Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kemoselektiv Ändring av virala ytor via Bioorthogonal Klicka Kemi

doi: 10.3791/4246 Published: August 19, 2012

Summary

Adenoviruspartiklar är konstruerade för att innehålla antingen det onaturliga aminosyra azidohomoalanine-analog eller azido socker

Abstract

Ändringen av viruspartiklar har fått en betydande uppmärksamhet för sin enorma potential för att påverka genterapi, onkolytiska applikationer och utveckling av vaccin. 1,2,3 Nuvarande metoder för att modifiera virala ytor, som oftast genetik-baserade, ofta lider av dämpning av virus produktion, smittsamhet och cellulära transduktion. 4,5 Använda kemoselektiv klick kemi, har vi utvecklat en enkel alternativt tillvägagångssätt som undviker dessa frågor samtidigt som den är både mycket flexibel och tillgänglig. 1,2

Målet med detta protokoll är att visa effektiviteten av att använda bioorthogonal klicka kemi för att modifiera ytan av adenovirus typ 5 partiklar. Denna två steg kan användas både terapeutiskt 1 eller analytiskt, 2,6 eftersom det möjliggör kemoselektiv ligering av målmolekyler, färgämnen eller andra molekyler av intresse på proteinermärkt i förväg med azid taggar. De tre stora fördelarna med denna metod är att (1) metabolisk märkning visar liten eller ingen effekt på viral fitness, 1,7 (2) ett brett utbud av effek-ligander kan användas, och (3) Det är otroligt snabb, pålitlig och lätt att nå. 1,2,7

I det första steget av detta förfarande, är adenoviruspartiklar produceras som bär antingen azidohomoalanine (Aha, en metionin surrogat) eller den onaturliga socker O-kopplad N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), vilka båda innehåller aziden (-N3) funktionell grupp. Efter rening av de azid-modifierade viruspartiklar, är en alkyn-prob innehållande den fluorescerande TAMRA-delen ligerades i en kemoselektiv sätt att de pre-märkta proteiner eller glykoproteiner. Slutligen är en SDS-PAGE-analys utfördes för att demonstrera framgångsrik ligering av sonden på de virala kapsidproteinerna. Aha inkorporering visas att märka allt viruskapsidenproteiner (hexon, Penton och Fiber), medan O-GlcNAz inkorporering resulterar i märkning av Fiber bara.

I detta växande område, har flera metoder för azid-alkynen ligering kunnat utvecklas, men endast de två vi har funnit vara mest lämplig demonstreras här - stam-främjas azid-alkyn cykloaddition (SPAAC) och koppar-katalyserade azid-alkyn cykloaddition (CuAAC) under syrebefriad atmosfär.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Se tabell 1 för beredning av alla media, buffertar och lösningar som refereras i detta protokoll.

1. Produktion av Aha-märkt adenovirus

  1. Framställ elva 100-mm vävnadsodlingsplattor av humana embryonala njurceller (HEK 293) som upprätthålls i HEK 293 celltillväxt-medium (se tabell 1) vid 37 ° C tills de har nått 80 till 90% konfluens. (Obs!. Kulturer med sammanflytande över 90% kan vara svåra att infektera och får inte producera virus som önskas)
  2. Lossa cellerna i en av skålarna genom att först avlägsna tillväxtmediet, sköljning en gång med 5 ml av TD-buffert, varefter inkubering av cellerna under en minut i 1 ml trypsin-EDTA (1 x).
  3. Tillsätt 9 ml HEK 293 celltillväxt-medium, och använda en hemocytometer att räkna antalet skördade HEK 293-celler från denna skål. Använda detta nummer för att beräkna mängden av adenovirus typ 5 (Ad5) som krävs för infektion med användning av en multiplicity av infektion (MOI)-värde av 10 PFU / cell. Hänsyn till det faktum att för normal Ad5 är infektiviteten (förhållandet av infektiösa partiklar till totala antalet partiklar) typiskt 1:20.
  4. Framställ 10 ml infektion buffert.
  5. Sakta ut HEK 293 mediet celltillväxt från de tio återstående odlingsskålarna, tvätta sedan med 5 ml TD buffert. Tillsätt 1 ml av infektion buffert till varje skål och inkubera vid 37 ° C under 1 timme. Under denna infektion period försiktigt skaka varje sida odlingsskål till sida på 15-minuters intervall.
  6. Efter infektion, tillsätt 9 ml färsk HEK 293 celltillväxt-medium och inkubera vid 37 ° C under 18 timmar.
  7. Framställ 100 ml Aha märkning mediet (eller Met kontrollmedium för kontroll). Var noga med att filtrera de koncentrerade lager lösningar med en 0,2-m steril spruta filtret innan förbereda märkning media.
  8. Noggrant (för att inte tvätta bort de infekterade cellerna) avlägsna HEK 293-medium celltillväxt efter 18 h ennd tvätta varandras odlingsskål med 5 ml TD buffert.
  9. Ta bort TD lösningen bufferten tvätt och tillsätt 10 ml Aha märkning medium till varje kultur rätt. För en kontroll bör metionin kontrollmedium användas i stället för den Aha märkning mediet vid detta steg.
  10. Inkubera de infekterade cellerna i etikettering medium vid 37 ° C under 6 timmar. Märkningen kan utföras när som helst mellan 12 till 24 h efter infektion men bör inte vara längre än 6 timmar i varaktighet. Detta intervall har fastställts för att maximera överlappning med viralt strukturellt protein översättningen samtidigt smittsamhet inte försämrats påtagligt. 7
  11. Försiktigt bort märkning mediet för att inte störa cellerna. Tillsätt 10 ml av färskt HEK 293 celltillväxt-medium till varje skål och inkubera cellerna vid 37 ° C under ytterligare 18 timmar. För att minimera förlust av infekterade celler under detta steg är det inte nödvändigt att avlägsna märkningen lösning helt. HEK 293 celltillväxt-medium innehåller ett överskott av M-et som kommer konkurrera ut alla kvarvarande Aha.
  12. Gå vidare till steg 3 för rening.

2. Produktion av azido-Socker-märkt adenovirus

  1. Följ proceduren titeln Produktion av Aha-märkt Adenovirus fram till och med steg 1,5.
  2. Bereda 100 ml av azido-socker märkning medium.
  3. Täcka cellerna med 10 ml färskt azido-socker märkning medium och inkubera vid 37 ° C under 44 timmar.

3. Rening av azid-märkta Adenovirala Partiklar

  1. Ta bort materialet tillsammans med de infekterade cellerna från varje kultur skålen och överför till koniska rör. Centrifugera vid 2000 g under 10 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i TD-buffert (med användning av 8 ml av TD-buffert per 10 skålar).
  2. Lyserar de infekterade cellerna genom upprepad (3 eller mer) frys-tö-cykler med användning av en Dewar-kolv av flytande kväve och en 37 ° C vattenbad. Centrifugera vid 2000 g under 10 minutervid 4 ° C för att separera cellrester från supernatanten.
  3. Framställa en CsCl-densitet-gradient röret centrifug genom att först pipettera 2,5 ml av 1,25 g / ml CsCl-lösning i en Ultra Clear centrifugrör. Därefter använder en pipett med sin spets placerad vid botten av röret för att långsamt 2,0 ml av 1,4 g / ml CsCl-lösning, noggrann med att inte störa gränsytan gradienten.
  4. Pipettera supernatanten från steg 3,2 ovanpå CsCl densitetsgradient röret, och om så är nödvändigt tillägg TD buffert för att fylla röret. Centrifugera proverna vid en swinging bucket rötor vid 125 tusen g under 1 h vid 15 ° C i en ultracentrifug.
  5. Efter fullbordan av ultracentrifugering, bör de viruspartiklar vara synlig som en tjock vit band vid gränsytan mellan de två CsCl-lösningar. Göra en liten perforering vid botten av röret med en steril nål för att tillåta lösningen att rinna droppvis.
  6. Samla den tjocka vita bandet, vilket bör innehålla de märkta Ad5 partiklarna, Taking noga med att utesluta överskott av CsCl lösning. Undvik samla cellulära proteiner som band ovanför viruset lagret. Dessutom utesluter tomma virionkapsider som bildar ett ljusare skikt strax över den tjocka vita viruset band.
  7. Valfritt utföra en slutlig rening på de märkta Ad5 partiklarna. Tillsätt den uppsamlade fraktionen från steg 3,6 till en 4-ml ultracentrifugrör och fylla röret med 1,35 g / ml CsCl-lösning. Centrifugera vid 125.000 g under 18 timmar vid 15 ° C och samla den tjocka vita bandet som bildas i mitten av röret som beskrivs i steg 3.5 och 3.6. (Notera att om den virala titern är låg, kan ett vitt band inte vara synliga efter den andra centrifugeringen, och det kommer inte att vara möjligt att återvinna den märkta viruset).
  8. För förvaring av viruspartiklarna under lång tid bör dialys av det insamlade viruset extraktet utföras mot virus lagringsbuffert. Lagra de dialyserade virusprover vid -80 ° C.

4. Lirandet av modifierade adenovirala Partiklar med alkyn Sonder Använda stam-Främjat Azid-alkyn Cykloaddition (SPAAC)

  1. Till en lösning av 50 pl av azid-modifierad Ad5-virus i lagringsbuffert, tillsätt 0,25 pl SPAAC märkning lösning. (Se tabellen av reagens för en lista över försäljare av kommersiellt tillgängliga ansträngda alkyner).
  2. Tillåta den töjningsgivande främjas cykloadditionsreaktionen fortgå över natten vid rumstemperatur. Om en ljuskänslig sond (t ex TAMRA) används, omfattar reaktionskärlet med aluminiumfolie.
  3. Rena den märkta viruset enligt steg 6.

5. Ligering av modifierade adenovirala partiklar med alkyn Prober med användning av koppar (I)-katalyserad Azid-alkyn Cykloaddition (CuAAC) i syrebefriad Atmosfär

  1. Plats 7,2 mg koppar (I) bromid (CuBr) pulver i en Eppendorf-rör, täcktes med aluminiumfolie.
  2. Pipettera 1 ml DMSO i en andra Eppendorf-rör.
  3. Framställ50 pl av CuAAC märkningslösningen i en tredje Eppendorf-rör. Täck med aluminiumfolie om alkynen sonden är ljuskänsligt (t.ex. TAMRA-alkyn).
  4. Placera de tre Eppendorf-rör, icke-begränsade, i en deoxygenerad handskpåse under 6 timmar. Alla prover bör förbli inuti handskpåse tills fullbordan av reaktionen CuAAC.
  5. Framställ en 50 x förrådslösning av CuBr genom tillsats av 1 ml DMSO till 7,2 mg av CuBr pulver, vilka båda har deoxygeneras enligt steg 5,4.
  6. Initiera CuAAC reaktionen genom att pipettera 1 | il av denna CuBr stamlösning till 50 | il av CuAAC märkning lösning, som har deoxygeneras enligt steg 5,4. Låta reaktionen fortskrida under 12 h inuti handskpåse.
  7. Rena den märkta viruset enligt steg 6.

6. Rening och lagring av märkta Viruspartiklar

  1. Rena märkta virusprov med Centri-sep gelfiltrering spin columns ekvilibrerade med Virus lagringsbuffert, efter tillverkarens anvisningar.
  2. Alternativt kan rening utföras genom dialys mot virus lagringsbuffert.
  3. De märkta viruspartiklar skall förvaras vid -80 ° C.

7. SDS-PAGE av märkt adenovirus & Fluorescerande gelscanning

  1. Tillsätt 20 ul Laemmli provbuffert (2 ×) till 20 pl renat märkta virus och låt koka i 10 min. Centrifugera proverna i 30 sekunder för att avlägsna eventuella olösliga fällningar. Om kvarvarande koppar är närvarande efter rening, kan kokning av provet resulterar i tjocka streck av protein på SDS-PAGE-gel, vilket orsakar svårighet vid visualisering. I detta fall avstå kokning av provet i detta steg.
  2. Fästa gelén kassetten till elektroforescell och tillsätt rinnande buffert. Ladda det erforderliga antalet brunnar med det virala proteinet prover. Använd en brunn för att ladda pre-stainierade molekylviktsmarkörer. Köra gelén under 1 h vid 200 V. Håll elektrofores cellen täcktes med aluminiumfolie under hela perioden för att reducera fotoblekning av fluoroforen etiketten.
  3. För bästa upplösning och för att avlägsna allt fritt fluorofor, tillåter spårfärgämnet att rinna ut ur gelén under elektrofores. Stoppa elektrofores och snabbt överföra gelén till en fluorescerande gel scanner och scanna gelén för fluorescensemissionen vid lämplig våglängd (574 nm för TAMRA).
  4. Antalet färgämnesmolekyler konjugerade till varje viruspartikel kan kvantifieras genom mätning av fluorescensen av flera standardmetoder TAMRA koncentrationer och jämföra med provet från steg 7,3.

8. Representativa resultat

De observerade resultaten från SDS-PAGE och fluorescerande gelscanning av TAMRA-konjugerade Ad5 visas i figur 3. Även om dessa fluorescerande gel avsökningar utfördes på prover modierad via CuAAC bör resultaten vara jämförbara då prober ligeras via SPAAC. Dessa gel genomsökningar tyder på att Aha märkning resulterar i modifiering av de tre Ad5 kapsidproteinerna (hexon, Penton och Fiber), medan socker märkningen ändras endast proteinet Fiber kapsiden. Vidare, även en ökning av koncentrationen Aha (4 mM respektive 32 mM) resulterar i en högre grad av inkorporering Aha, men det har visat sig minska smittsamhet. Tidigare resultat 7 visar att för Ad5 produceras i 4 mM Aha, ungefär 5% av exponerade metionin webbplatser är TAMRA-modifierad med detta antal ökat till 10% när 32 mM Aha används. Detta motsvarar ca 280 och 510, respektive preparat-märkta platser per Ad5 partikel. Analys av socker-märkning 1 har visat att ungefär 22 av de 36 glykosyleringsställena på Ad5 är upptagna av en azido socker och därefter märkt med TAMRA.

Om tio vävnadsodlingsplattor används för att framställa azid-modifierade Ad5, såsom beskrivs I detta protokoll, 200 - 300 bör il azid-modifierat virus kan erhållas från det vita bandet uppsamlas i steg 3,6, med en titer av ca 1,5 x 10 12 partiklar per ml. En vanlig svårighet med detta förfarande är att det saknas en viral band vid detta reningssteg, vilket kan tillskrivas låg viral titer. Detta är i allmänhet ett resultat av infektion av celler som är antingen över-eller under-sammanflytande, eller genom att tvätta bort celler - som blir lösgjord från plattan efter infektion - under sköljningen i steg 1.

Figur 1
Figur 1. Protokoll översikt. Azid-innehållande Aha eller GalNAz först införlivas adenoviruspartiklar. Ligering med en fluorescerande alkyn sond utförs sedan via "klick" kemi. Slutligen är SDS-PAGE användes för att demonstrera ligering av den fluorescerande proben.

IGUR 2 "/>
Figur 2. Ligering av alkyn-sond på azid-modifierade viruset via (a) SPAAC, (b) CuAAC enligt de syresatta-och (c) syresatt atmosfär.

Figur 3
Figur 3. Fluorescerande avsökningar av SDS-PAGE av azid-märkt adenovirus typ 5 (Ad5) efter CuAAC konjugering med TAMRA-alkyn. (A) Aha-märkt Ad5 med två koncentrationer av Aha. Märkning tycks ske på adenovirus hexon, Penton och Fiber kapsidproteiner med omfattningen av märkningen ökar med ökad Aha koncentration. (B) Ac 4 GalNAz-märkt adenovirus verkar märkas endast på fibern kapsidprotein.

Lösning Beredning Anteckningar
AD5 lagringsbuffert 5 mM Tris-HCl-buffert (pH 8,0) innehållande 0,5 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 25% (volym / volym) glycerol och 0,05% (vikt / volym) bovint serumalbumin (BSA) Lagra vid -20 ° C
Ad5-infektion buffert 2% (vol / vol) bovint kalvserum, 1 x TC-lösning, Ad5 i lagringsbuffert (volym bestämdes med användning av en MOI av 10 PFU / cell och en infektivitet index 1:20). Koka upp lösningen till den slutliga volymen med hjälp TD buffert Ad5 koncentration kan bestämmas genom UV-absorption.
TC-lösning (200 ×) 136 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 Lagra vid 4 ° C
TD buffert 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,07 mM Na-HPO 2 4 och 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 Lagra vid 4 ° C
HEK 293 cellodlingsmedium Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% (volym / volym) bovint kalvserum (BCS) och 1% (volym / volym) Pen Strep Lagra vid 4 ° C
Cys stamlösning (100 ×) DMEM (-Met /-Cys) kompletterat med 200 mM L-cystein Framställ färsk och filter med en 0,2-im sterilt sprutfilter före användning.
AHA stamlösning (25 x) DMEM (-Met /-Cys) kompletterat med 100 mM L-Azidohomoalanine Framställ färsk och filter med en 0,2-im sterilt sprutfilter före användning.
Aha märkning mediet DMEM (-Met /-Cys) kompletterat med 10% BCS, Aha stamlösning (1 x), 2 mM L-cystein Bered färsk före användning.
Detta motsvarar en 4 mm Concentration av Aha, även om olika koncentrationer kan användas (se Representativa resultat).
Met stamlösning (25 ×) DMEM (-Met /-Cys) kompletterat med 100 mM L-metionin Framställ färsk och filter med en 0,2-im sterilt sprutfilter före användning.
Met kontrollmedium DMEM (-Met /-Cys) kompletterat med 10% BCS, Met stamlösning (1 x), 2 mM L-cystein Bered färsk före användning.
Ac 4 GalNAz stamlösning (1000 x) 50 mM peracetylerades N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) i metanol Lagra vid 4 ° C. Ac 4 GalNAz är en metabolisk föregångare till GlcNAz.
Azido-socker märkning medelstora 100 | il Ac 4 GalNAz stamlösning, 100 ml HEK 293 cellodlingsmedium Tillåta metanol för att avdunsta före tillsats HEK 293-medium celltillväxt.
Cesiumklorid lösningar CsCl upplöses i TD-buffert:
1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml H2O)
1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml H2O)
1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml H2O)
Densitetsgradienter för ultracentrifugering
Virus lagringsbuffert Fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2, innehållande 0,5 mM CaCl2, 0,9 mM MgCl2, och 10% (volym / volym) glycerol Lagra vid -20 ° C
TAMRA-BCN (SPAAC) märkning-lösning TAMRA-BCN i DMSO:
  1. Använd UV absorbance (OD 260 Assay) för att bestämma titern av viruset lösningen i steg 4,1
  2. Fastställa det totala antalet viruspartiklar i 50 | il alikvot (N Ad5)
  3. TAMRA-BCN molaritet (i M) bestäms med hjälp av:
    c BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N-AvO)
    N Avo = 6,022 × 10 23
    (Så att reaktionsblandningen framställd i Steg 4 innehåller 100 alkyn sonder per virion)
Stam-främjas alkyn sond
För SDS-PAGE, en virustiter av ca 10 12 partiklar per ml föreslås
TAMRA-alkyn (CuAAC) märkning-lösning 50 pl av azid-modifierad Ad5-virus i lagringsbuffert (N Ad5 bestämdes såsom ovan), 1,5 mM batho fenantrolin disulfonat (dvs. 1,5 × slutlig CuBr koncentration), TAMRA-alkyn.
TAMRA-alkyn molaritet (i M) bestäms med hjälp av:
c Alk = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo)
(Så att reaktionsblandningen framställd i Steg 5 innehåller 100 alkyn sonder per virion)
Tris-buffert är känd att vara en konkurrenskraftig och hämmande liganden av koppar. 8
Laemmli provbuffert (2 x) 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (vikt / volym) SDS, 20% (volym / volym) glycerol, 10% (volym / volym) 2-merkaptoetanol och 0,004% (vikt / volym) bromfenolblått
Kömingsbuffert 187 mM glycin, 19 mM Tris-HCl, 3,5 mM SDS i H2O Lagra vid 4 ° C
t "> Tabell 1. Beredning av buffertar och lösningar som krävs i detta protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Utvecklingen av kemoselektiv och bioorthogonal klicka reaktioner, däribland azider, är en snabbt växande forskningsområde, och därefter finns det ett växande antal av dessa reaktioner att välja mellan för biokonjugering applikationer. Vi har begränsat omfattningen av detta protokoll till att omfatta endast två metoder som valdes på grund av deras användbarhet i vårt eget labb och kommersiell tillgänglighet av alla reagenser.

I den första sträckan - stam-främjas azid-alkyn cykloaddition (SPAAC) - det alkynen är innesluten i en cyclooctyne ring (figur 2a). Denna nyligen utvecklade metoden kan utföras under syresatt atmosfär och utan behov av en kopparkatalysator. Tills nyligen var en nackdel med denna metod besvärlig syntes och minskad kommersiella tillgängligheten av dessa spända alkyner jämfört med terminala alkyner som används i 9,10 koppar (I)-katalyserad azid-alkyn-cykloaddition (CuAAC), men det är ett växande bibliotek av dessa sönder nu kommersiellt tillgängliga (se tabell av reagens). Av dessa skäl har vi valt SPAAC som den metod som väljs på detta protokoll.

Beskrivs också i detta protokoll är ligeringen av azid-modifierade adenovirala partiklar via CuAAC i syrebefriad atmosfär med användning av batofenantrolin-disulfonsyra-dinatriumsalt (BDA) som en kelatbildare (figur 2b). Denna metod är lämplig att BDA katalysatorn är båda kommersiellt tillgängliga och billiga. Dessutom rapporterade utbytena är i allmänhet störst av de tillgängliga metoderna och komplikationer på grund av alstringen av reaktiva syrespecies (se syresatt CuAAC, nedan) i lösning undviks. 8 är emellertid koppar (I) katalysator känd för att vara cytotoxiska, 11 och specialutrustning som krävs för att genomföra denna procedur kan avskräcka vissa grupper från att använda den. Ändå finner vi denna metod effektiv och användbar föradenovirus modifiering.

En tredje användbar metod för CuAAC har nyligen utvecklats för att arbeta under oxygenerade atmosfäriska förhållanden (figur 2c). Åtnjuter samma förmåner som den BDA-kelaterade strategi utan använder i stället THPTA som kelatbildare att rymma luftens syre utan oxidativ förstörelse av 8 Denna metod substratet. En liten nackdel med detta tillvägagångssätt är den nuvarande bristen på kommersiell tillgänglighet THPTA, även enkla synteser av denna kelatbildare har rapporterats. 8 Även om vi inte har utfört denna ligering metoden på vårt eget system, skulle THPTA / CuAAC förväntas fram jämförbar resultat till BDA / CuAAC, med den fördelen av syresatt atmosfär tolerans.

Trots avsiktligt utveckla detta protokoll omkring kommersiellt tillgängliga material, vill vi ändå att känna igen kostnadsfördelar och ökad flexibilitet syntetiseraazider och alkyn sonder som används här. Azidohomoalanine kan beredas på så lite som tre dagar och för betydligt mindre än kommersiella källor. 6,12 Redovisat ansträngda alkyn preparat är svårare 11 men ger större frihet sond val.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi vill erkänna NSF för finansiering (CBET-0.846.259).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene BCBC 391
Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells ATCC CRL-1573
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose Invitrogen 11965-092
Dulbecco's Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose Invitrogen 21013-024
Bovine Calf Serum Invitrogen 16170-078
Penicillin - Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) Invitrogen 15140-122
0.5% Trypsin-EDTA (10×) Invitrogen 15400-054
100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene BD Falcon 353003
Cell culture CO2 incubator
Hemocytometer
Biosafety cabinet
Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) VWR 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe)
Avanti J-E centrifuge Beckman Coulter 369001
Conical tubes (50 ml, sterile) BD Falcon 352098
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm Beckman 344059
Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor Beckman
Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml Eppendorf 0030 121.589
Centrifuge 5418 Eppendorf 5418
Centri-Sep gel filtration spin columns Princeton Separations CS-901
Sterile needle, 18 gauge
Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed)
Dewar flask
Liquid nitrogen
Electrophoresis cell
Fluorescent gel scanner
Ready Gel Tris-HCl Gel Bio-Rad 161-1105
L-Azidohomoalanine AnaSpec 63669
Jena Biosciences CLK-AA005
Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) Invitrogen C33365
Thermo Scientific 88905
Sigma-Aldrich A7480
Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt MP Biomedicals 0215011201
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Methanol
Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)
Disodium Phosphate (Na2HPO4)
Phosphate buffered saline (PBS)
1M HCl
Glycerol
Bovine Serum Albumin
L-cysteine
L-methionine
SDS (sodium dodecyl sulfate)
2-mercapt–thanol
Glycine
Bromophenol blue
Cesium Chloride (CsCl)
Copper(I) Bromide (CuBr)
Calcium Chloride (CaCl2)
Potassium Chloride (KCl)
Magnesium Chloride (MgCl2)
Sodium Chloride (NaCl)
Alkyne probe for CuAAC*
TAMRA Alkyne Invitrogen T10183
Strained alkyne probe for SPAAC*
TAMRA DIBO Alkyne Invitrogen C10410

* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors' catalogs.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
  2. Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
  3. Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
  4. Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
  5. Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
  6. Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
  7. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
  8. Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
  9. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  10. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
  11. Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
  12. Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
Kemoselektiv Ändring av virala ytor via Bioorthogonal Klicka Kemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rubino, F. A., Oum, Y. H., Rajaram, L., Chu, Y., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (66), e4246, doi:10.3791/4246 (2012).More

Rubino, F. A., Oum, Y. H., Rajaram, L., Chu, Y., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (66), e4246, doi:10.3791/4246 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter