Summary
Hög genomströmning validering av flera kandidat biomarkörer kan utföras genom sekventiell ELISA i syfte att minimera frysnings / upptiningscykler och användning av dyrbara plasmaprover. Här visar vi hur sekventiellt för att utföra ELISA för sex validerade olika plasma biomarkörer
Abstract
Objektiva upptäckt proteomik strategier har potential att identifiera ett stort antal nya biomarkörer som kan förbättra diagnostik och prognostisk tester i en klinisk miljö och kan hjälpa guide terapeutiska ingrepp. När ett stort antal kandidat proteiner identifieras, kan det vara svårt att validera kandidat biomarkörer i ett snabbt och effektivt sätt från patientprover plasmaprover som är händelsestyrd, av ändlig volym och oersättliga, såsom i början av akut graft-versus- värdsjukdom (GVHD), en potentiellt livshotande komplikation av allogen hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT).
Här beskriver vi processen med att utföra kommersiellt tillgängliga ELISA för sex validerade GVHD proteiner: IL-2Ra 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, elafin 2 och REG3α 3 (även känd som PAP1) i ett sekventiellt sätt för att minimera frysnings-upptiningscykler, Tinade plasma tid och plasma användning. För denna procedur vi utför ELISA i ordningsföljd som bestäms av prov utspädningsfaktor fastställts i vårt laboratorium med tillverkarens ELISA kit och protokoll med mindre justeringar för att underlätta optimal sekventiell ELISA prestanda. De resulterande plasma biomarkörer koncentrationer kan sedan sammanställas och analyseras för viktiga resultat inom en patient kohort. Medan dessa biomarkörer för närvarande för forskningsändamål endast är deras införlivande i klinisk vård utreds för närvarande i kliniska prövningar.
Denna teknik kan användas för att utföra ELISA för flera proteiner / cytokiner av intresse på samma prov (er) under förutsättning att proven inte behöver blandas med andra reagens. Om ELISA kit inte kommer med förbelagda plattor, 96-brunns halv-brunnars plattor eller 384-brunnars plattor kan användas för att ytterligare minimera användningen av prover / reagens.
Introduction
Akut transplantat-mot-värd-sjukdom (GVHD), en ledande orsak till icke-återfall dödlighet (NRM) efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT), mäts genom dysfunktion i tre organsystem: huden, levern och gastrointestinala (GI) tarmkanalen 4. Akut GVHD uppstår vanligen mellan två och åtta veckor efter transplantation men kan förekomma senare och är ofta kliniskt skilja från andra efter HSCT komplikationer såsom konditionering regim toxicitet, infektion eller medicinering biverkningar. Genom användningen av proteomik strategier och hög genomströmning validering använder sekventiell ELISA, har vi identifierat 6 proteiner vars koncentrationer förhöjda vid debuten för kliniska manifestationer av GVHD. IL-2Ra, TNFR1, HGF och IL-8, när de kombineras i en 4-biomarkör panelen kan diagnostisera GVHD vid början av kliniska symtom och kan förutsäga efter HSCT överlevnad oberoende av GVHD svårighetsgrad 1. Elafin, en biomarkör för GVHD av skin kan skilja mellan GVHD utslag och utslag av andra orsaker, t.ex. läkemedel utbrott och kan förutsäga transplantation överlevnad 2. Vi har nyligen identifierat REG3α som en biomarkör av GVHD i den nedre mag-tarmkanalen, de flesta målorganet associerad med NRM. Plasma REG3α koncentration kan tillförlitligt identifiera GVHD som orsak för post-HSCT diarré och korrelerar till histologiska svårighetsgraden av GVHD på diagnostiska tarmbiopsier. REG3α koncentrationer vid GI GVHD början kan också förutsäga känslighet för GVHD terapi och NRM 3. Införlivandet av dessa validerade GVHD biomarkörer i klinisk vård utreds för närvarande i kliniska prövningar.
Dessa experiment utfördes på små plasma alikvoter som samlats in från patienter som HSCT mellan 2000 och 2010 i samband med GVHD debut som är oersättliga och begränsad mängd. På grund av den dyrbara naturen hos dessa prover, har vi utvecklat en metHod att mäta flera plasma protein på ett effektivt, reproducerbart sätt för att eliminera överskott frys-tö cykler, tina tid och plasma-användning. Denna teknik kan användas för att utföra ELISA för flera proteiner / cytokiner av intresse på samma prov (er) under förutsättning att proven inte behöver blandas med andra reagens. Om ELISA kit inte kommer med förbelagda plattor, 96-brunns halv-brunnars plattor eller 384-brunnars plattor kan användas för att ytterligare minimera användningen av prover / reagens. Detta manuskript fokuserar på de tekniska aspekterna av att mäta GVHD biomarkörer.
Protocol
1. Experiment Dag 0: Provberedning och ELISA testplatta Beläggning med infångningsantikropp för IL-2Ra, REG3α och HGF
- Plasma Delmängder som skall analyseras kommer att dras, tinas och centrifugerades vid 12.000 rpm under 10 minuter för att separera koagel vid botten och lipider ovanpå från plasman. 150 il outspädd plasma skall pläteras från varje prov på en 96-brunnars V-botten platta (källplattan) genom manuell pipettering enligt fördefinierade kartor. Alikvoterna skall förpackas i parafilm och hölls i en fuktig kammare vid 4 ° C under hela processen, inte längre än 72 timmar.
- IL-2Ra och HGF-antikroppar fånga kommer att beredas och spädas per tillverkare specifikation och 50 pl kommer utströks i varje brunn i respektive 96-brunnars hög-bindande halv-brunnsplattor vilka sedan förseglas och inkuberas över natten vid 4 ° C. Alternativt kan många plattor torkas vid 37 ° C och lagrades vid 4 ° C för senare användning, beroendeIng på stabiliteten hos proteinet.
- REG3α infångningsantikropp kommer spädas enligt tillverkarens protokoll med användning av buffert tillverkare beläggning och 25 pl kommer att pläteras i varje brunn av en 384-väl Nunc Maxi-Sorp platta som sedan försluts och inkuberas över natten vid 4 ° C.
2. Experiment Dag 1: IL-2Ra-ELISA (figur 1)
- IL-2Ra testplatta tvättas, blockeras med BLOTTO i TBS, och standardavvikelsen bereds och en 8-punkt standardkurva beredd enligt tillverkarens protokoll.
- Efter tvättning av plattan efter blockerande steget 50 il outspädd plasma utströks i duplikat från källplattan till ELISA-testplattan, och 50 | il av varje standard pläteras i duplikat. Plattan förseglas och inkuberas under 2 timmar vid rumstemperatur på en platta rotator inställd på 300 varv per minut.
- Plasman återvinns från IL-2Ra ELISA-test plattan och placeras tillbaka i FNutspädd platta plasmakälla. ELISA avslutas per tillverkare protokoll (med volymer justerat för halv-brunnar) och den optiska densiteten för varje brunn läses med hjälp av en uppsättning plattläsare till 450-570 nm och data sparas och analyseras.
3. Experiment Dag 1: REG3α ELISA (figur 1)
- 10 il outspädd plasma kommer att överföras till en separat v-botten källplatta. 90 pl av tillverkarens tillhandahålls-spädningsbuffert tillsätts till varje brunn för att skapa en 1:10 spädning platta källa.
- Den REG3α ELISA utförs per tillverkare protokoll (med volymer justerat för 384-brunnar) och den optiska densiteten för varje brunn läses med hjälp av en plattläsare inställd på 450-620 nm och data sparas och analyseras.
4. Experiment Dag 1: Elafin och TNFR1 testplatta Beläggning med infångningsantikropp
- Elafin och TNFR1 antikroppar fånga blir rekonstituerad och utspädderas per tillverkare specifikation och 50 pl kommer utströks i varje brunn i respektive 96-brunnars hög-bindande halv-brunnsplattor vilka sedan förseglas och inkuberas över natten vid rumstemperatur under Elafin, och vid 4 ° C under TNFR1.
5. Experiment Dag 1-2: HGF-ELISA (figur 1)
- Efter avslutad IL-2Ra ELISA och säkerställa testet inte behöver upprepas, kommer 60 il outspädd plasma överfördes till en ny källa plattan och sedan 60 pl av 1% BSA i 1 x PBS sattes till varje brunn för att göra en utspädning 1:2 plasmakälla plattan.
- HGF testplatta tvättas, blockeras med BLOTTO i TBS, och standardavvikelsen bereds och en 8-punkt standardkurva beredd enligt tillverkarens protokoll.
- Efter tvättning av plattan efter blockerande steget 50 pl av 1:2 utspädd plasma pläteras i två exemplar på ELISA testplatta, och 50 | il av varje standard pläteras i duplikat. Plattan förseglas ochinkuberades över natten vid rumstemperatur på en platta rotator inställd på 300 rpm.
- 1:2-utspädd plasma återvinns från HGF ELISA-testplattan och placeras tillbaka i utspädning 1:2 plasman källplatta. ELISA avslutas per tillverkare protokoll (med volymer justerat för halv-brunnar) och den optiska densiteten för varje brunn läses med hjälp av en uppsättning plattläsare till 450-570 nm och data sparas och analyseras.
6. Experiment Dag 2: Elafin ELISA
- 10 il outspädd plasma kommer att överföras till en ny källa plattan och sedan 190 | il av 1% BSA i 1 x PBS kommer att läggas till varje brunn för att göra 200 il plasma dluted 1:20.
- Den Elafin ELISA utförs som enligt tillverkarens protokoll (med volymer justerat för halv-brunnar), och den optiska densiteten för varje brunn läses med hjälp av en plattläsare inställd på 450-570 nm och data sparas och analyseras.
7. Experiment Day 2: TNFR1 ELISA
- 25 pl av 1% BSA i PBS kommer att läggas till 1:20 källplattan (nu innehållande 100 pl plasma 1:20) för att erhålla 125 il 1:25 utspädd plasma.
- Den TNFR1 ELISA avslutas per tillverkare protokoll (med volymer justerat för halv-brunnar) och den optiska densiteten för varje brunn läses med hjälp av en plattläsare inställd på 450-570 nm och data sparas och analyseras.
8. Experiment Dag 2: IL-8-ELISA
- 60 pl av 1:2 utspädd plasma kommer att överföras till en ny källa plattan och sedan 180 pl av IL-8 spädningsmedel tillsätts till varje brunn för att göra en 01:06 utspädd platta plasmakälla.
- IL-8-ELISA är klar per tillverkare protokoll (med volymer justerat för halv-brunnar) och den optiska densiteten för varje brunn läses med hjälp av en plattläsare inställd på 450-570 nm och data sparas och analyseras.
När alla ELISA har slutförts, unused lager plasma kommer att ersättas i de upptinade alikvoter och frystes för framtida användning.
Representative Results
Den biomarkör arbetsflöde och tidslinje beskrivs i tabell 1 och tabell 2, respektive. När de är färdiga, koncentrationer av 6 olika proteiner har nu kvantifieras på samma plasmaprovet användning av totalt 150 | il plasma. Plätering av proverna i två exemplar per test möjliggör intern kvalitetssäkring, med CV mindre än 10% är optimalt. Om du utför den sekventiella ELISA på flera plattor, konsekvent optiska densiteter av den höga standarden är att föredra och möjliggöra bättre mellan plattorna tillförlitlighet mätningar, standardkurva OD kan jämföras mellan plattorna för att söka bedöma för inkonsekvens i ELISA prestanda (figur 2). Development gånger med tetrametylbensidin kolorimetriskt substrat och hög koncentration OD observerades för varje biomarkör i vårt laboratorium anges i tabell 3.
tp_upload/4247/4247fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/>
Figur 1. Arbetsflöde för IL-2Ra, REG3α och HGF ELISA. Efter plasmaproverna har pläteras på de IL-2Ra ELISA testplattor det återvinns att utspädning källplattor för andra ELISA. För HGF ELISA är plasman återvinns för att framställa 01:06 utspädning plattan för IL-8. Klicka här för större figur .
Figur 2. Optiska densiteter för standardkurvan av 7 olika ELISA-plattor mäter REG3α koncentrationer motsvarande de 1084 patienter som testats för den inledande REG3α GI GVHD biomarkör rapport 3. Konsekvent OD mellan plattorna säkerställer konsekventa mätningar proteinkoncentration mellan plattorna. Koncentrationer av proteineri plasma prover beräknas genom att jämföra prov optiska densiteter med standardkurvan optiska densiteter.
| Experiment Dag 0 | 1. Förbered prover |
| 2. IL-2Ra, HGF och REG3α fånga Ab | |
| Experiment Dag 1 | 1. IL-2RαELISA |
| 2. REG3αELISA | |
| 3. HGF-ELISA (genom prov plätering) | |
| 4. Elafin och TNFR fånga Ab | |
| Experiment Dag 2 | 1. HGF ELISA färdigställande |
| 2. Elafin ELISA | |
| 3. TNFR1 ELISA | |
| 4. IL-8-ELISA | |
| 5. Frysas på nytt oanväntplasma |
Tabell 1. GVHD Biomarker arbetsflöde Översikt
| Dag 0 | Provberedning och övernattning fånga kropp inkubation | ||||||
| ELISA | IL-2Ra | REG3α | HGF | Elafin | TNFR1 | IL-8 | |
| Tid (h) | 0,0 | Blockering | |||||
| 1,0 | Förgyllda prover | <td> | |||||
| 3,0 | Reclaim plasmaprover, Detection Ab | Blockering, förbered Prover (1:10 spädning) | |||||
| 4,0 | Prover guldpläterade (1:10) | ||||||
| 5,0 | Streptavidin-HRP | Detektering Ab | |||||
| 5,5 | TMB | Streptavidin-HRP | |||||
| 6,0 | Plattläsande | TMB | Blockering, förbered prover (1:2 utspädning) | ||||
| 6,5 | Plattläsande | ||||||
| 7,0 | Prover guldpläterade (1:2) | Capture Ab (inkubering över natten) | Capture Ab (inkubering över natten) | ||||
| Dag 2 | |||||||
| Tid (h) | 0,0 | Reclaim plasma, Detection Ab | Blockering, förbered prover (1:20) | ||||
| 1,0 | Prov plätering (1:2) | Blockering, Ytterligare spädning av 1:20 prov 1:25 utspädning | |||||
| 2,0 | HRP | Prov plätering (1:25) | |||||
| 2,5 | TMB | ||||||
| 3,0 | Plattläsande | Detektering Ab | |||||
| 3,5 | Förbered prover (1:6 utspädning) | ||||||
| 4,0 | Detektering Ab | Prov plätering (1:6) | |||||
| 5,0 | HRP | ||||||
| 5,5 | TMB | ||||||
| 6,0 | Plattläsande HRP | Detektering Ab | |||||
| TMB | |||||||
| 7,0 | Plattläsande | TMB | |||||
| 7,5 | Plattläsande | ||||||
| Efter fullbordan | Byt källa plasma i portioner och frysa för senare användning | ||||||
Tabell 2. Tidslinje för att utföra ELISA.
| Plasma Utspädningsfaktor | Hög standard Koncentration | Substrat Development Tid (min) | Hög OD | Kurva | |
| IL-2Ra | 01:01 | 2.000 pg / ml | 5 | 1 | Linjär |
| HGF | 01:02 | 4.000 pg / ml | 22 | 2,1 | 4-parametern |
| IL-8 | 01:06 | 200 pg / ml | 12 | 2,7 | 4-parametern |
| REG3α | 1:10 | 100 ng / ml | 12 | 1,7 | 4-parametern |
| Elafin | 1:20 | 2.000 pg / ml | 20 | 1,9 | 4-parametern |
| TNFR1 | 1:25 | 800 pg / ml | 8 | 2,7 | Linjär |
Tabell 3. ELISA Detaljer för 6 GVHD biomarkörer.
Discussion
Den sekventiella ELISA-metod som presenteras här tillåter mätning av flera plasmaproteiner på små volymer plasma som kan vara svåra att få tag på och / eller oersättliga som prover från människor med sällsynta sjukdomar eller plasmaprov som erhållits från möss 9,10. De sekventiella ELISA vanligtvis utförs i den ordning av ökande plasma spädningsfaktor med ELISA kräver plasma utspädd ≥ 1:10 vanligtvis inte behöver återkrävas, även om detta kan göras om så önskas. Förmågan att utföra sekventiell ELISA begränsas av ELISA kit / protokoll där plasma blandas med andra reagens eller för vilka olika utspädning buffertar behövs för plasman, vilket utesluter ablility att återanvända ett prov på grund av oro för att en inkompatibel buffert / reagens stör utförandet av en viss test. Med noggrann planering kan 10 eller fler ELISA utföras på samma plasmaprov.
ENT "> Individuella laboratorier kan behöva justera plasma utspädningar för att få tolkningsbara resultat baserade på förväntade plasmakoncentrationer av proteinet av intresse i proverna från försökspersonerna. Skillnader i laboratorieutrustning kan resultera i ett behov att optimera inkubation och kolorimetriska utveckling gånger, antalet tvättar och / eller tvätta blöta gånger för att optimera någon given ELISA.För att öka hög genomströmning kapacitet och noggrannhet och att utföra analyser på ett kostnadseffektivt sätt, är användningen av en robot vätskehanterande plattform som kan analys på 384 brunnar och en automatiserad plattvättare med staplingsenhet rekommenderas. Denna utrustning kan öka noggrannhet och precision av analys av flera användare, och bidra till att ge konsekvent analys för att minska inter-och intra-assay variation.
Vi använde sekventiell ELISA över tillgängliga multiplex plattformar för två anledningar: 1) De flesta av deantikroppar par för nya proteiner kan inte lätt konjugeras på pärlor eller annat material samt tidskrävande och dyrt, 2) enskilda ELISA-analyser är mer precisa än multiplex microarray eller pärlor, sekundärt till en frånvaro av korsreaktivitet 11. Om en tillförlitlig metod etableras utföra multiplexerade, pärl-baserade mikromatriser, kan det vara kunna ersätta den sekventiella ELISA-processen, men kan begränsas av förmågan att konjugera antikropparna till pärlorna och / eller av antalet proteiner önskas vara analyseras.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Med stöd av NIH bidrag RC1-HL-101.102, P01-CA039542, T32-HL007622 har Hartwell Foundation och Doris Duke Charitable Foundation. Dr Paczesny är en utredare för Eric Hartwell fonden och Amy Strelzer Manasevit forskningsprogram.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
| Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
| Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
| Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
| Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
| Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
| Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
| 96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
| Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
| Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
| HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
| TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |
References
- Paczesny, S. A biomarker panel for acute graft-versus-host disease. Blood. 113, 273-278 (2009).
- Paczesny, S. Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin. Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).
- Ferrara, J. L. Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease. Blood. , (2011).
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. Graft-versus-host disease. Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
- Miyamoto, T. Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease. Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).
- Holler, E. Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation. Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).
- Okamoto, T. Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease. Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).
- Uguccioni, M. Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease. Blood. 81, 2252-2256 (1993).
- Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes. J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).
- Osuchowski, M. F., Remick, D. G. The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA. Methods. 38, 304-311 (2006).
- Schweitzer, B. Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification. Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).
