Summary
Adenovirus-Partikeln wurden entwickelt, um entweder die unnatürliche Aminosäure analogen azidohomoalanine oder die Azido Zucker enthalten
Abstract
Die Modifikation von Viruspartikeln ist eine signifikante Menge an Aufmerksamkeit für die ein enormes Potenzial für ein Aufschlagen Gentherapie, onkolytischen Anwendungen und die Entwicklung von Impfstoffen erhalten. 1,2,3 Aktuelle Ansätze zur Modifizierung viralen Oberflächen, die meist Genetik-basiert sind, oft von der Dämpfung leiden Virus-Produktion, Infektiosität und zellulären Transduktion. Mit 4,5 chemoselektive Klick-Chemie, haben wir eine einfache alternative Methode, die diese Probleme umgeht, während verbleibenden hoch flexibel und zugänglich entwickelt. 1,2
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirksamkeit der Verwendung bioorthogonalen Click-Chemie, die Oberfläche des Adenovirus Typ 5-Teilchen zu modifizieren demonstrieren. Dieses zweistufige Verfahren kann sowohl therapeutisch 1 oder analytisch 2,6 verwendet werden, wie es für die chemoselektive Ligation von Targeting-Moleküle, Farbstoffe oder andere Moleküle von Interesse erlaubt an Proteinemit Azid-Tags voretikettiert. Die drei wichtigsten Vorteile dieser Methode sind, dass (1) metabolische Markierung wenig bis gar keine Auswirkungen auf die virale Fitness, 1,7 demonstriert (2) eine breite Palette von Effektor-Liganden können verwendet werden, und (3) Es ist bemerkenswert schnelle, zuverlässige und einfach zu erreichen. 1,2,7
Im ersten Schritt dieses Verfahrens werden Adenoviruspartikel hergestellt trägt entweder azidohomoalanine (Aha, ein Methionin Surrogat-) oder die unnatürliche Zucker O-verknüpfte N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), die beide das Azid (N-3) funktionelle Gruppe. Nach der Reinigung der azidmodifizierten Viruspartikel, wird ein Alkin Sonde, die die fluoreszierende TAMRA-Einheit in einem chemoselektive Weise wie die Vor-markierte Proteine oder Glykoproteine ligiert. Schließlich wird eine SDS-PAGE-Analyse durchgeführt, um die erfolgreiche Ligation von der Sonde auf der viralen Capsidproteine zu demonstrieren. Aha Inkorporation wird gezeigt, dass alle Viruskapsids beschriftenProteine (Hexon, Penton und Fiber), während die O-Aufnahme resultiert in GlcNAz Kennzeichnung von Fiber nur.
In diesem sich entwickelnden Gebiet, haben mehrere Methoden für die Azid-Alkin-Ligation erfolgreich entwickelt, jedoch nur die beiden haben wir festgestellt, dass die bequemste haben werden hier gezeigt - Dehnungs-Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) und Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) unter Sauerstoff befreiten Atmosphäre.
Protocol
Siehe Tabelle 1 für die Herstellung von allen Medien, Puffer und Lösungen in diesem Protokoll verwiesen wird.
1. Die Produktion von Aha-markierten Adenovirus
- Planen elf 100-mm-Gewebekulturschalen von humanen embryonalen Nierenzellen (HEK 293) in HEK 293-Zelle Wachstumsmedium gehalten (siehe Tabelle 1) bei 37 ° C, bis sie 80 erreicht haben, - 90% Konfluenz gezüchtet. (Hinweis:. Kulturen mit mehr als 90% Konfluenz kann es schwierig sein zu infizieren und kann nicht zu Viren wie gewünscht)
- Lösen der Zellen in einer der Schalen, indem zunächst das Wachstumsmedium, einmaligem Spülen mit 5 ml TD-Puffer, dann Inkubieren der Zellen für eine Minute in 1 ml Trypsin-EDTA (1 ×).
- 9 ml von HEK 293-Zelle aus dem Nährmedium, und mit einem Hämocytometer um die Anzahl der geernteten HEK 293-Zellen von dieser Schale zählen. Verwenden Sie diese Nummer, um die Menge von Adenovirus Typ 5 (Ad5) für eine Infektion erforderlich berechnen mit Hilfe eines multiplicity der Infektion (MOI) von 10 PFU / Zelle. Die Tatsache berücksichtigen, dass für den normalen Ad5, die Infektiosität (Verhältnis von infektiösen Partikeln auf die Gesamtzahl der Teilchen) ist typischerweise 1:20.
- Planen 10 ml Puffer-Infektion.
- Entfernen Sie langsam den HEK 293 Zellwachstumsmedium aus den zehn verbleibenden Kulturschalen, dann waschen mit 5 ml TD-Puffer. 1 ml der Infektion Puffer zu jeder Schale und bei 37 ° C für 1 Stunde. Während dieser Periode Infektion, schaukeln sich Kulturschale einer Seite zur anderen im 15-Minuten-Intervallen.
- Nach der Infektion, 9 ml frischer HEK 293-Zelle Wachstumsmedium und Inkubieren bei 37 ° C für 18 Stunden.
- Es werden 100 ml Aha Kennzeichnung Medium (oder Met Steuermedium für die Kontrolle). Achten Sie darauf, um die konzentrierte Stammlösungen mit einem 0,2-um sterile Spritze Filter filtern, bevor die Vorbereitung der Kennzeichnung von Medien.
- Vorsichtig (damit sie nicht weg zu waschen die infizierten Zellen) entfernen Sie die HEK 293 Zellwachstumsmedium nach 18 Stunden einND waschen jede Kulturschale mit 5 ml TD-Puffer.
- Entfernen Sie das TD-Puffer Waschlösung und 10 ml Aha Kennzeichnung Medium zu jeder Kulturschale. Als Kontrolle sollte Methionin Steuermedium anstelle des Aha Kennzeichnung Medium bei diesem Schritt verwendet werden.
- Inkubieren der infizierten Zellen in Markierungen Medium bei 37 ° C für 6 Stunden. Beschriften kann jederzeit durchgeführt werden, zwischen 12 - 24 h nach der Infektion, sollte aber nicht länger als 6 Stunden Dauer. Dieses Intervall wurde bestimmt, um Überschneidungen mit viralen Strukturprotein-Übersetzung zu maximieren und gleichzeitig die Infektiosität nicht wesentlich vermindert. 7
- Entfernen Sie vorsichtig die Kennzeichnung Medium, um nicht zu stören, die Zellen. 10 ml frisch HEK 293 Zellwachstumsmedium zu jedem Gericht und Inkubation der Zellen bei 37 ° C für weitere 18 Stunden. Um den Verlust von infizierten Zellen während dieses Schritts zu minimieren, ist es nicht erforderlich, die Kennzeichnung, die vollständig zu entfernen. Die HEK 293-Zelle Wachstumsmedium enthält einen Überschuss an Met was wird outcompete restliches Aha.
- Schritt 3 für die Reinigung fort.
2. Herstellung von Azido-Zucker-markierten Adenovirus
- Folgen Sie den Anweisungen unter dem Titel Die Produktion von Aha-markierten Adenovirus bis einschließlich Schritt 1.5.
- Bereiten Sie 100 ml Azido-Zucker Kennzeichnung Medium.
- Decken Sie die Zellen mit 10 ml frischem Azido-Zucker Kennzeichnung Medium und Inkubation bei 37 ° C für 44 Stunden.
3. Die Reinigung von Azid-markierten Adenovirus-Partikeln
- Entfernen Sie die Medien zusammen mit den infizierten Zellen aus jeder Kulturschale und Transfer zum konischen Röhrchen. Zentrifugieren bei 2.000 g für 10 min bei 4 ° C Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in TD-Puffer (mit 8 ml TD-Puffer pro 10 Gerichte).
- Lyse der infizierten Zellen durch wiederholte (3 oder mehr) Frost-Tau-Zyklen mit Hilfe eines Dewar-Gefäß mit flüssigem Stickstoff und einem 37 ° C warmes Wasserbad. Zentrifugieren bei 2.000 g für 10 minbei 4 ° C, um die Zelltrümmer aus dem Überstand abzutrennen.
- Vorbereiten einer CsCl-Dichtegradienten-Zentrifugenröhrchen pipettiert, indem zuerst 2,5 ml 1,25 g / ml CsCl-Lösung in eine Ultra Clear Zentrifugenröhrchen. Als nächstes wird mit einer Pipette mit seiner Spitze an der Unterseite des Rohrs positioniert ist, um langsam 2,0 ml von 1,4 g / ml CsCl-Lösung, dabei nicht um den Gradienten-Schnittstelle zu stören.
- Pipettieren des Überstands von Schritt 3.2 auf dem CsCl-Dichtegradienten-Rohr, und ggfs. TD Puffer, um die Röhre zu füllen. Zentrifugieren Sie die Proben in einem Ausschwingrotor bei 125.000 g für 1 Stunde bei 15 ° C in einer Ultrazentrifuge.
- Nach Beendigung der Ultrazentrifugation, sollte die Viruspartikel sichtbar als eine dicke weiße Band an der Grenzfläche der beiden CsCl-Lösungen. Einen kleine Perforation an der Unterseite des Rohres mit einer sterilen Nadel, daß die Lösung tropfenweise zu entwässern.
- Sammeln Sie die dicken weißen Band, sollte das enthalten die markierten Partikel Ad5, taking Sorgfalt auszuschließen überschüssige CsCl-Lösung. Vermeiden Sammeln zelluläre Proteine, die über der Schicht-Virus Band. Zusätzlich auszuschließen leer Virion Kapside, die eine leichtere Schicht leicht über dem dicken weißen Virus Band zu gründen.
- Optional kann eine endgültige Reinigung auf den markierten Ad5 Partikel. In der gesammelten Fraktion aus Schritt 3.6 mit einem 4-ml Ultrazentrifuge Röhrchen und füllen das Rohr mit 1,35 g / ml CsCl-Lösung. Zentrifugieren bei 125.000 g für 18 h bei 15 ° C und sammelt das dicke weiße Bande, die in der Mitte des Rohres wie in den Schritten 3.5 und 3.6 beschrieben bildet. (Beachten Sie, dass, wenn der virale Titer niedrig ist, ein weißes Band möglicherweise nicht sichtbar nach der zweiten Zentrifugation, und es wird nicht möglich sein, um den markierten Virus wiederherzustellen).
- Für die Lagerung der Viruspartikel über lange Zeiträume, sollte Dialyse des abgefangenen Virus Extrakt gegen Viren Speicherpuffer durchgeführt werden. Lagern Sie die dialysierte Virus-Proben bei -80 ° C
4. LiEINZUGEHEN von modifizierten Adenovirus-Partikeln mit Alkin-Probes mit dem Stamm-Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC)
- Zu einer Lösung von 50 ul azidmodifizierten Ad5 Virus in Speicher-Puffer, fügen 0,25 ul SPAAC Kennzeichnung Lösung. (Siehe Tabelle von Reagenzien für eine Liste von Verkäufern im Handel erhältliche gespannten Alkinen).
- Lassen Sie die spannungskatalysierten Cycloaddition über Nacht bei Raumtemperatur. Wenn ein Licht-empfindliche Sonde (zB TAMRA) verwendet wird, deckt das Reaktionsgefäß mit Aluminiumfolie.
- Reinigen Sie die markierten Virus nach 6 fort.
5. Ligation modifizierte adenovirale Partikel mit Alkin-Sonden unter Verwendung von Kupfer (I)-Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) in entgastem Atmosphere
- Platz 7,2 mg Kupfer (I) bromid (CuBr) Pulver in ein Eppendorf-Röhrchen, mit Aluminiumfolie abgedeckt.
- Pipettieren von 1 ml DMSO in einem zweiten Eppendorf-Röhrchen.
- Vorbereiten50 ul CuAAC Kennzeichnung Lösung in einem dritten Eppendorf-Röhrchen. Mit Alufolie abdecken, wenn das Alkin Sonde ist lichtempfindlich (zB TAMRA-Alkin).
- Legen Sie die drei Eppendorf-Röhrchen, nicht begrenzten, in einem desoxygeniertem Handschuhsacks für 6 Stunden. Alle Proben sollten im Inneren des Handschuhs Beutel bis zum Abschluss der CuAAC bleiben.
- Herstellen einer 50 × Stammlösung von CuBr durch Zugabe von 1 ml DMSO und 7,2 mg CuBr Pulver, die beide gemäß 5.4 Schritt wurde von Sauerstoff befreit.
- Initiieren Sie die CuAAC durch Pipettieren 1 ul dieser CuBr Stammlösung zu 50 ul der CuAAC Kennzeichnung Lösung, die nach 5.4 Schritt wurde von Sauerstoff befreit. Lassen Sie die Reaktion für 12 Stunden in der Glovebag gehen.
- Reinigen Sie die markierten Virus nach 6 fort.
6. Reinigung und Lagerung von Labeled Viruspartikeln
- Aufreinigung der markierten Virus Proben mittels Centri-Sep Gelfiltration Spin columns äquilibriert mit Virus Lagerpuffer, nach den Richtlinien des Herstellers.
- Alternativ kann die Reinigung durch Dialyse gegen Virus Lagerpuffer durchgeführt werden.
- Die markierten Viruspartikeln sollten bei -80 ° C gelagert werden
7. SDS-PAGE von Labeled Adenovirus & Fluoreszenzgel Scanning
- Je 20 ul Laemmli-Probenpuffer (2 ×) bis 20 ul des gereinigten Virus beschriftet und die Mischung 10 min. Zentrifugieren Sie die Proben für 30 Sekunden, jede unlösliche Niederschläge zu entfernen. Wenn Restkupfer ist nach der Reinigung gibt, können Kochen der Probe in dicken Streifen von Protein auf der SDS-PAGE-Gel führen, was Schwierigkeiten bei der Visualisierung. In diesem Fall verzichtet Sieden der Probe in diesem Schritt.
- Bringen Sie die Gelkassette dem Elektrophorese-Zelle und fügen Laufpuffer. Laden Sie die benötigte Anzahl von Vertiefungen mit den viralen Protein-Proben. Verwenden Sie eine gut vor, stai ladenNed Molekulargewichtsmarker. Führen Sie das Gel für 1 Stunde bei 200 V. Halten Sie die Elektrophorese-Zelle mit Alu-Folie während des gesamten Zeitraums gedeckt zu reduzieren Ausbleichen des Fluorophors Etikett.
- Für eine optimale Auflösung und damit alle freien Fluorophor zu entfernen, damit das Tracking-Farbstoff zu laufen aus dem Gel während der Elektrophorese. Stoppen Sie die Elektrophorese und schnelle Übertragung des Gels mit einem fluoreszierenden Gel-Scanner und scannen Sie das Gel für die Fluoreszenz-Emission bei der entsprechenden Wellenlänge (574 nm für TAMRA).
- Die Anzahl der Farbstoffmoleküle, konjugiert an jedem viralen Partikel können durch Messen der Fluoreszenz von mehreren Standard-TAMRA-Konzentrationen und Vergleichen mit der Probe aus Schritt 7.3 quantifiziert werden.
8. Repräsentative Ergebnisse
Die beobachteten Ergebnisse der SDS-PAGE-Gel & fluoreszierende Scannen von TAMRA-konjugierten Ad5 sind in Abbildung 3 dargestellt. Obwohl diese fluoreszierende Gel-Scans wurden an Proben durchgeführt ModiFied über CuAAC, sollten die Ergebnisse vergleichbar sein, wenn Sonden über SPAAC werden ligiert. Diese Gel-Scans zeigen, dass Aha Kennzeichnung Ergebnisse in der Modifikation der drei Ad5-Capsidproteine (Hexon, Penton und Fiber) und Zucker Kennzeichnung ändert nur das Fiber-Kapsidprotein. Darüber hinaus eine Erhöhung der Konzentration Aha (4 mM gegenüber 32 mM) führt zu einem größeren Grad von Aha Einbau, aber es ist auch gezeigt worden, um die Infektionsgefahr zu verringern. Vor 7 Ergebnisse zeigen, dass für Ad5 in 4 mM produziert Aha, rund 5% des exponierten Standorten TAMRA-Methionin modifiziert, mit diese Zahl stieg auf 10% bei 32 mM Aha verwendet wird, sind. Dies entspricht etwa 280 und 510, bzw. Farbstoff-markierten Stellen pro Ad5 Teilchens. Die Analyse der Zucker-Kennzeichnung 1 hat gezeigt, dass rund 22 der 36 Glykosylierungsstellen auf Ad5 durch eine Azido Zucker belegt und anschließend mit TAMRA beschriftet.
Wenn zehn Zellkulturplatten werden verwendet, um azidmodifizierten Ad5 produzieren wie beschrieben in diesem Protokoll, 200 - 300 ul sollte azidmodifizierten Virus aus dem weißen Band in Schritt 3.6 gesammelt werden, werden mit einem Titer von etwa 1,5 × 10 12 Partikel / ml. Eine häufige Schwierigkeit dieses Verfahrens ist das Fehlen eines viralen Bande bei diesem Reinigungsschritt, was zu einer geringen Virustiter zurückzuführen ist. Dies ist im Allgemeinen ein Ergebnis der Infektion von Zellen, die entweder über-oder unter-konfluent, oder durch Waschen entfernt Zellen sind -, die sich aus der Platte nach der Infektion gelockert - beim Spülen während Schritt 1.
Abbildung 1. Protokoll Überblick. Azidhaltigen Aha oder GalNAz wird zunächst in Adenovirus-Partikeln eingearbeitet. Ligation mit einem Fluoreszenz-Alkin-Sonde wird dann über "Klick"-Chemie durchgeführt. Schließlich wird SDS-PAGE verwendet, um die Ligation der fluoreszierenden Sonde nachzuweisen.
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Abbildung 2. Ligation von Alkin-Sonde auf Azid-modifizierten Virus über (a) SPAAC, (b) CuAAC unter de-Sauerstoff angereichert und (c) mit Sauerstoff angereicherten Atmosphäre.
Abbildung 3. Fluoreszenz-Scans von SDS-PAGE von Azid-markierten Adenovirus Typ 5 (Ad5) nach CuAAC Konjugation mit TAMRA-Alkin. (A) Aha-markierten Ad5, mit zwei Konzentrationen von Aha. Markierung erscheint auf dem Adenovirus Hexon, Fiber Penton und Capsidproteine auftreten, wobei das Ausmaß der Erhöhung Kennzeichnung mit erhöhter Konzentration Aha. (B) AC 4 GalNAz-markierten Adenovirus scheint nur auf der Faser Kapsid-Protein markiert werden.
| Lösung | Vorbereitung | Hinweise |
| Ad5-Speicherpuffer | 5 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 0,5 mM MgCl 2, 50 mM NaCl, 25% (v / v) Glycerin und 0,05% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) | Lagerung bei -20 ° C |
| Ad5 Infektion Puffer | 2% (v / v) Kälberserum, 1 × Tc-Lösung, Ad5 in Vorratspuffer (Volumen unter Verwendung einer MOI von 10 PFU / Zelle und einer Infektiosität Index von 1:20). Man bringt die Lösung auf das Endvolumen mit TD-Puffer | Ad5-Konzentration kann durch UV-Absorption bestimmt werden. |
| TC-Lösung (200 ×) | 136 mM CaCl 2, 100 mM MgCl 2 | Lagerung bei 4 ° C |
| TD-Puffer | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,07 mM Na 2 HPO 4 und 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 | Lagerung bei 4 ° C |
| HEK 293-Zelle Wachstumsmedium | Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% (v / v) Kälberserum (BCS) und 1% (v / v) Pen Strep ergänzt | Lagerung bei 4 ° C |
| Cys-Stammlösung (100 ×) | DMEM (-Met / Cys-) mit 200 mM L-Cystein ergänzt | Bereiten Sie frische und Filter mit einem 0,2-um sterile Spritze-Filter vor dem Gebrauch. |
| Aha-Stammlösung (25 ×) | DMEM (-Met / Cys-) mit 100 mM L-Azidohomoalanine ergänzt | Bereiten Sie frische und Filter mit einem 0,2-um sterile Spritze-Filter vor dem Gebrauch. |
| Aha Kennzeichnung Medium | DMEM (-Met / Cys-) mit 10% BCS, Aha-Stammlösung (1 ×), 2 mM L-Cystein ergänzt | Bereiten Sie vor Gebrauch frisch. Dies entspricht einer 4 mM conzentration von Aha, obwohl unterschiedlichen Konzentrationen verwendet werden (siehe repräsentative Ergebnisse) werden. |
| Met-Stammlösung (25 ×) | DMEM (-Met / Cys-) mit 100 mM L-Methionin ergänzt | Bereiten Sie frische und Filter mit einem 0,2-um sterile Spritze-Filter vor dem Gebrauch. |
| Met Steuermedium | DMEM (-Met / Cys-) mit 10% BCS ergänzt, Met-Stammlösung (1 ×), 2 mM L-Cystein | Bereiten Sie vor Gebrauch frisch. |
| AC 4 GalNAz Stammlösung (1000 ×) | 50 mM N-peracetylierten azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) in Methanol | Lagerung bei 4 ° C. AC 4 GalNAz ist ein metabolischer Vorläufer zu GlcNAz. |
| Azido-Zucker Kennzeichnung Medium | 100 ul AC 4 GalNAz Stammlösung, 100 ml HEK 293 Zellwachstumsmedium | Willkommen Methanol zu verdampfen, um vor Zugabe HEK 293-Zelle Wachstumsmedium. |
| Cäsiumchlorid Lösungen | CsCl in TD-Puffer gelöst: 1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml H 2 O) 1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml H 2 O) 1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml H 2 O) | Dichtegradienten-Ultrazentrifugation für |
| Virus-Speicherpuffer | Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2, enthaltend 0,5 mM CaCl 2, 0,9 mM MgCl 2 und 10% (v / v) Glycerin | Lagerung bei -20 ° C |
| TAMRA-BCN (SPAAC) Etikettierlösung | TAMRA-BCN in DMSO:
| Spannungskatalysierten Alkin-Sonde Für SDS-PAGE, ein viraler Titer von ca. 10 12 Partikel / ml wird vorgeschlagen |
| TAMRA-Alkin (CuAAC) Etikettierlösung | 50 ul azidmodifizierten Ad5 Virus in Speicher-Puffer (N Ad5 wie oben bestimmt), 1,5 mM Batho Phenanthrolin disulfonat (dh 1,5 × CuBr endgültige Konzentration), TAMRA-Alkin. TAMRA-Alkin-Molarität (in Mio.) wird unter Verwendung von: c Alk = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo) (So dass das Reaktionsgemisch in Schritt 5 hergestellt 100 Alkin Sonden pro Virion enthält) | Tris-Puffer ist dafür bekannt, eine wettbewerbsfähige und inhibitorische Liganden von Kupfer sein. 8 |
| Laemmli-Probenpuffer (2 ×) | 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w / v) SDS, 20% (v / v) Glycerin, 10% (v / v) 2-Mercaptoethanol und 0,004% (w / v) Bromphenolblau | |
| Laufpuffer | 187 mM Glycin, 19 mM Tris-HCl, 3,5 mM SDS in H 2 O | Lagerung bei 4 ° C |
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Discussion
Die Entwicklung der chemoselektiven und bioorthogonale Click-Reaktionen, einschließlich derer von Aziden, ist eine sich schnell entwickelnde Gebiet der Forschung, und anschließend gibt es eine wachsende Zahl dieser Reaktionen aus für Biokonjugation Anwendungen wählen. Wir haben den Rahmen dieses Protokoll darauf beschränkt, nur zwei Methoden, die wegen ihrer Nützlichkeit in unserem eigenen Labor und kommerzielle Verfügbarkeit aller Reagenzien wurden so gewählt sind.
In der ersten solchen Route - Dehnungs-Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) - das Alkin wird innerhalb eines Cyclooctin Ring (Abbildung 2a) enthalten sind. Das kürzlich entwickelte Methode kann unter sauerstoffhaltiger Atmosphäre und ohne die Notwendigkeit eines Kupfer-Katalysators durchgeführt werden. 9,10 Bis vor kurzem war ein Nachteil dieser Methode die aufwendige Synthese und reduzierten kommerziellen Verfügbarkeit dieser gespannten Alkinen im Vergleich mit der terminalen Alkinen in verwendet Kupfer (I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC), jedoch ist eine wachsende Bibliothek von diesen Sonden jetzt im Handel erhältlich (siehe Tabelle von Reagenzien). Aus diesen Gründen haben wir SPAAC als Methode der Wahl in diesem Protokoll gewählt.
Auch in diesem Protokoll beschrieben ist die Unterbindung der Azid-modifizierte adenovirale Partikel über CuAAC in sauerstofffreiem Atmosphäre mit Bathophenanthrolin disulfonsäuredinatriumsalz (BDA) als Chelatbildner (Abbildung 2b). Diese Methode ist, daß die BDA Katalysator beide im Handel erhältlich und kostengünstig praktisch. Darüber hinaus berichteten Erträge sind in der Regel höchste der verfügbaren Methoden und Komplikationen, die aus der Erzeugung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (vgl. oxygenierten CuAAC, unten) in der Lösung vermieden werden. 8 Allerdings ist die Kupfer (I)-Katalysator bekannt ist, dass zytotoxische, 11 und die spezielle Ausrüstung erforderlich, dieses Verfahren zu implementieren kann einige Gruppen von der Nutzung abhalten. Dennoch finden wir diese Methode effizient und nützlich fürAdenovirus Modifikation.
Eine dritte nützliche Methode CuAAC wurde vor kurzem entwickelt, um unter oxygenierten atmosphärischen Bedingungen (Abbildung 2c) zu arbeiten. 8 Diese Methode erfreut sich die gleichen Vorteile wie der BDA-Chelat-Ansatz, sondern nutzt stattdessen THPTA als Chelatbildner gegenüber Luftsauerstoff, ohne oxidative Zerstörung der Platz für das Substrat. Ein kleiner Nachteil dieses Ansatzes ist der derzeitige Mangel an kommerzielle Verfügbarkeit von THPTA, obwohl einfache Synthesen dieser Chelatbildner berichtet worden. 8 Obwohl wir nicht diese Ligationsmethode auf unser eigenes System durchgeführt haben, THPTA / CuAAC zu erwarten wäre, um vergleichbare werden Ergebnisse zu BDA / CuAAC, mit dem zusätzlichen Komfort von mit Sauerstoff angereicherten Atmosphäre der Toleranz.
Trotz absichtlich Entwicklung dieses Protokolls um kommerziell erhältliche Materialien, wir immer noch an die Kostenvorteile und mehr Flexibilität zu synthetisieren die erkennenAziden und Alkinen Sonden hierin verwendet wird. Azidohomoalanine kann in weniger als drei Tage und für deutlich weniger als kommerziellen Quellen vorbereitet werden. 6,12 Berichtet ein gespanntes Alkin Vorbereitungen sind schwieriger 11, sondern leisten größere Freiheit bei der Auswahl Sonde.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten die NSF für die Finanzierung (CBET-0846259) anerkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 | |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 | |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 | |
| Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 | |
| Cell culture CO2 incubator | |||
| Hemocytometer | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) | |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | ||
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| Sterile needle, 18 gauge | |||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | |||
| Dewar flask | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Electrophoresis cell | |||
| Fluorescent gel scanner | |||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| Methanol | |||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | |||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| 1M HCl | |||
| Glycerol | |||
| Bovine Serum Albumin | |||
| L-cysteine | |||
| L-methionine | |||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | |||
| 2-mercapt–thanol | |||
| Glycine | |||
| Bromophenol blue | |||
| Cesium Chloride (CsCl) | |||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | |||
| Potassium Chloride (KCl) | |||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | |||
| Alkyne probe for CuAAC* | |||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 | |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | |||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 | |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs. |
|||
References
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