Summary
Высокая пропускная проверки нескольких биомаркеров кандидат может быть выполнена последовательная ELISA для того, чтобы свести к минимуму циклов замораживания / оттаивания и использования драгоценных образцов плазмы. Здесь мы покажем, как последовательно выполнять ИФА для шести различных подтверждено биомаркеров плазмы
Abstract
Объективные открытие протеомики стратегии есть потенциал, чтобы идентифицировать большое количество новых биомаркеров, которые могут улучшить результаты диагностики и тестирования в клинических условиях и может помочь руководство терапевтических вмешательств. Когда большое число кандидатов белков определены, это может быть трудным для проверки кандидатов биомаркеров в своевременном и эффективном моды от пациента образцы плазмы, которые событию, конечный объем и незаменимы, например, в начале острой трансплантат-против- хозяина (РТПХ), потенциально опасное для жизни осложнение аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК).
Здесь мы опишем процесс выполнения коммерчески доступных ИФА в течение шести подтверждено GVHD белков: IL-2Rα 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, elafin 2, и REG3α 3 (также известная как PAP1) в последовательном моды свести к минимуму циклов замораживания-оттаивания, Талые время плазмы и плазменные использования. Для этой процедуры мы проводим ИФА в последовательном порядке, как это определено образца коэффициент разбавления, установленный в нашей лаборатории с помощью ELISA производитель наборов и протоколов с незначительными изменениями для облегчения оптимального последовательного исполнения ELISA. В результате концентрация в плазме крови биомаркеров могут быть обобщены и проанализированы значительные результаты в когорте пациентов. Хотя эти биомаркеры в настоящее время только для исследовательских целей, их включение в медицинской помощи в настоящее время изучается в клинических испытаниях.
Этот метод может быть применен для выполнения ИФА для нескольких белков / цитокинов проценты по той же выборке (ы), при условии образцы не должны быть смешаны с другими реагентами. Если ИФА комплекты не поставляются с предварительно покрытых пластинами, 96-а полу-луночные планшеты или 384-луночных планшетов могут быть использованы для дальнейшей минимизации использования образцов / реагентов.
Introduction
Острый трансплантат против хозяина (РТПХ), одной из ведущих причин, не рецидив смертности (NRM) после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), измеряется в трех дисфункции органов и систем: кожи, печени и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) тракта 4. Острая РТПХ обычно происходит от двух до восьми недель после пересадки, но может произойти позже, и часто клинически неотличимые от других пост-ТГСК осложнений, таких как режим кондиционирования токсичности, инфекции или побочные эффекты лечения. Благодаря использованию протеомных стратегии и высокой пропускной проверку с помощью последовательного ELISA, мы определили 6 белков, концентрация которых повышена в начале клинических проявлений РТПХ. IL-2Rα, TNFR1, HGF и IL-8, когда объединены в 4-биомаркеров панели могут диагностировать РТПХ в начале клинических симптомов и может предсказать, после ТГСК выживания независимо от тяжести GVHD 1. Elafin, биомаркеров для GVHD из SKВ, могут различать GVHD сыпь и высыпания от других причин, таких как наркотики извержений и не может предсказать выживания пересадки 2. Недавно мы определили REG3α в качестве биомаркеров РТПХ нижнего желудочно-кишечного тракта, органов-мишеней всего связаны с природными ресурсами. Плазменные REG3α концентрации может надежно идентифицировать РТПХ в качестве причины для пост-ТГСК диарея и коррелируют с гистологической тяжести GVHD по диагностике кишечной биопсии. REG3α концентрации на начало GI GVHD также может предсказать реакции на трансплантат против хозяина терапии и NRM 3. Включение этих подтверждено GVHD биомаркеров в клинической помощи в настоящее время изучается в клинических испытаниях.
Эти эксперименты проводились на небольшие аликвоты плазмы полученная от пациентов, получающих ГСК между 2000 и 2010 во время наступления GVHD, которые являются незаменимыми и ограниченном количестве. В связи с драгоценной природы этих образцов, мы разработали встретилисьХод измерения концентрации нескольких белков плазмы в эффективную, воспроизводимым способом ликвидации избыточных циклов замораживания-оттаивания, оттепель времени и плазменные использования. Этот метод может быть применен для выполнения ИФА для нескольких белков / цитокинов проценты по той же выборке (ы), при условии образцы не должны быть смешаны с другими реагентами. Если ИФА комплекты не поставляются с предварительно покрытых пластинами, 96-а полу-луночные планшеты или 384-луночных планшетов могут быть использованы для дальнейшей минимизации использования образцов / реагентов. Эта рукопись фокусируется на технологических аспектах измерения GVHD биомаркеров.
Protocol
1. Эксперимент День 0: Подготовка проб и ИФА тест плиты покрытия с Capture антитела к IL-2Rα, REG3α и HGF
- Плазменные аликвоты образцов для анализа будут выведены, оттаивают и центрифугируют при 12000 оборотов в минуту в течение 10 мин для отделения сгустков на дне и липидов на верхнем из плазмы. 150 мкл неразбавленного плазмы будут покрыты из каждого образца на 96-и V-нижняя пластина (источник пластины) ручной пипетки в соответствии с предопределенными карты. Аликвоты будут завернуты в парафильмом и держали во влажной камере при температуре 4 ° C в течение всего процесса; не более 72 часов.
- IL-2Rα и антител HGF захвата будет преобразован и разбавляют согласно спецификации производителя, и 50 мкл будут покрыты в каждую лунку соответствующего 96-а высоких обязательного половину и пластин, которые затем закрывают и инкубируют в течение ночи при 4 ° C. Кроме того, многие плиты могут быть высушены при 37 ° С и хранят при 4 ° C для дальнейшего использования, зависитING на стабильность белка.
- REG3α антител захвата будет разбавлять в зависимости от производителя протокол, используя производитель буферном покрытии и 25 мкл будет помещают в каждую лунку 384-а Nunc Maxi-SORP пластину, которая затем закрывают и инкубируют в течение ночи при 4 ° C.
2. Эксперимент День 1: IL-2Rα ELISA (рис. 1)
- IL-2Rα испытательной пластины промывают, их с Blotto в TBS, и стандартный восстанавливается и 8-точки калибровочной кривой готовят на производителя протокол.
- После промывания планшета после блокирования шагом 50 мкл неразбавленного плазмы покрытием в двух экземплярах от источника пластины к пластине ИФА, и 50 мкл каждого стандарта покрытием в двух экземплярах. Пластина запечатаны и выдерживают в течение 2 ч при комнатной температуре на тарелку ротатор установлен на 300 оборотов в минуту.
- Плазма отвоеванной у Ил-2Rα пластины теста ELISA и помещен обратно в ООНразбавляют пластины источника плазмы. ELISA завершена на производителя протокол (с учетом объемов половины луночных) и оптическую плотность каждой лунки будет читать с помощью набора пластин читателя 450-570 нм, а данные сохранены и проанализированы.
3. Эксперимент День 1: REG3α ELISA (рис. 1)
- 10 мкл неразбавленного плазмы будут переведены в отдельный V-дно источника пластины. 90 мкл производителя при условии разбавления буфера в каждую лунку добавляют для создания 1:10 пластины источника разведения.
- REG3α ELISA осуществляется на производителя протокол (с поправкой на объемы 384-луночных) и оптическую плотность каждой лунки будет читать с помощью ридер установлен на 450-620 нм, и данные будут сохранены и проанализированы.
4. Эксперимент День 1: Elafin и TNFR1 Тест плиты покрытия с Capture антител
- Elafin и антител TNFR1 захвата будет воссоздана и разбавленнойраспределенными в соответствии со спецификацией производителя и 50 мкл будут покрыты в каждую лунку соответствующего 96-а высоких обязательного полу-луночные планшеты, которые затем закрывают и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре Elafin, а при 4 ° С в течение TNFR1.
5. Эксперимент День 1-2: HGF ELISA (рис. 1)
- После завершения Ил-2Rα ELISA и обеспечения теста не нужно повторять по 60 мкл неразбавленного плазма будет передана в новую пластину источника, а затем 60 мкл 1% BSA в 1 х PBS добавляют в каждую лунку, чтобы 1:02 разбавленного пластины источника плазмы.
- Пластина HGF теста промывают, их с Blotto в TBS, и стандартный восстанавливается и 8-точки калибровочной кривой готовят на производителя протокол.
- После промывания планшета после блокировки шаг, 50 мкл разбавленного 1:2, плазма покрытием в двух экземплярах на тарелку ИФА, и 50 мкл каждого стандарта покрытием в двух экземплярах. Пластина запечатаны иинкубировали в течение ночи при комнатной температуре на тарелку ротатор установлен на 300 RPM.
- 1:02 разбавленной плазмы будет освобожден от испытательной пластины HGF ИФА и помещен обратно в 1:02 разбавленного пластины источника плазмы. ELISA завершена на производителя протокол (с учетом объемов половины луночных) и оптическую плотность каждой лунки будет читать с помощью набора пластин читателя 450-570 нм, а данные сохранены и проанализированы.
6. Эксперимент День 2: Elafin ELISA
- 10 мкл неразбавленного плазмы будут переведены на новую пластину источника, а затем 190 мкл 1% BSA в 1 х PBS будет добавлена в каждую лунку, чтобы сделать 200 мкл плазмы dluted 1:20.
- Elafin ELISA, как выполняется в соответствии с протоколом производителя (с учетом объемов полу-луночные планшеты), а оптическая плотность каждой лунки будет читать с помощью ридер установлен на 450-570 нм, а данные сохранены и проанализированы.
7. Эксперимент DaУ 2: TNFR1 ELISA
- 25 мкл 1% BSA в PBS будет добавлена к пластине 1:20 источников (в настоящее время, содержащей 100 мкл плазмы 1:20), чтобы получить 125 мкл разбавленной 1:25 плазмы.
- TNFR1 ELISA завершена на производителя протокол (с поправкой на объемы полу-луночных) и оптическую плотность каждой лунки будет читать с помощью ридер установлен на 450-570 нм, а данные сохранены и проанализированы.
8. Эксперимент День 2: IL-8 ELISA
- 60 мкл разбавленного 1:2, плазма будет передана в новую пластину источника, а затем 180 мкл IL-8 разбавителя в каждую лунку добавляют, чтобы сделать разбавленный 1:06 пластины источника плазмы.
- IL-8 ELISA завершена на производителя протокол (с поправкой на объемы полу-луночных) и оптическую плотность каждой лунки будет читать с помощью ридер установлен на 450-570 нм, а данные сохранены и проанализированы.
После того как все ИФА были завершены, unuseD складе плазмы будут заменены в талой аликвоты и замораживали для дальнейшего использования.
Representative Results
Рабочий процесс биомаркеров и сроки, подробно изложены в таблицах 1 и 2, соответственно. После завершения концентрации 6 различных белков в настоящее время количественные на том же образце плазмы с помощью общей сложности 150 мкл плазмы. Покрывая образцов в двух экземплярах на тест позволяет для внутреннего контроля качества, с менее чем 10% CV в оптимальных. При выполнении последовательных ELISA на нескольких пластинах, в соответствии оптической плотности высокого уровня являются предпочтительными и обеспечить улучшение взаимодействия пластины надежность измерений; стандартной кривой ОР могут быть сопоставлены между пластинами, чтобы посмотреть оценки за непоследовательность в ИФА производительности (рис. 2). Развитие раз, используя тетраметилбензидина колориметрического субстрата и высокая концентрация наблюдается ОР для каждой биомаркеров в нашей лаборатории, приведены в таблице 3.
tp_upload/4247/4247fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. Workflow для Ил-2Rα, REG3α и HGF ELISA. После того, как образцы плазмы были покрыты на Ил-2Rα пластин ИФА он будет утилизирован, чтобы сделать разведение пластин источником для других ELISA. Для HGF ELISA, плазма будет утилизирован подготовить 1:06 разбавление пластины для IL-8. Нажмите для увеличения рисунка .
Рисунок 2. Оптических плотностей для стандартной кривой 7 различных пластины ELISA измерения REG3α концентрациях, соответствующих 1084 обследованных пациентов на начальном REG3α GI GVHD биомаркеров доклада 3. В соответствии ОРВ между пластинами обеспечения последовательного измерения концентрации белка между пластинами. Концентрации белкаВ образцах плазмы рассчитывается путем сравнения оптической плотности образца в стандартной кривой оптической плотности.
| Эксперимент день 0 | 1. Подготовка образцов |
| 2. IL-2Rα, HGF и REG3α захвата Ab | |
| Эксперимент День 1 | 1. IL-2RαELISA |
| 2. REG3αELISA | |
| 3. HGF ИФА (через образец покрытия) | |
| 4. Elafin и TNFR захвата Ab | |
| Эксперимент 2-й день | 1. HGF ELISA завершению |
| 2. Elafin ELISA | |
| 3. TNFR1 ELISA | |
| 4. IL-8 ELISA | |
| 5. Заморозить неиспользованнуюплазма |
Таблица 1. GVHD биомаркеров Workflow обзор
| День 0 | Подготовка проб и инкубации в течение ночи тело захвата | ||||||
| ELISA | IL-2Rα | REG3α | HGF | Elafin | TNFR1 | IL-8 | |
| Время (ч) | 0,0 | Блокирование | |||||
| 1,0 | Образцы Металлизированное | <TD> | |||||
| 3,0 | Возвращается образцы плазмы; обнаружения Ab | Блокировка; подготовки проб (1:10) | |||||
| 4,0 | Образцы покрытием (1:10) | ||||||
| 5,0 | Стрептавидин-HRP | Обнаружение Ab | |||||
| 5,5 | TMB | Стрептавидин-HRP | |||||
| 6,0 | Плита чтения | TMB | Блокировка, подготовка образцов (1:2 разбавление) | ||||
| 6,5 | Плита чтения | ||||||
| 7,0 | Образцы покрытием (1:2) | Захват Ab (инкубации в течение ночи) | Захват Ab (инкубации в течение ночи) | ||||
| День 2 | |||||||
| Время (ч) | 0,0 | Возвращается плазма, обнаружение Ab | Блокировка, подготовка образцов (1:20) | ||||
| 1,0 | Примеры покрытий (1:2) | Блокировка; Дальнейшее разбавление 1:20 до 1:25 образцы разбавления | |||||
| 2,0 | HRP | Примеры покрытий (1:25) | |||||
| 2,5 | TMB | ||||||
| 3,0 | Плита чтения | Обнаружение Ab | |||||
| 3,5 | Подготовка образцов (1:6 разбавление) | ||||||
| 4,0 | Обнаружение Ab | Примеры покрытий (1:6) | |||||
| 5,0 | HRP | ||||||
| 5,5 | TMB | ||||||
| 6,0 | Плита чтения HRP | Обнаружение Ab | |||||
| TMB | |||||||
| 7,0 | Плита чтения | TMB | |||||
| 7,5 | Плита чтении | ||||||
| После завершения | Заменить источник плазмы на аликвоты и заморозить для дальнейшего использования | ||||||
Таблица 2. Сроки выполнения ИФА.
| Плазменные Коэффициент разведения | Высокий стандарт концентрации | Субстрат Развитие Время (мин) | Высокая OD | Кривая | |
| IL-2Rα | 1:01 | 2000 пг / мл | 5 | 1 | Линейный |
| HGF | 1:02 | 4000 пг / мл | 22 | 2,1 | 4-параметр |
| IL-8 | 1:06 | 200 пг / мл | 12 | 2,7 | 4-параметр |
| REG3α | 1:10 | 100 нг / мл | 12 | 1,7 | 4-параметр |
| Elafin | 1:20 | 2000 пг / мл | 20 | 1,9 | 4-параметр |
| TNFR1 | 1:25 | 800 пг / мл | 8 | 2,7 | Линейный |
Таблица 3. ELISA Подробности на 6 GVHD биомаркеров.
Discussion
Последовательный метод ИФА, представленные здесь позволяет производить измерения нескольких белков плазмы на малых объемах плазмы, которая может быть трудно получить и / или незаменимые, такие как образцы человеческих пациентов с редкими заболеваниями или плазму образцов, полученных от мышей 9,10. Последовательное ИФА, как правило, осуществляется в порядке возрастания фактора разбавления плазмы, с ИФА требует плазме разбавленной ≥ 1:10 правило, не нуждаются в утилизирован, хотя это можно сделать при желании. Способность выполнять последовательные ELISA ограничен ИФА / протоколы, в которых плазма смешивается с другими реагентами или для которых разведение различных буферов, необходимых для плазмы; это исключает ablility повторно использовать образец из-за опасений, что несовместима Буфер / реагента будет вмешиваться в выполнение конкретного теста. При тщательном планировании, 10 или более ИФА может быть выполнена на том же образце плазмы.
ENT "> Индивидуальные лаборатории может потребоваться настроить плазмы разведения, чтобы иметь интерпретируемые результаты, основанные на ожидаемых концентрациях в плазме крови белка в образцах из испытуемых. Различия в лабораторном оборудовании может привести к необходимости оптимизации инкубации и колориметрических развития раза, количество промываний и / или мытья замочить раз для того, чтобы оптимизировать любой ELISA.Для увеличения высокой пропускной способности и точности, и для выполнения анализов в экономически эффективным образом, использование роботов жидкость платформа обработки позволяет проводить анализ на 384-луночные планшеты и автоматизированная машина плита с укладки блока рекомендуется. Это оборудование может повысить достоверность и точность анализа, проведенного несколькими пользователями, и поможет обеспечить согласованность анализа для снижения меж-и внутри-анализ вариаций.
Мы использовали последовательное ELISA более доступные платформы мультиплексирования по двум причинам: 1) большинствоантитела пар для новых белков не может легко быть сопряжены с бисером или других материалов, а также трудоемким и дорогим, 2) отдельных ИФА являются более точными, чем микрочипов мультиплекс или бисером, вторичной по отношению к отсутствие перекрестной реактивности 11. Если надежный метод создан для выполнения мультиплексированных, шарик на основе микрочипов, это может быть в состоянии заменить последовательный процесс ELISA, но может быть ограничена возможность сопряженные антитела к бисера и / или по количеству белков желал быть проанализированы.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Поддерживается гранты NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, Хартвелл Фонда, и Дорис Дьюк благотворительный фонд. Доктор Paczesny является следователь Эрик Hartwell фонда и Эми Strelzer Manasevit исследовательской программы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
| Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
| Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
| Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
| Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
| Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
| Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
| 96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
| Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
| Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
| HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
| TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |
References
- Paczesny, S. A biomarker panel for acute graft-versus-host disease. Blood. 113, 273-278 (2009).
- Paczesny, S. Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin. Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).
- Ferrara, J. L. Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease. Blood. , (2011).
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. Graft-versus-host disease. Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
- Miyamoto, T. Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease. Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).
- Holler, E. Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation. Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).
- Okamoto, T. Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease. Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).
- Uguccioni, M. Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease. Blood. 81, 2252-2256 (1993).
- Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes. J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).
- Osuchowski, M. F., Remick, D. G. The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA. Methods. 38, 304-311 (2006).
- Schweitzer, B. Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification. Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).
