Summary
Partículas de adenovirus se han diseñado para contener la natural azidohomoalanine análogo del ácido amino o el azúcar azida
Abstract
La modificación de las partículas del virus ha recibido una cantidad significativa de la atención por su enorme potencial para impactar en la terapia génica, aplicaciones y desarrollo de vacunas oncolíticos. 1,2,3 Los enfoques actuales para la modificación de las superficies virales, que son en su mayoría basado en la genética, a menudo sufren de atenuación de producción de virus, la infectividad y celulares de transducción de 4,5. Uso de la química clic quimioselectiva, hemos desarrollado un método alternativo sencillo que deja de lado estos temas sin dejar de ser altamente flexible y accesible. 1,2
El objetivo de este protocolo es demostrar la efectividad del uso de la química clic bioorthogonal para modificar la superficie de adenovirus tipo 5 partículas. Este proceso de dos pasos puede ser utilizado tanto terapéuticamente 1 o analíticamente, 2,6, ya que permite la ligadura quimioselectiva de moléculas dirigidas, colorantes u otras moléculas de interés en las proteínaspre-etiquetados con etiquetas de azida. Las tres principales ventajas de este método son que (1) marcado metabólico demuestra poco o ningún impacto en la replicación viral, 1,7 (2) una amplia gama de ligandos efectores pueden ser utilizados, y (3) es muy rápido, fiable y de fácil acceso. 1,2,7
En el primer paso de este procedimiento, se producen partículas de adenovirus teniendo cualquiera azidohomoalanine (Aha, un sustituto metionina) o el azúcar no natural O-N-ligados azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ambos de los cuales contienen la azida (-N 3) funcional grupo. Después de la purificación de las partículas del virus azida modificados, una sonda fluorescente alquino que contiene el resto TAMRA se liga de manera quimioselectiva a las proteínas pre-etiquetados o glicoproteínas. Finalmente, un análisis de SDS-PAGE se realizó para demostrar la ligadura con éxito de la sonda sobre las proteínas de la cápside viral. Incorporación de Aha se muestra a etiquetar todos cápside viralproteínas (Hexon, Penton y fibra), mientras que O-GlcNAz resultados incorporación en el etiquetado de fibra óptica sólo.
En este campo en evolución, múltiples métodos para la ligadura de azida-alquino se han desarrollado con éxito, sin embargo, sólo los dos que hemos encontrado para ser más conveniente se ha demostrado en este documento - la cepa promovido azida-alquino cicloadición (SPAAC) y el cobre-catalizada cicloadición azida-alquino (CuAAC) bajo una atmósfera desoxigenada.
Protocol
Consulte la Tabla 1 para la preparación de todos los medios de comunicación, tampones y soluciones de referencia en este protocolo.
1. La producción de Aha-Etiquetada Adenovirus
- Preparar once de 100 mm placas de cultivo de tejidos de células renales embrionarias humanas (HEK 293) se mantienen en HEK 293 medio de crecimiento celular (ver Tabla 1) a 37 ° C hasta que hayan alcanzado 80 a 90% de confluencia. (Nota:. Los cultivos con confluencia más de 90% puede ser difícil para infectar y no puede producir virus como se desee)
- Afloje las células en uno de los platos retirando primero el medio de crecimiento, aclarado una vez con 5 ml de tampón TD, a continuación, incubando las células durante un minuto en 1 ml de tripsina-EDTA (1 x).
- Añadir 9 ml de HEK 293 medio de crecimiento celular, y utilizar un hemocitómetro para contar el número de células cosechadas HEK 293 de este plato. Utilice este número para calcular la cantidad de adenovirus tipo 5 (Ad5) necesaria para la infección utilizando un multiplicity de infección (MOI) valor de 10 PFU / célula. Cuenta por el hecho de que por lo normal Ad5, el índice de infectividad (relación de partículas infecciosas en número total de partículas) es típicamente 1:20.
- Preparar 10 ml de tampón de infección.
- Poco a poco quitar el HEK 293 medio de cultivo celular a partir de las diez placas de cultivo restantes, a continuación, lavar con 5 ml de solución tampón TD. Añadir 1 ml de tampón de infección a cada placa y se incuba a 37 ° C durante 1 h. Durante este período la infección, agite suavemente cada lado placa de cultivo a otro en intervalos de 15 min.
- Después de la infección, añadir 9 ml de medio fresco HEK 293 crecimiento de las células y se incuba a 37 ° C durante 18 h.
- Preparar 100 ml de medio Aha etiquetado (o Met medio de control para el control). Asegúrese de filtrar las soluciones madre concentradas con un filtro de jeringa de 0,2 micras estéril antes de preparar los medios de comunicación de etiquetado.
- Cuidadosamente (para no lavar las células infectadas) eliminar el HEK 293 medio de crecimiento de células después de 18 h unaª lavar cada placa de cultivo con 5 ml de solución tampón TD.
- Eliminar la solución tampón de lavado TD y añadir 10 ml de medio de etiquetado Aha a cada placa de cultivo. Para un control, medio de control metionina debe ser utilizado en lugar del medio de etiquetado Aha en este paso.
- Se incuban las células infectadas en el etiquetado de medio a 37 ° C durante 6 h. Etiquetado puede llevarse a cabo en cualquier momento entre 12 a 24 horas después de la infección, pero no debe ser superior a 6 horas de duración. Este intervalo se ha determinado para maximizar la superposición con traducción proteína viral estructural mientras infectividad asegurar no está significativamente disminuida. 7
- Retirar con cuidado el medio de marcaje para no romper las células. Añadir 10 ml de medio fresco HEK 293 crecimiento de las células a cada placa y se incuba a las células a 37 ° C durante otra hora 18. Para minimizar la pérdida de las células infectadas durante este paso, no es necesario retirar la solución de etiquetado totalmente. El HEK 293 medio de crecimiento de células contiene un exceso de Met que se habrá superado cualquier residuo de Aha.
- Vaya al paso 3 para la purificación.
2. La producción de adenovirus azido-azúcar-con etiqueta
- Seguir el procedimiento titulado Producción de adenovirus Aha-Labeled hasta e incluyendo el paso 1,5.
- Preparar 100 ml de medio de etiquetado azido-azúcar.
- Cubrir las células con 10 ml de medio fresco etiquetado azido-azúcar y se incuba a 37 ° C durante 44 h.
3. Purificación de la azida con etiquetas partículas adenovirales
- Retire los medios de comunicación, junto con las células infectadas de cada placa de cultivo y la transferencia a tubos cónicos. Centrifugar a 2.000 g durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en tampón TD (con 8 ml de solución tampón TD por 10 platos).
- Lisar las células infectadas por repetidas (3 o más) de congelación-descongelación ciclos utilizando un frasco Dewar de nitrógeno líquido y un baño de agua 37 ° C. Centrifugar a 2.000 g durante 10 mina 4 ° C para separar los restos celulares del sobrenadante.
- Preparar un gradiente de CsCl densidad tubo de centrífuga por primera pipeteando 2,5 ml de 1,25 g / ml de solución de CsCl en un tubo de centrífuga Ultra Clear. A continuación, utilice una pipeta con su punta colocado en la parte inferior del tubo para añadir lentamente 2,0 ml de 1,4 g / ml de solución de CsCl, teniendo cuidado de no perturbar la interfaz gradiente.
- Pipeta el sobrenadante del paso 3,2 en la parte superior del tubo de gradiente de densidad de CsCl, y si es necesario tampón TD complemento para llenar el tubo. Centrifugar las muestras en un rotor basculante a 125.000 g durante 1 hora a 15 ° C en una ultracentrífuga.
- Después de la terminación de ultracentrifugación, las partículas del virus debe ser visible como una banda blanca gruesa en la interfase de las dos soluciones de CsCl. Hacer una pequeña perforación en la parte inferior del tubo con una aguja estéril para permitir que la solución para drenar gota a gota.
- Recoger la banda blanca y espesa, que debe contener las etiquetas Ad5 partículas, takincuidado g para excluir solución de CsCl exceso. Evite recoger las proteínas celulares que se venda por encima de la capa de virus. Además excluir cápsidas vacías virión que forman una capa más ligera ligeramente por encima de la banda de virus blanca espesa.
- Si lo desea, realizar una purificación final de los etiquetados Ad5 partículas. Añadir la fracción recogida a partir del paso de 3,6 a un tubo de ultracentrífuga 4-ml y llenar el tubo con 1,35 g / ml de solución de CsCl. Centrifugar a 125.000 g durante 18 horas a 15 ° C y recoger la banda blanca gruesa que se forma en el centro del tubo, como se describe en los pasos 3.5 y 3.6. (Nótese que si el título viral es baja, una banda blanca no puede ser visible después de la segunda centrifugación, y no será posible recuperar el virus de la etiqueta).
- Para el almacenamiento de las partículas del virus durante largos períodos de tiempo, la diálisis del extracto virus de recogida debe ser realizada contra el virus de tampón de almacenamiento. Guarde las muestras de virus dializados a -80 ° C.
4. Ligación de partículas adenovirales modificados con sondas alquino utilizando la cepa promovido por azida-alquino cicloadición (SPAAC)
- A una solución de 50 l de azida modificado con Ad5 en tampón de virus de almacenamiento, añadir 0,25 l de solución de etiquetado SPAAC. (Consulte la tabla de reactivos para una lista de vendedores de alquinos tensas disponibles en el mercado).
- Dejar que la reacción de cicloadición cepa-ascendido a proceder durante la noche a temperatura ambiente. Si una sonda sensible a la luz (por ejemplo TAMRA) se utiliza, cubra el recipiente de reacción con papel de aluminio.
- Purificar el virus de la etiqueta de acuerdo con el paso 6.
5. La ligadura de las partículas de adenovirus modificados con sondas alquino Uso de cobre (I) catalizada por azida-alquino cicloadición (CuAAC) en la atmósfera desoxigenada
- Colocar 7,2 mg de cobre (I) de bromuro de (CuBr) en polvo en un tubo Eppendorf, cubierta con papel de aluminio.
- Pipetear 1 ml de DMSO en un segundo tubo de Eppendorf.
- Preparar50 l de solución de etiquetado CuAAC en un tercer tubo Eppendorf. Cubra con papel de aluminio si la sonda alquino es sensible a la luz (por ejemplo, TAMRA-alquino).
- Coloque los tres tubos Eppendorf, los debutantes, en una bolsa de guantes sin oxígeno durante 6 horas. Todas las muestras deben permanecer dentro de la bolsa de guante hasta la terminación de la reacción CuAAC.
- Preparar una solución madre de 50 x de CuBr mediante la adición de 1 ml de DMSO a 7,2 mg de polvo de CuBr, ambos de los cuales han sido desoxigenó acuerdo con la etapa 5,4.
- Iniciar la reacción CuAAC pipeteando 1 l de esta solución madre CuBr a 50 l de la solución de etiquetado CuAAC, que ha sido desoxigenó acuerdo con la etapa 5,4. Dejar que la reacción tenga lugar durante 12 horas dentro de la bolsa de guante.
- Purificar el virus de la etiqueta de acuerdo con el paso 6.
6. La purificación y almacenamiento de las partículas virales con etiqueta
- Purificar las muestras de virus marcados con Centri-septiembre de filtración en gel giro columns equilibrada con tampón Virus de almacenamiento, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Alternativamente, la purificación puede llevarse a cabo mediante diálisis frente a tampón de virus de almacenamiento.
- Las partículas de virus marcados se deben almacenar a -80 ° C.
7. SDS-PAGE de adenovirus con etiqueta y Escaneado de gel fluorescente
- Añadir 20 l tampón de muestra Laemmli (2 x) y 20 l de virus purificado etiquetados y se deja hervir durante 10 minutos. Centrifugar las muestras durante 30 segundos para eliminar cualquier precipitados insolubles. Si está presente cobre residual después de la purificación, la ebullición de la muestra puede resultar en rayas gruesas de proteína en el gel de SDS-PAGE, causando dificultades durante la visualización. En este caso, renunciar de ebullición de la muestra en este paso.
- Una el gel cassette a la celda de electroforesis y añadir tampón ejecutando. Cargar el número requerido de pocillos con las muestras de proteínas virales. Use un bien a la carga pre-STAIned marcadores de peso molecular. Ejecutar el gel durante 1 hora a 200 V. Mantener la celda electroforesis cubierta con papel de aluminio durante todo el período para reducir photobleaching de la etiqueta fluoróforo.
- Para una mejor resolución y para eliminar todo el fluoróforo libre, permitir que el tinte de seguimiento que se quede sin el gel durante la electroforesis. Detener la electroforesis y rápidamente transferir el gel a un escáner de gel fluorescente y digitalizar el gel para la emisión de fluorescencia a la longitud de onda apropiada (574 nm para TAMRA).
- El número de moléculas de tinte conjugado a cada partícula viral puede ser cuantificada midiendo la fluorescencia de varias concentraciones Tamra estándar y comparando con la muestra de la etapa 7.3.
8. Los resultados representativos
Los resultados observados de SDS-PAGE y análisis en gel fluorescente de TAMRA conjugados Ad5 se muestra en la Figura 3. A pesar de estas exploraciones de gel fluorescente se realizaron en muestras de modiFied a través de CuAAC, los resultados deben ser comparables cuando las sondas se ligan a través de SPAAC. Estos análisis indican que el gel Aha resultados de etiquetado en la modificación de las tres proteínas de la cápside (Ad5 Hexon, Penton, y fibra), mientras que el etiquetado de azúcar modifica sólo la proteína de la cápside de fibra. Además, un aumento de la concentración de AHA (4 mM mM vs 32) resulta en un mayor grado de incorporación Aha, pero también se ha demostrado que disminuye la infectividad. Los resultados anteriores indican que el 7 de Ad5 producida en 4mM Ajá, aproximadamente el 5% de los sitios expuestos son metionina TAMRA modificado, con este número cada vez mayor al 10% cuando 32 mM de Aha se utiliza. Esto corresponde a aproximadamente 280 y 510, respectivamente, marcado tinte sitios por Ad5 partícula. Análisis de azúcar-etiquetado 1 ha indicado que aproximadamente 22 de los 36 sitios de glicosilación en Ad5 están ocupados por un azúcar azido y posteriormente marcado con TAMRA.
Si diez placas de cultivo de tejidos se utilizan para producir azida modificado con Ad5 como se describe en este protocolo, desde 200 hasta 300 l de azida modificado con el virus se debe obtener de la banda blanca recogida en el paso 3.6, con un título de aproximadamente 1,5 x 10 12 partículas / ml. Una dificultad común de este procedimiento es la ausencia de una banda viral en esta etapa de purificación, que puede atribuirse a título viral baja. Esto es generalmente un resultado de infectar a las células que están sobre o bajo confluentes, o por un lavado que elimina las células - que se convierten en soltó de la placa después de la infección -, mientras que el enjuague durante el paso 1.
Figura 1. Descripción general del protocolo. Azida que contiene AHA o GalNAz se incorporó por primera vez en partículas de adenovirus. Ligadura con una sonda fluorescente alquino continuación, se realiza a través de un "clic" la química. Por último, SDS-PAGE se utiliza para demostrar la ligadura de la sonda fluorescente.
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Figura 2. La ligadura de la sonda alquino en azida modificado con virus a través de (un) SPAAC, (b) CuAAC bajo desoxigenada y (c) atmósfera oxigenada.
Figura 3. Exploraciones fluorescentes de SDS-PAGE de azida marcado con adenovirus tipo 5 (Ad5) después de la conjugación con CuAAC TAMRA acetilénicos. (A) Aha-etiquetados Ad5, usando dos concentraciones de Aha. Etiquetado parece ocurrir en Hexon adenovirus, Penton y proteínas de fibra cápside, con el grado de etiquetado aumentar con el aumento de concentración de AHA. (B) Ac 4 adenovirus GalNAz marcado parece ser etiquetados sólo en la proteína de la cápside de fibra.
| Solución | Preparación | Notas |
| Ad5 almacenamiento tampón | 5 mM de Tris-HCl (pH 8,0) que contenía 0,5 mM de MgCl 2, 50 mM de NaCl, 25% (v / v) de glicerol, y 0,05% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA) | Almacenar a -20 ° C |
| Infección por Ad5 tampón | 2% (v / v) de suero de ternera bovino, 1 x solución de TC, Ad5 en tampón de almacenamiento (volumen determinado utilizando una MOI de 10 PFU / célula y un índice de infectividad de 1:20). Se lleva la solución al volumen final utilizando tampón TD | Ad5 concentración puede ser determinada a través de absorción de UV. |
| TC solución (200 veces) | 136 mM de CaCl2, 100 mM de MgCl 2 | Almacenar a 4 ° C |
| TD tampón | 137 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,07 mM Na 2 HPO 4, y 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 | Almacenar a 4 ° C |
| HEK 293 células medio de crecimiento | Medio modificado de Dulbecco Eagle (DMEM) suplementado con 10% (v / v) de suero de ternera bovina (CC) y 1% (v / v) Pen Strep | Almacenar a 4 ° C |
| Solución madre de Cys (100 veces) | DMEM (-Met /-Cys) suplementado con 200 mM de L-cisteína | Preparar fresco y el filtro con un filtro de jeringa de 0,2-m estéril antes del uso. |
| Ajá de la solución madre (25 ×) | DMEM (-Met /-Cys) suplementado con 100 mM de L-Azidohomoalanine | Preparar fresco y el filtro con un filtro de jeringa de 0,2-m estéril antes del uso. |
| Ajá etiquetado medianas | DMEM (-Met / Cys), complementado con 10% de BCS, Aha solución madre (1 x), 2 mM de L-cisteína | Preparar fresco antes de su uso. Esto corresponde a una c 4 mMoncentration de Aha, aunque las concentraciones se pueden utilizar diferentes (ver resultados representativos). |
| Met de la solución madre (25 ×) | DMEM (-Met /-Cys) suplementado con 100 mM de L-metionina | Preparar fresco y el filtro con un filtro de jeringa de 0,2-m estéril antes del uso. |
| Met medio de control | DMEM (-Met / Cys), complementado con 10% de BCS, Met solución madre (1 x), 2 mM de L-cisteína | Preparar fresco antes de su uso. |
| AC 4 GalNAz solución madre (1.000 ×) | 50 mM de N-peracetilado azidoacetylgalactosamine (Hch 4 GalNAz) en metanol | Almacenar a 4 ° C. AC 4 GalNAz es un precursor metabólico de la GlcNAz. |
| Azido-azúcar etiquetado medio | 100 l AC 4 GalNAz solución de reserva, 100 ml de medio de crecimiento de HEK 293 células | Permitir metanol se evapore antes de añadir 293 HEK medio de crecimiento celular. |
| Las soluciones de cloruro de cesio | CsCl disolvió en tampón TD: 1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml de H 2 O) 1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml de H 2 O) 1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml de H 2 O) | Gradientes de densidad de ultracentrifugación |
| Virus de tampón de almacenamiento | Tampón fosfato salino (PBS), pH 7,2, que contenía 0,5 mM de CaCl 2, 0,9 mM de MgCl 2, y 10% (v / v) de glicerol | Almacenar a -20 ° C |
| TAMRA-BCN (SPAAC) solución de etiquetado | TAMRA-BCN en DMSO:
| La cepa promovido por la sonda alquino Para SDS-PAGE, un título viral de aproximadamente 10 12 partículas / ml se sugiere |
| TAMRA-acetilénicos (CuAAC) solución de etiquetado | 50 l de azida modificado con Ad5 en tampón de virus de almacenamiento (N Ad5 determina como antes), 1,5 mM de Batho fenantrolina disulfonato (es decir, la concentración de 1,5 × CuBr final), TAMRA-acetilénicos. TAMRA-acetilénicos molaridad (en M) se determina utilizando: c Alc = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo) (De modo que la mezcla de reacción preparada en el Paso 5 contiene 100 sondas alquino por virión) | Tampón Tris se sabe que es un ligando competitivo y inhibidora de cobre. 8 |
| Laemmli muestra de amortiguación (2 x) | 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w / v) de SDS, 20% (v / v) de glicerol, 10% (v / v) 2-mercaptoetanol, y 0,004% (w / v) de azul de bromofenol | |
| Ejecución de búfer | 187 mM de glicina, 19 mM Tris-HCl, 3,5 mM de SDS en H 2 O | Almacenar a 4 ° C |
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Discussion
El desarrollo de las reacciones y haga clic en quimioselectiva bioorthogonal, incluidos los de azidas, es una zona de rápida evolución de la investigación, y, posteriormente, hay un creciente número de estas reacciones a elegir para aplicaciones bioconjugation. Hemos limitado el alcance de este protocolo para incluir sólo dos métodos que fueron escogidos debido a su utilidad en nuestro propio laboratorio y la disponibilidad comercial de todos los reactivos.
En la ruta tales primera - cepa-promovido azida-alquino cicloadición (SPAAC) - el alquino está contenida dentro de un anillo cyclooctyne (figura 2a). Este método recientemente desarrollado puede llevarse a cabo bajo una atmósfera oxigenada y sin la necesidad de un catalizador de cobre. 9,10 Hasta hace poco, un inconveniente de este método fue la síntesis laborioso y disponibilidad comercial reducido de estos alquinos tensas en comparación con el terminal de alquinos utilizado en cobre (I)-catalizada azida-alquino cicloadición (CuAAC), sin embargo, una creciente biblioteca de estas sondas es ahora disponible en el mercado (véase el cuadro de los reactivos). Por estas razones, hemos optado por SPAAC como el método de elección en este protocolo.
También se describe en este protocolo es la ligadura de azida modificados con partículas adenovirales través CuAAC en atmósfera desoxigenada utilizando batofenantrolina disulfónico, sal disódica (BDA) como un agente quelante (Figura 2b). Este método es conveniente porque el catalizador BDA es tanto comercialmente disponible y barato. Además, informaron los rendimientos son generalmente más alta de los métodos disponibles, y las complicaciones que surgen de la generación de especies de oxígeno reactivas (cf. oxigenada CuAAC, más adelante) en solución se evitan. 8 Sin embargo, el cobre (I) catalizador se sabe que es citotóxico, 11 y el equipo especializado necesario para aplicar este procedimiento puede disuadir a algunos grupos de su uso. No obstante, nos encontramos con este método eficaz y útil paraadenovirus modificación.
Un tercer método útil de CuAAC Recientemente se ha desarrollado para trabajar bajo condiciones atmosféricas oxigenados (figura 2c). 8 Este método goza de las mismas ventajas que el enfoque de BDA-quelado pero utiliza en lugar THPTA como un agente quelante para acomodar el oxígeno atmosférico sin destrucción oxidativa de el sustrato. Un pequeño inconveniente de este enfoque es la actual falta de disponibilidad comercial de THPTA, a pesar de síntesis sencillas de este agente quelante se han reportado. 8 A pesar de que no han realizado este método de ligadura en nuestro propio sistema, THPTA / CuAAC se espera que produzca comparables resultados a la BDA / CuAAC, con la ventaja añadida de la tolerancia atmósfera oxigenada.
A pesar de forma intencionada el desarrollo de este protocolo de alrededor de los materiales disponibles en el mercado, todavía quieren reconocer las ventajas de costes y mayor flexibilidad de la síntesis de laazidas y sondas alquino se usa aquí. Azidohomoalanine se pueden preparar en tan poco como tres días y para significativamente menos de fuentes comerciales. 6,12 Reportado tensas preparaciones alquino son más difíciles de 11, pero ofrecen una mayor libertad de selección de la sonda.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer la NSF para su financiación (CBET-0846259).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 | |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 | |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 | |
| Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 | |
| Cell culture CO2 incubator | |||
| Hemocytometer | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) | |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | ||
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| Sterile needle, 18 gauge | |||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | |||
| Dewar flask | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Electrophoresis cell | |||
| Fluorescent gel scanner | |||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| Methanol | |||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | |||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| 1M HCl | |||
| Glycerol | |||
| Bovine Serum Albumin | |||
| L-cysteine | |||
| L-methionine | |||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | |||
| 2-mercapt–thanol | |||
| Glycine | |||
| Bromophenol blue | |||
| Cesium Chloride (CsCl) | |||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | |||
| Potassium Chloride (KCl) | |||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | |||
| Sodium Chloride (NaCl) | |||
| Alkyne probe for CuAAC* | |||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 | |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | |||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 | |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs. |
|||
References
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
- Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
- Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
- Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
- Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
- Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
- Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
