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) VWR 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe)
Avanti J-E centrifuge Beckman Coulter 369001
Conical tubes (50 ml, sterile) BD Falcon 352098
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm Beckman 344059
Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor Beckman
Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml Eppendorf 0030 121.589
Centrifuge 5418 Eppendorf 5418
Centri-Sep gel filtration spin columns Princeton Separations CS-901
Sterile needle, 18 gauge
Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed)
Dewar flask
Liquid nitrogen
Electrophoresis cell
Fluorescent gel scanner
Ready Gel Tris-HCl Gel Bio-Rad 161-1105
L-Azidohomoalanine AnaSpec 63669
Jena Biosciences CLK-AA005
Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) Invitrogen C33365
Thermo Scientific 88905
Sigma-Aldrich A7480
Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt MP Biomedicals 0215011201
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Methanol
Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)
Disodium Phosphate (Na2HPO4)
Phosphate buffered saline (PBS)
1M HCl
Glycerol
Bovine Serum Albumin
L-cysteine
L-methionine
SDS (sodium dodecyl sulfate)
2-mercapt–thanol
Glycine
Bromophenol blue
Cesium Chloride (CsCl)
Copper(I) Bromide (CuBr)
Calcium Chloride (CaCl2)
Potassium Chloride (KCl)
Magnesium Chloride (MgCl2)
Sodium Chloride (NaCl)
Alkyne probe for CuAAC*
TAMRA Alkyne Invitrogen T10183
Strained alkyne probe for SPAAC*
TAMRA DIBO Alkyne Invitrogen C10410

* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
  2. Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
  3. Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
  4. Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
  5. Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
  6. Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
  7. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
  8. Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
  9. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  10. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
  11. Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
  12. Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
Kemoselektiv Modifikation af virale overflader via Bioorthogonal klik kemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rubino, F. A., Oum, Y. H., Rajaram, L., Chu, Y., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (66), e4246, doi:10.3791/4246 (2012).More

Rubino, F. A., Oum, Y. H., Rajaram, L., Chu, Y., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (66), e4246, doi:10.3791/4246 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter