Summary
חלקיקים adenovirus מתוכננים להכיל אנלוגי טבעי חומצת אמינו azidohomoalanine או סוכר azido
Abstract
שינוי של חלקיקי נגיף קיבל כמות משמעותית של תשומת לב פוטנציאל אדיר שלו להשפיע על ריפוי גנטי, יישומים oncolytic ופיתוח החיסון. 1,2,3 גישות שוטפות למשקי שינוי משטחים ויראלי, שהם בעיקר גנטיקה מבוסס, לעיתים קרובות סובלים הנחתה התמרה של ייצור וירוס, infectivity ו הסלולר. 4,5 באמצעות כימיה לחץ chemoselective, פיתחנו גישה חלופית פשוטה אשר עוקפת בעיות אלה תוך שמירה הן גמישות מאוד נגיש. 1,2
מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את היעילות של שימוש כימיה לחץ bioorthogonal לשנות את פני השטח של סוג adenovirus 5 חלקיקים. תהליך זה שני שלבים ניתן להשתמש גם טיפולית 1 או אנליטי, 2,6 כפי שהוא מאפשר קשירת chemoselective של מולקולות, צבעים מיקוד או מולקולות אחרות של עניין על חלבוניםמראש תווית עם תגי אזיד. שלושת היתרונות העיקריים של השיטה הם (1) תיוג מטבולית מדגים מעט השפעה על כושר ויראלי, 1,7 (2) מגוון רחב של ligands מפעיל יכול להיות מנוצל, ו (3) הוא מהיר להפליא, אמינות קל לגשת. 1,2,7
בשלב הראשון של הליך זה, חלקיקים adenovirus מיוצרים הנושא או azidohomoalanine (אהה, פונדקאית מתיונין) או סוכר טבעי O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ושניהם מכילים אזיד (N-3) פונקציונלית הקבוצה. לאחר טיהור של אזיד-Modified חלקיקי נגיף, בדיקה alkyne המכיל מחצית ניאון טמרה הוא ligated באופן chemoselective על חלבונים או גליקופרוטאינים מראש שכותרתו. לבסוף, ניתוח SDS-PAGE מתבצע להפגין קשירת מוצלח של החללית על גבי חלבונים נגיפיים קפסיד. שילוב אהה מוצג לתייג כל capsid ויראליחלבונים (Hexon, פנטון ו Fiber), בזמן O-GlcNAz תוצאות לשילוב תיוג של סיבים בלבד.
בתחום זה מתפתחת, מספר שיטות קשירת אזיד-alkyne פותחו בהצלחה, אך רק 2 מצאנו להיות הנוחה ביותר הם הפגינו להלן - זן, לקדם אזיד-alkyne בחיי בן אשר (SPAAC) ונחושת-catalyzed אזיד-alkyne בחיי בן אשר (CuAAC) תחת אווירה deoxygenated.
Protocol
עיין בטבלה 1 עבור הכנה של כל מדיה, מאגרים ופתרונות המוזכרים בפרוטוקול זה.
1. הפקה של adenovirus אהה שכותרתו
- הכן אחד עשר 100 מ"מ בתרבית רקמה מנות של האדם תאים עובריים כליה (HEK 293) מוחזקים בינוני HEK 293 צמיחת תאים (ראה לוח 1) על 37 מעלות צלזיוס עד שהם הגיעו 80-90% confluency. (הערה:. תרבויות עם confluency מעל 90% עלול להיות קשה להדביק והוא לא יכול לייצר וירוסים לפי הצורך)
- שחרר את התאים באחת המנות של 1 הסרת גידול בינוני, שטיפה פעם אחת עם 5 מ"ל של חיץ TD, ולאחר מכן דוגרים התאים דקות 1 ב 1 מ"ל של טריפסין-EDTA (1 ×).
- הוסף 9 מ"ל של מדיום HEK 293 צמיחת תאים, ולהשתמש hemocytometer לספור את מספר שנקטפו HEK 293 תאים המנה הזו. השתמש במספר זה כדי לחשב את כמות סוג adenovirus 5 (Ad5) נדרש זיהום באמצעות multiplicity של זיהום (משרד הפנים) הערך של 10 PFU / התא. להסביר את העובדה שבמשך Ad5 רגיל, מדד infectivity (יחס של חלקיקים עלולים לעבור גם המספר הכולל של חלקיקים) הוא בדרך כלל 1:20.
- הכן 10 מ"ל של חיץ זיהום.
- לאט לאט להסיר את הגידול 293 HEK בינוני תא מעשרת הכלים תרבות הנותרים, ואז לשטוף עם 5 מ"ל של חיץ TD. הוסף 1 מ"ל של חיץ זיהום לצלחת כל דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. במהלך תקופה זו זיהום, בעדינות לנענע כל תוספת התרבות לצד ב 15 דקות במרווחים.
- לאחר ההדבקה, להוסיף 9 מ"ל של טרי בינוני HEK 293 תא הצמיחה דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
- הכינו 100 מ"ל של מדיום תיוג אהה (או פגשתי בינוני בקרת שליטה). הקפד לסנן את המניות פתרונות מרוכזים עם מסנן 0.2 מיקרומטר, מזרק סטרילי לפני הכנת התקשורת תיוג.
- בזהירות (כדי לא לשטוף את התאים הנגועים) להסיר את הגידול 293 HEK בינוני התא לאחר 18 שעותND לשטוף כל צלחת תרבות עם 5 מ"ל של חיץ TD.
- הסר את פתרון TD לשטוף המאגר ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום תיוג אהה לצלחת בכל תרבות. עבור פקד, בינוני השליטה מתיונין יש להשתמש במקום בינוני תיוג אהה בשלב זה.
- דגירה של תאים נגועים על תווית בינוני על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 6. תיוג יכול להתבצע בכל עת בין 12-24 שעות לאחר הפגיעה, אך לא צריך להיות יותר מ 6 שעות של זמן. מרווח זה נקבע על מנת למקסם את החפיפה עם תרגום ויראלי חלבון מבני infectivity תוך הקפדה לא פחתה באופן משמעותי. 7
- מוציאים בזהירות את המדיום תיוג כדי לא לשבש את התאים. הוסף 10 מ"ל של טרי בינוני HEK 293 צמיחת תאים לצלחת כל דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות אחר. כדי להקטין את איבוד של תאים נגועים במהלך שלב זה, אין צורך להסיר את הפתרון תיוג לחלוטין. 293 הצמיחה HEK בינוני התא מכיל עודף של Met אשר outcompete כל אהה שיורית.
- עבור לשלב 3 לטיהור.
2. הפקה של adenovirus Azido סוכר שכותרתו
- בצע את ההליך בשם הפקת adenovirus אהה שכותרתו עד וכולל שלב 1.5.
- הכינו 100 מ"ל של מדיום Azido סוכר תיוג.
- לכסות את התאים עם 10 מ"ל של מדיום Azido סוכר טרי תיוג דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 44 שעות.
3. טיהור אזיד שכותרתו חלקיקים adenoviral
- הסר את המדיה יחד עם תאים נגועים של כל מאכל תרבות העברת צינורות דמויי קונוס. סרכזת ב ז 2000 ב 10 דקות 4 ° C. הסר את supernatant ו resuspend גלולה במאגר TD (באמצעות 8 מ"ל של חיץ TD ל 10 מנות).
- Lyse את התאים הנגועים על ידי חוזרות (3 או יותר) להקפיא ההפשרה מחזורי באמצעות בקבוק ויסקי של חנקן נוזלי ו - 37 ° C אמבט מים. סרכזת על 2000 גרם של 10 דקותב 4 ° C להפריד פסולת מן התא supernatant.
- הכן את צפיפות CsCl שיפוע הצינור על ידי צנטריפוגה 1 pipetting 2.5 מ"ל של תמיסת גרם / מ"ל 1.25 CsCl לתוך צינור צנטריפוגות Ultra Clear. לאחר מכן השתמש פיפטה עם קצהו ממוקם בחלק התחתון של הצינור לאט להוסיף 2.0 מ"ל של 1.4 גרם / מ"ל פתרון CsCl, נזהרת שלא להפריע את ממשק הדרגתי.
- פיפטה supernatant משלב 3.2 על גבי צינור צפיפות CsCl צבע, ובמידת הצורך חיץ TD הוסף למלא את הצינור. בצנטריפוגה דגימות הרוטור דלי מתנדנד על 125.000 גרם של שעה 1 על 15 מעלות צלזיוס ultracentrifuge.
- לאחר השלמת ultracentrifugation, חלקיקי וירוס צריך להיות גלוי כלהקה לבנה עבה על הממשק של שני פתרונות CsCl. לעשות נקב קטן בחלק התחתון של הצינור בעזרת מחט סטרילית כדי לאפשר פתרון לניקוז dropwise.
- איסוף סרט לבן עבה, שאמור להכיל את שכותרתו Ad5 חלקיקים, לוקחתהטיפול גרם לכלול פתרון CsCl עודף. הימנע איסוף חלבונים תאיים אשר הלהקה מעל שכבת וירוס. בנוסף לכלול capsids virion ריקים היוצרים שכבת קל מעט מעל הלהקה וירוס עבה לבן.
- לחלופין, לבצע טיהור הסופי על Ad5 חלקיקים שכותרתו. להוסיף את החלק היחסי שנאספו צעד 3.6 לצינור 4-ml ultracentrifuge ולמלא את הצינור עם 1.35 גרם / מ"ל CsCl פתרון. סרכזת ב 125.000 גרם של 18 שעות ב 15 מעלות צלזיוס, לאסוף את סרט לבן עבה המהווה באמצע צינור כמתואר צעדים 3.5 ו -3.6. (שים לב, אם כייל הנגיף נמוכה, סרט לבן לא יכול להיות גלוי לאחר צנטריפוגה 2, ולא ניתן יהיה לשחזר את הנגיף הנקרא).
- לאחסון של חלקיקי וירוס על פני תקופות זמן ארוכות, דיאליזה של תמצית וירוס אסף יש לבצע נגד המאגר אחסון וירוס. אחסן את דגימות נגיף dialyzed ב -80 ° C.
4. ליgation של חלקיקים adenoviral השתנה עם בדיקות alkyne שימוש זן מקודם אזיד-alkyne בחיי בן אשר (SPAAC)
- לפתרון של μl 50 של אזיד-Ad5 שונה במאגר אחסון וירוס, מוסיפים 0.25 μl של פתרון תיוג SPAAC. (עיין בטבלה של חומרים כימיים כדי לקבל רשימה של venders של alkynes מתוחים זמינים מסחרית).
- לאפשר את תגובת המתח, לקדם להמשיך בחיי בן אשר לילה בטמפרטורת החדר. אם בדיקה רגיש לאור (למשל טמרה) משמש, מכסים את הכלי בנייר אלומיניום התגובה.
- לטהר את הנגיף סומנו על פי לשלב 6.
5. קשירת חלקיקים adenoviral השתנה עם בדיקות alkyne שימוש נחושת (אני)-Catalyzed אזיד-alkyne בחיי בן אשר (CuAAC) באטמוספירה Deoxygenated
- במקום 7.2 מ"ג נחושת (אני) ברומיד (CuBr) אבקת בצינור Eppendorf, מכוסה בנייר אלומיניום.
- פיפטה 1 מ"ל של DMSO לתוך צינור Eppendorf 2.
- להכין50 μl של פתרון תיוג CuAAC בצינור Eppendorf 3. לכסות בנייר אלומיניום אם בדיקה alkyne הוא רגיש לאור (למשל טמרה-alkyne).
- מניחים את שלוש שפופרות Eppendorf, הסיר את המכסה, בתוך שקית הכפפה deoxygenated עבור שעה 6. כל הדגימות צריך להישאר בתוך שקית הכפפות עד להשלמת התגובה CuAAC.
- הכן 50 × פתרון מלאי של CuBr על ידי הוספת 1 מ"ל של DMSO ל 7.2 מ"ג של אבקת CuBr, שניהם כבר deoxygenated בהתאם לשלב 5.4.
- ליזום את התגובה CuAAC ידי pipetting 1 μl של פתרון זה המניה CuBr ל μl 50 של פתרון תיוג CuAAC, אשר כבר deoxygenated בהתאם לשלב 5.4. אפשר להמשיך את התגובה של 12 שעות בתוך שקית הכפפות.
- לטהר את הנגיף סומנו על פי לשלב 6.
6. טיהור ואחסון של חלקיקי נגיף שכותרתו
- לטהר את דגימות נגיף שכותרתו באמצעות Centri-ספטמבר ג'ל סינון ספין גolumns equilibrated עם מאגר אחסון וירוס, בעקבות ההנחיות של היצרן.
- לחלופין, טיהור יכול להתבצע על ידי דיאליזה נגד מאגר אחסון וירוס.
- חלקיקי וירוס שכותרתו יש לאחסן ב -80 ° C.
7. SDS-PAGE של adenovirus תווית & סריקה ג'ל פלורסנט
- הוסף 20 μl חיץ Laemmli דגימה (2 ×) כדי μl 20 מטוהרים של וירוס הנקרא ו רתיחה במשך 10 דקות. בצנטריפוגה במשך 30 שניות דגימות כדי להסיר כל משקעים בלתי מסיסים. אם נחושת שיורי נמצא לאחר טיהור, הרתיחו את המדגם עלול לגרום פסים עבים של חלבונים על ג'ל SDS-PAGE, גורם קושי במהלך ההדמיה. במקרה זה, לוותר רותחים המדגם בשלב זה.
- צרף את הקלטת לתא ג'ל אלקטרופורזה ולהוסיף למאגר פועל. טען את המספר הנדרש של בארות עם דגימות חלבון נגיפי. 1 השתמש גם לטעון מראש staiנד סמני משקל מולקולרי. הפעל את הג'ל על שעה 1 ב 200 ו 'שמור על תא אלקטרופורזה מכוסה בנייר כסף במשך כל התקופה כדי לצמצם photobleaching של התווית fluorophore.
- להחלטה הטובה ביותר להסיר את כל fluorophore חופשי, לאפשר את הצבע מעקב נגמר ג'ל אלקטרופורזה במהלך. לעצור את אלקטרופורזה ובמהירות להעביר את הג'ל לסורק ג'ל ניאון ולסרוק את הג'ל על פליטת הקרינה באורך גל מתאים (574 ננומטר במשך טמרה).
- מספר של מולקולות צבע מצומדות כדי כל חלקיק נגיפי ניתן לכמת על ידי מדידת הקרינה של כמה ריכוזים טמרה סטנדרטיים השוואה עם דגימה משלב 7.3.
8. נציג תוצאות
התוצאות הנצפות של עמוד SDS & סריקה ג'ל הניאון של טמרה, מצומדות Ad5 מוצגים באיור 3. למרות הסריקות האלה ג'ל ניאון בוצעו על דגימות מודיfied דרך CuAAC, התוצאות צריך להיות דומה, כאשר בדיקות אלה ligated דרך SPAAC. אלה סריקות ג'ל עולה כי הידד תוצאות תיוג של שינוי משלושת Ad5 חלבונים קפסיד (Hexon, פנטון וסיבים), תוך סימון הסוכר משנה רק את החלבון capsid סיבים. יתר על כן, עלייה בריכוז אהה (4 מ"מ לעומת 32 מ"מ) גורמת במידה רבה יותר של שילוב אהה, אבל זה גם הוכח ירידה infectivity. תוצאות קודמות 7 עולה כי עבור Ad5 המיוצר 4 מ"מ אהה, בערך 5% מהאתרים מתיונין הם חשופים טמרה, העדכון האחרון, עם מספר זה גדל ל 10% כאשר 32 מ"מ אהה משמש. זה מתאים כ 280 ו 510, בהתאמה, צבען שכותרתו אתרים לכל חלקיק Ad5. ניתוח של תיוג סוכר 1 ציין כי בערך 22 מתוך 36 אתרים glycosylation על Ad5 תפוסות על ידי סוכר azido ומסומן לאחר מכן עם תמרה.
אם עשר תרבות צלחות רקמות משמשים לייצור אזיד-Ad5 שונה כמתואר בפרוטוקול זה, 200-300 μl של וירוס אזיד-modified יש לקבל הלהקה לבן שנאסף בשלב 3.6, עם כייל של כ -1.5 × 10 12 חלקיקים / מ"ל. הקושי המשותף של הליך זה הוא העדר הלהקה ויראלי בשלב זה טיהור, אשר ניתן לייחס titer ויראלי נמוך. זה בדרך כלל תוצאה של הדבקה של תאים אשר הם או מעל או מתחת confluent, או על ידי שטיפת תאים - אשר הופכים התיר מהצלחת לאחר ההדבקה - בזמן השטיפה במהלך שלב 1.
1. איור פרוטוקול סקירה. אזיד המכיל אהה או GalNAz משולב 1 לחלקיקים adenovirus. קשירת עם החללית alkyne ניאון מתבצע מכן באמצעות כימיה "קליק". לבסוף, SDS-PAGE משמש כדי להדגים קשירת בדיקה ניאון.
igure 2 "/>
איור 2. קשירת בדיקה alkyne על אזיד, שונה וירוס דרך (א) SPAAC, (ב) CuAAC תחת דה מחומצן (ג) האווירה מחומצן.
איור 3. סריקות הניאון של עמוד מסוג SDS-אזיד שכותרתו adenovirus 5 (Ad5) לאחר הצמידה CuAAC עם טמרה-alkyne. (א) אהה, שכותרתו Ad5, תוך שימוש בשני ריכוזי אהה. סימון נראה להתרחש Hexon adenovirus, פנטון ו סיב חלבוני קפסיד, עם היקף של תיוג הגדלת בריכוז אהה מוגברת. (ב) Ac 4 adenovirus GalNAz שכותרתו נראה שכותרתו רק חלבון capsid סיבים.
| פתרון | הכנה | הערות |
| Ad5 אחסון חיץ | 5 מ"מ טריס-HCl חיץ (pH 8.0) המכיל 0.5 מ"מ MgCl 2, 50 מ"מ NaCl, 25% (V / V) גליצרול, ו 0.05% (w / v) שור סרום אלבומין (BSA) | חנות ב -20 ° C |
| Ad5 זיהום חיץ | 2% (V / V) שור נסיוב של עגלים, 1 × פתרון TC, Ad5 במאגר אחסון (נפח נקבע באמצעות משרד הפנים של תא 10 / PFU ו אינדקס infectivity של 01:20). להביא את הפתרון הסופי באמצעות נפח TD חיץ | Ad5 ריכוז ניתן לקבוע באמצעות ספיגת UV. |
| TC פתרון (200 ×) | 136 mM CaCl 2, 100 מ"מ MgCl 2 | לאחסן ב 4 ° C |
| TD חיץ | 137 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 0.07 mM Na 2 HPO 4, ו 25 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5 | לאחסן ב 4 ° C |
| HEK 293 צמיחת תאים בינוני | בינוני שינוי Dulbecco של הנשרים (DMEM) השלימו עם 10% (V / V) שור עגל בסרום (BCS) ו 1% (V / V) פן סטרפטוקוקוס | לאחסן ב 4 ° C |
| המניות פתרון Cys (100 ×) | DMEM (-Met /-Cys) בתוספת 200 מ"מ L-ציסטאין | להכין טרי מסנן עם מסנן 0.2 מיקרומטר, מזרק סטרילי לפני השימוש. |
| אהה פתרון המניות (25 ×) | DMEM (-Met /-Cys) בתוספת 100 מ"מ L-Azidohomoalanine | להכין טרי מסנן עם מסנן 0.2 מיקרומטר, מזרק סטרילי לפני השימוש. |
| אהה תיוג בינוני | DMEM (-Met /-Cys) השלימו עם BCS 10%, הפתרון אהה המניות (1 ×), 2 מ"מ L-ציסטאין | להכין טרי לפני השימוש. זה מתאים 4 מ"מ גoncentration של אהה, אם כי בריכוזים שונים וניתן להשתמש בו (ראה תוצאות היציג). |
| פגש את הפתרון המניות (25 ×) | DMEM (-Met /-Cys) בתוספת 100 מ"מ L-מתיונין | להכין טרי מסנן עם מסנן 0.2 מיקרומטר, מזרק סטרילי לפני השימוש. |
| Met בינוני השליטה | DMEM (-Met /-Cys) השלימו עם BCS 10%, נפגש פתרון המניות (1 ×), 2 מ"מ L-ציסטאין | להכין טרי לפני השימוש. |
| AC 4 GalNAz פתרון המניות (1,000 ×) | 50 מ"מ peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) ב מתנול | לאחסן ב 4 ° C. AC 4 GalNAz הוא מבשר על חילוף החומרים GlcNAz. |
| Azido סוכר תיוג בינוני | 100 μl Ac 4 GalNAz פתרון המניות, 100 מ"ל 293 HEK צמיחה בינוני התא | אפשר מתנול להתאדות לפני הוספת HEK 293 צמיחה בינוני התא. |
| צזיום כלוריד פתרונות | CsCl מומס חיץ TD: 1.25 גרם / מ"ל (18.08 גר '/ 50 מ"ל H 2 O) 1.35 גרם / מ"ל (25.60 גר '/ 50 מ"ל H 2 O) 1.40 גרם / מ"ל (31.00 גר '/ 50 מ"ל H 2 O) | צפיפות הדרגתיים עבור ultracentrifugation |
| אחסון וירוס חיץ | פוספט בופר סליין (PBS), pH 7.2, 0.5 מ"מ המכילים CaCl 2, 0.9 mM MgCl 2, ו -10% (V / V) גליצרול | חנות ב -20 ° C |
| טמרה-BCN (SPAAC) תיוג פתרון | טמרה-BCN ב DMSO:
| זן, לקדם alkyne בדיקה עבור SDS עמודים, titer ויראלי של כ 10 12 חלקיקים / מ"ל מוצע |
| טמרה-alkyne (CuAAC) תיוג פתרון | 50 μl של אזיד-Ad5 שונה במאגר אחסון וירוס (N Ad5 כפי שנקבע לעיל), 1.5 mM batho phenanthroline disulfonate (כלומר 1.5 × ריכוז CuBr הסופית), טמרה, alkyne. טמרה-alkyne molarity (ב ז) נקבע באמצעות: ג ALK = 2 × 10 × 6 (Ad5 N / N AVO) (כך את תערובת התגובה מוכן בשלב 5 מכילה 100 בדיקות alkyne לכל virion) | טריס חיץ ידוע ליגנד תחרותי המעכבת של נחושת. 8 |
| Laemmli חיץ המדגם (2 ×) | 125 מ"מ טריס-HCl (pH 6.8), 4% (w / v) SDS, 20% (V / V) גליצרול, 10% (V / V) 2 mercaptoethanol, ו 0.004% (w / v) bromophenol כחול | |
| הפעלת המאגר | 187 mM גליצין, 19 מ"מ טריס-HCl, 3.5 mM SDS ב H 2 O | לאחסן ב 4 ° C |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התפתחות של תגובות לחץ chemoselective ו bioorthogonal, כולל אלה של azides, הוא אזור מתפתח במהירות, מחקר, ולאחר מכן יש מספר גדל והולך של התגובות הללו לבחירה עבור יישומים bioconjugation. הגבלנו את היקף פרוטוקול זה כך שיכלול רק שתי שיטות אשר נבחרו בשל התועלת שלהם במעבדה שלנו וזמינות מסחרית של חומרים כימיים כל.
במסלול הראשון מסוג זה - זן, לקדם אזיד-alkyne בחיי בן אשר (SPAAC) - alkyne נכלל בתוך טבעת cyclooctyne (איור 2 א). שיטה זו פותחה לאחרונה ניתן לבצע תחת אווירה מחומצן וללא צורך זרז נחושת. 9,10 עד לאחרונה, חיסרון אחד של שיטה זו היא סינתזה מייגע וזמינות מסחרית מופחת של אלה alkynes מתוחים לעומת מסוף alkynes שימוש נחושת (אני)-catalyzed אזיד-alkyne בחיי בן אשר (CuAAC), עם זאת, ספרייה הולכת וגדלה של בדיקות אלה זמין כעת מסחרית (ראה טבלה של חומרים כימיים). מסיבות אלה, בחרנו SPAAC כשיטת הבחירה בפרוטוקול זה.
מתואר גם בפרוטוקול זה הוא קשירת אזיד-Modified חלקיקים adenoviral באמצעות CuAAC באווירה deoxygenated באמצעות bathophenanthroline disulfonic הרכב: חומצה מלח (BDA) כסוכן chelating (איור 2b). שיטה זו נוחה היא זרז BDA גם זמינים מסחרית וזולה. יתר על כן, דיווח התשואות הגבוה ביותר הם בדרך כלל משיטות, וסיבוכים הנובעים הדור של מינים החמצן מגיב (ראה מחומצן CuAAC, להלן) פתרון נמנעים. 8 עם זאת, נחושת (אני) זרז ידוע ציטוטוקסיות, 11 ו ציוד מיוחד הדרוש כדי ליישם הליך זה עשוי להרתיע כמה קבוצות מלהשתמש בה. עם זאת, אנו מוצאים שיטה זו יעילה שימושיadenovirus שינוי.
השיטה שימושית 3 של CuAAC פותחה לאחרונה לעבוד בתנאים אטמוספריים מחומצן (איור 2 ג). 8 שיטה זו נהנה מאותן הטבות כמו הגישה BDA-לטיפולי קלאציה אבל משתמש THPTA במקום כסוכן chelating כדי להכיל חמצן אטמוספרי ללא הרס חמצוני של המצע. חסרון אחד קטן של גישה זו היא חוסר הנוכחי של הזמינות המסחרית של THPTA, למרות סינתזות פשוטות של הסוכן chelating דווחו. 8 למרות שלא ביצעו בשיטה קשירת במערכת שלנו, THPTA / CuAAC יהיה צפוי לייצר דומה התוצאות BDA / CuAAC, עם נוחות הוסיף אווירה של סובלנות מחומצן.
למרות בכוונה לפתח את פרוטוקול סביב חומרים זמינים מסחרית, אנחנו עדיין רוצים להכיר את יתרונות העלות וגמישות מוגברת של סינתזהazides ו בדיקות alkyne בשימוש במסמך זה. Azidohomoalanine יכול להיות מוכן בתוך זמן קצר של 3 ימים עבור משמעותית פחות ממקורות מסחריים. 6,12 מדווחים ההכנות alkyne מתוחים קשה יותר 11 אבל להרשות לעצמם חופש הבחירה בדיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
ברצוננו להודות NSF למימון (CBET-0846259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 | |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 | |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 | |
| Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 | |
| Cell culture CO2 incubator | |||
| Hemocytometer | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) | |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | ||
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| Sterile needle, 18 gauge | |||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | |||
| Dewar flask | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Electrophoresis cell | |||
| Fluorescent gel scanner | |||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| Methanol | |||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | |||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| 1M HCl | |||
| Glycerol | |||
| Bovine Serum Albumin | |||
| L-cysteine | |||
| L-methionine | |||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | |||
| 2-mercapt–thanol | |||
| Glycine | |||
| Bromophenol blue | |||
| Cesium Chloride (CsCl) | |||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | |||
| Potassium Chloride (KCl) | |||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | |||
| Alkyne probe for CuAAC* | |||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 | |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | |||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 | |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs. |
|||
References
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
- Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
- Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
- Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
- Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
- Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
- Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
