Summary
يتم عزل الخلايا السرطانية تنتشر من الدم لمرضى السرطان دون إلحاق الضرر الخلوي. ويتم إنجاز عزل الخلايا السرطانية باستخدام سطح ثنائي الجزيء من selectin-E بالإضافة إلى أجسام مضادة ضد علامات الظهارية. وطلاء أنابيب يعزز تحديدا سرطان التصاق الخلية مما يؤدي إلى ارتفاع درجات نقاء القبض.
Abstract
الخلايا السرطانية المنتشرة (CTC) هي الخلايا التي تنشر من الورم الرئيسي طوال الدورة الدموية والتي يمكن أن تشكل في نهاية المطاف أورام ثانوية في مواقع بعيدة. ويمكن استخدام لجنة مكافحة الإرهاب لمتابعة العد تطور المرض على أساس العلاقة بين تركيز لجنة مكافحة الإرهاب في الدم، وشدة المرض 1. كأداة للعلاج، يمكن أن تدرس لجنة مكافحة الإرهاب في المختبر لتطوير علاجات شخصية. تحقيقا لهذه الغاية، لجنة مكافحة الإرهاب يجب أن لا تسبب أي العزلة تلف الخلايا، والتلوث بواسطة أنواع الخلايا الأخرى، وبخاصة الكريات البيض، لا بد من تجنبها بقدر الإمكان 2. العديد من التقنيات الحالية، بما في ذلك جهاز وافقت عليها الهيئة الوحيدة للتعداد لجنة مكافحة الإرهاب، وتدمير لجنة مكافحة الإرهاب كجزء من عملية العزلة (لمزيد من المعلومات، انظر المرجع 2). يوصف جهاز ميكروفلويديك للقبض على لجنة مكافحة الإرهاب قابلة للحياة، التي تتكون من سطح functionalized مع E-selectin بروتين سكري، بالإضافة إلى أجسام مضادة ضد علامات الظهارية 3. لتحسين ادائها جهازومانس طلاء جسيمات متناهية الصغر يمكن تطبيقه تتألف من الأنابيب النانومترية halloysite، وهي جسيمات متناهية الصغر ألومينوسيليكات تحصد من طين 4. الجزيئات E-selectin توفر وسيلة لالتقاط سريع لجنة مكافحة الإرهاب التي تتحرك من خلال ضخ الجهاز، والإقراض ميزة على أجهزة ميكروفلويديك بديل فيها أوقات أطول معالجة ضرورية لتوفير الخلايا المستهدفة مع ما يكفي من الوقت للتفاعل مع سطح. الأجسام المضادة لأهداف توفير الظهارية لجنة مكافحة الإرهاب، خصوصية إلى الجهاز، فضلا عن توفير معلمة قابل للتعديل بسهولة لضبط العزلة. وأخيرا، فإن طلاء أنابيب halloysite يسمح العزلة زيادة كبيرة بالمقارنة مع غيرها من التقنيات من خلال المساعدة في القبض على خلايا تتحرك بسرعة، وتوفير زيادة المساحة السطحية لامتصاص البروتين، وطارد للالكريات البيض تلويث 3،4. وينتج هذا الجهاز عن طريق تقنية بسيطة باستخدام قبالة الجاهزة للاستخدام المواد، واستخدمت بنجاح لالتقاط الخلايا السرطانية من الدم من النقيليمرضى السرطان. تتم المحافظة على الخلايا والقبض لمدة تصل إلى 15 يوما في أعقاب ثقافة العزلة، وهذه العينات عادة ما تتألف من> 50٪ قابلة للحياة الخلايا السرطانية الأولية من كل مريض. وقد استخدم هذا الجهاز لالتقاط لجنة مكافحة الإرهاب قابلة للحياة من الدم على حد سواء كل المخفف وعينات معطف بوفي. في النهاية، نقدم تقنية مع وظيفة في عملية إعداد سريرية لتطوير علاجات السرطان الشخصية.
Protocol
البروتوكول التالي لإنتاج جهاز microtube واحد.
1. إعداد الحل الأنابيب الجزيئية Halloysite
- يصوتن (10-13 واط (RMS)) 250 أنابيب halloysite ميكرولتر حل (6.6٪ من وزن في الماء) و 30 ثانية. بارد حل مع الماء البارد وصوتنة تكرار مرة واحدة. تبريد مرة أخرى.
- رسم حل sonicated إلى حقنة، ونعلق حقنة 0.45 ميكرون مرشح ومرشح حل في أنبوب microfuge نظيفة. دوامة الحل في بعض الأحيان للحفاظ على التجانس.
2. طلاء السطوح الداخلية Microtube مع أنابيب Halloysite
- الحصول على 50 سم مقطع طويل من الصغرى، Renathane microtubing (300 قطرها ميكرون الداخلية، 35،3 حجم الداخلية ميكرولتر). خفض واحدة من نهاية microtube في قطر، وإدراجها في قطعة صغيرة محول آيدكس. إدراج إبرة حقنة من 1 29G 3/10 سم في الطرف الآخر من microtube.
- لتنظيف microtube، ووضع نهاية مفتوحة من microtube (نهايةمع محول) في الايثانول 70٪ وتعادل ~ 50 ميكرولتر الايثانول في حقنة لملء microtube.
- شطف الايثانول من microtube عن طريق رسم حجم سخية من الماء المقطر إلى الحقنة.
- فصل المحقنة من microtube، تفريغ حقنة، ثم أعد للmicrotube.
- يعد حل من 0.02٪ W / V-L يسين بولي في الماء. تجتذب 50 ميكرولتر في microtube والسماح للجلوس لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- رسم 100 ميكرولتر حل أنابيب المصفاة في microtube والسماح لاحتضان لمدة 3 دقائق على RT.
- رسم 100 ميكرولتر المياه من خلال microtube لشطف خارج الحل أنابيب. تسمح microtube المغلفة للجلوس، مملوءة بالماء، بين عشية وضحاها في RT.
3. إعداد Microtubes لعزل الخلية
- مخزنة يعد حل من 10 ميكروغرام / مل G بروتين في الفوسفات 1X Dulbecco في المياه المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7،0-7،2). تجتذب 50 ميكرولتر من خلال برنامج تلفزيوني microtube ثم ارسم ميكرولتر من 50الحل بروتين-G، والسماح لاحتضان لمدة 1.5 ساعة على RT.
- تحضير محلول يحتوي على 5 ميكروغرام / مل E-selectin-IgG و 50 ميكروغرام / مل الأجسام المضادة (المضادة للEpCAM لعينات معظم السرطان، ومكافحة PSMA لعينات من سرطان البروستاتا) في برنامج تلفزيوني. تجتذب 50 ميكرولتر من selectin-E و حل الأجسام المضادة في microtube والسماح لاحتضان لمدة 2 ساعة على RT.
- تم منع التصاق الخلايا غير محدد مع بروتين الحليب بنسبة 5٪. يعد حل من 5٪ (W / V) بروتين الحليب في برنامج تلفزيوني. تجتذب 50 بروتين الحليب ميكرولتر حل في microtube والسماح لاحتضان لمدة 1 ساعة على RT.
- تجتذب 50 PBS ميكرولتر في أنبوب وتترك على RT حتى عينات من الدم أو معطف بوفي على استعداد للمعالجة.
- 10 دقيقة قبل لاستخدام microtube للعزلة، تجتذب 50 PBS ميكرولتر التي تم مشبعة كا 2 + ("برنامج تلفزيوني +") لتنشيط الجزيئات selectin.
4. إعداد العينات لعزل الخلية
- رسم أو الحصول على 10 مل من الدم من المريض إلى heparinizedأنبوب.
- مكان 10 مل Ficoll-Paque حل العزلة اللمفاويات إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي. بلطف طبقة من الدم الكامل 10 مل على رأس Ficoll حتى لا تخلط الدم وFicoll.
- الطرد المركزي في ز 2000x لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية مع تباطؤ الحد الأدنى.
- إزالة طبقة معطف بافي والمكان في أنبوب جديد.
- غسل الغلالة الشهباء مع برنامج تلفزيوني (الطرد المركزي في ز 230x لمدة 10 دقيقة، تجاهل طاف).
- resuspend بلطف خلايا مع 1 مل العازلة تحلل RBC واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT إلى ليز كريات الدم الحمراء.
- إضافة 10 مل PBS، مزيج بلطف، وأجهزة الطرد المركزي في ز 230x لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وresuspend بلطف بيليه في برنامج تلفزيوني مل 3 إلى 4 +.
5. زنزانة انفرادية
- تعلق واحدة من نهاية microtube functionalized إلى حقنة 5 مل باستخدام محولات آيدكس.
- إدراج الحقنة على مضخة الحقن.
- يغرق في النهاية المفتوحة للmicrotube functionalized في suspensio الخليةن.
- معالجة تعليق الخلية من خلال microtube في 1-4 مل / ساعة.
- نقل نهاية مفتوحة للmicrotube على أنبوب يحتوي على برنامج تلفزيوني ورسم + 300 + PBS ميكرولتر إلى حقنة في 0.016 مل / دقيقة لإزالة غير منضم والخلايا ملزمة فضفاضة من microtube.
- وضع نهاية مفتوحة للmicrotube في أنبوب نظيف. قطع المحقنة من microtube ونعلق حقنة مملوءة مسبقا مع Accutase. يروي بلطف Accutase بما فيه الكفاية في microtube لملء (~ 50 ميكرولتر) والسماح لاحتضان في RT لمدة 10 دقيقة.
- تعلق حقنة مملوءة مسبقا مع 1 مل من وسائط النمو (79٪ RPMI، FBS 20٪، 1٪ البنسلين ستربتومايسين)، ويروي في microtube، وجمع مياه الصرف الصحي المعالجة في زراعة الأنسجة بشكل جيد لوحة.
- خلايا ثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في ظل ظروف مرطب.
6. ممثل النتائج
الهدف من هذه التقنية هو عزل الخلايا السرطانية قابلة للحياة من الدم لمرضى السرطان. توجد عدة أساليب للتعرف على الخلايا السرطانية في الثقافة؛ التحقق اللازمة للنجاح الجهاز. اخترنا لصبغ الخلايا في الثقافة مع الأجسام المضادة ضد الأنصاف الظهارية مثل EpCAM (الظهارية جزيء التصاق الخليوي) أو PSMA (مستضد البروستات غشاء محدد)، بالإضافة إلى دابي لتحديد سليمة نوى الخلايا (الشكل رقم 2 و 3). القبض على عدد من الخلايا السرطانية باستخدام هذه التقنية هو بالضرورة وظيفة من عدد من التدرجي في العينة ابتداء، وتقلب المريض يمكن أن تكون عالية. في تجهيز العينات المأخوذة من المرضى الذين شخصت مع سرطان المرحلة الرابعة، ونحن قبض على الخلايا السرطانية بشكل روتيني بين 100 و 500 في أنبوب من الدم، في درجات نقاء> 50٪. فورا بعد العزلة، قد أعداد أكبر من الكريات البيض تلويث تكون موجودة. ولكن أن تستنفد هذه الأرقام حضانة التالية في ثقافة المتوسط لمدة تصل إلى 5 أيام.
الشكل 2. بيانات الممثل من العزلة لجنة مكافحة الإرهاب من عينات الدم المأخوذة من الثدي المصاب بالسرطان والمريض بسرطان الرئة. ويمثل عدد الخلايا التي تم تحديدها بصورة إيجابية قابلة للحياة كما جنة مكافحة الإرهاب تقوم على تلطيخ EpCAM بواسطة قضبان الصلب وتتعلق الإحداثي اليسار والنسبة المئوية للخلايا التي حددت على أنها لجنة مكافحة الإرهاب بالمقارنة مع العدد الكلي للخلايا استولت تمثله الحانات مفتوحة و تقاس على الإحداثي الصحيح. النتائج وبعد خمسة أيام في الثقافة. 
الميكروسكوب الممثل الشكل 3. من الجهات المانحة منفصلة (A و B) من لجنة مكافحة الإرهاب في الثقافة 5 أيام لاحقة لisolatiعلى عينة من دم المريض بالسرطان. تم صبغ fluorescently الخلايا لEpCAM مع AlexaFluor 488 (أخضر) و 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي) لتصور نواة (الأزرق).
Discussion
هذا هو الحال غالبا أن الخطوات الأولى في اكتشاف علاجات جديدة للسرطان الاستفادة من خطوط الخلايا السرطانية، والتي تتحمل تشابه مشكوك فيه إلى الخلايا السرطانية الأولية لا تزال حتى الآن في استخدامها نظرا لسهولة استخدامها في المختبر. وسيتم التعجيل البحث في تطوير علاجات جديدة للسرطان إذا استخدمت الابتدائي الخلايا السرطانية البشرية في وقت مبكر في مجال البحوث رواية. لجنة مكافحة الإرهاب هي أكثر أنواع يمكن الوصول إليها بسهولة من الخلايا السرطانية، وذلك بسبب وجودها في الدم وسهولة بالتعادل الدم القياسية. وبالإضافة إلى ذلك، والخلايا السرطانية المنتشرة تمثل خطوة ضرورية في عملية الانبثاث 5،6، لذلك أهميتها بالنسبة للمرض وفائدة لاستهداف الأدوية الجديدة غير واضح. ومما يعقد من العزلة لجنة مكافحة الإرهاب من الدم في المختبر عن طريق تركيزها منخفض: بناء على أمر من واحد لكل مليون الكريات البيض أو واحد في المليار الكريات الحمراء 7. غالبية الطرق الحالية للكشف عن لجنة مكافحة الإرهاب في الدم، بما في ذلك تقنية خلية فقط وافقت عليها الهيئة بحث (Veridex)، ضرر أو تدمير خلايا في عملية الكشف، مما يحول دون استخدام وراء التعداد. ووصف الأسلوب أعلاه لا يضر بقاء الخلية، وبالتالي يفتح الباب أمام البحوث السريرية في المستقبل على السرطان. كما استرداد خلايا سليمة هو الهدف من هذه التقنية، لا بد من أن يتم التعامل معها الخلايا مع الرعاية، وخصوصا خلال خطوات فصل الدم.
هناك عدد من المعلمات في هذا النظام الانضباطي التي يمكن تغييرها لتحقيق تحسن العائد اعتمادا على الخصائص الحيوية مثل نوع السرطان. في الخطوات المذكورة أعلاه، ونحن قد اختارت لاستخدام EpCAM كما الأجسام المضادة لجنة مكافحة الإرهاب محددة لجميع أنواع السرطان إلا عند معالجة عينات من سرطان البروستاتا، حيث كان يستخدم لمكافحة PSMA. ويمكن بالتأكيد بدائل أخرى من السرطان محددة الأجسام المضادة يمكن استخدامها لتحسين الأداء الفردي للمرضى. وعلاوة على ذلك، يمكن تغيير selectin والأجسام المضادة تركيزات لتعزيز القبض على 8.
"> سمة أساسية من سمات هذا الجهاز هو دمج E-selectin الجزيئات على السطح. E-selectin يتم التعبير عادة على سطح اللمعية من الخلايا البطانية وظيفة الكريات البيض لتوظيف سريع الانتقال إلى مواضع الالتهابات. الكريات البيض يتدفق إلى ربط عابر جزيئات selectin، مما أدى إلى سلوك أبطأ، المتداول الذي يسهل ملزم أبطأ وأكثر قوة من الخلية إلى البطانة بواسطة لل integrins. أدلة تجريبية مقنعة وجود هذا يدلل على أن لجنة مكافحة الإرهاب يمكن أن يتسرب من خلال آلية مماثلة 9،10. إدراج selectin أيضا يسمح بتشغيل جهاز بمعدلات أكبر تدفق، ومعدلات من شأنه أن يمنع ذلك من الربط إلى الخلايا الأجسام المضادة 11. وهكذا لدينا جهاز يحاكي فيزيولوجيا 1 الوريد لالتقاط biomimetically تدفق لجنة مكافحة الإرهاب من دون إلحاق الأذى الخلوية.ويمكن أن يعزى إلى تعزيز أداء الجهاز إضافة للطلاء أنابيب halloysite إلى السطح اللمعيةللجهاز. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن هناك ثلاثة عناصر رئيسية للطلاء أنابيب التي تسمح لتحسين الأداء الوظيفي. أولا، طلاء أنابيب يتيح زيادة مساحة السطح، والسماح لأكبر ترسب البروتين على سطح ال 4. الثاني، في أداء ذرية المجهر قوة على طلاء أنابيب لقد توصلنا إلى أن الأنابيب النانومترية الفردية تبرز من السطح إلى تدفق. وهذا يسمح لتقديمها جزيئات selectin بقدر واحد ميكرون فوق السطح بحيث يمكن التقاط تلك الخلايا والمعينين على السطح في وقت سابق في مسارها من خلال أنبوب 4. وأخيرا، فإن طلاء أنابيب halloysite غير قادرة على منع التصاق الكريات البيض وتنتشر على السطح، والسماح لعدد أقل من كريات الدم البيضاء القبض على طول مع لجنة مكافحة الإرهاب، وبالتالي زيادة لاحقة درجات نقاء لجنة مكافحة الإرهاب 3.
Disclosures
MRK هو المستشار العلمي للCellTraffix، وشركة (روتشستر، نيويورك).
Acknowledgments
وأيد العمل الذي وصفه مركز كورنيل في المكروية والإنبثاث من خلال عدد جائزة U54CA143876 من المعهد الوطني للسرطان. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو المعاهد الوطنية للصحة. وقد تم تمويل هذا العمل بالإضافة إلى ذلك في جزء منه من قبل مؤسسة العلوم الوطنية زمالة بحوث دراسات عليا (ADH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 um ID tubing | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health Science | 1507L | |
| 5mL syringe for pump | BD Biosciences | 309603 | |
| Connector small to large tubing | IDEX Health Science | P-770 | |
| Connector large tubing to syringe | IDEX Health Science | F-120 and P-659 | |
| Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 | |
| Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 | |
| PSMA Antibody (GCP-04) | Abcam | ab66911 | |
| 96 well plates (Microtest 96) | BD Biosciences | 35-3072 | |
| Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad | 216005508 | |
| Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 | |
| rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES | |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |
References
- Allard, W. J. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Hughes, A. D., King, M. R. Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).
- Hughes, A. D. Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).
- Hughes, A. D., King, M. R. Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells. Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).
- Al-Mehdi, A. B. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat. Med. 6, 100-102 (2000).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: Building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).
- Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).
- Geng, Y., Marshall, J., King, M. Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation. Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 Forthcoming.
- Stott, S. L. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).
