Summary
Cirkulerende tumorceller isoleres fra blodet hos cancerpatienter uden at påføre celleskade. Isolering af tumorceller opnås ved anvendelse af en bimolekylær overflade af E-selectin i tillæg til antistoffer mod epitel markører. En nanorør coating specifikt fremmer cancer celleadhæsion resulterer i høje capture renheder.
Abstract
Cirkulerende tumorceller (CTC), er celler, der udbreder fra en primær tumor hele kredsløbssystemet, og som i sidste ende kan danne sekundære tumorer på fjerne steder. CTC tæller kan anvendes til at følge sygdommens progression baseret på korrelation mellem CTC-koncentrationen i blodet og sygdommens sværhedsgrad 1. Som en behandling værktøj kan CTC undersøges i laboratoriet for at udvikle personlige terapier. Til dette formål skal CTC isolation forårsager ingen cellulær beskadigelse og kontaminering med andre celletyper, især leukocytter, skal undgås så vidt muligt 2. Mange af de nuværende teknikker, herunder den eneste FDA-godkendte enhed til CTC optælling, ødelægge CTC som en del af isolation proces (for yderligere oplysninger se ref. 2). En mikrofluid anordning til at opsamle levedygtige CTC er beskrevet, som består af en overflade funktionaliseret med E-selectin glycoproteinligand foruden antistoffer mod epitelceller markører 3. For at styrke enheden performanceMance en nanopartikel blev påført bestående af halloysite nanorør, aluminosilikat nanopartikel høstet af ler 4. De E-selectin molekyler tilvejebringer et middel til at fange hurtig bevægelse CTC, der pumpes gennem anordningen, udlån en fordel i forhold til alternative mikrofluide anordninger, hvori længere behandlingstider er nødvendige for at målceller tilstrækkelig tid til at interagere med en overflade. De antistoffer mod epitelceller mål giver CTC-specificitet til enheden, samt give en let justerbar parameter at tune isolation. Endelig halloysit nanorør overtrækket giver betydeligt forøget isolation i forhold til andre teknikker, som bidrager til at indfange bevæger sig hurtigt celler, hvilket giver forøget overfladeareal til proteinadsorption, og frastødende kontaminerende leukocytter 3,4. Denne indretning er fremstillet ved en simpel teknik under anvendelse off-the-shelf materialer, og er blevet anvendt til at indfange cancerceller fra blodet af metastatiskkræftpatienter. Indfangede celler opretholdt i op til 15 dage i kultur efter isolering, og disse prøver består typisk af> 50% levedygtige primære cancerceller fra hver patient. Denne indretning er blevet anvendt til at indfange levedygtige CTC både fortyndet helblod og buffy coat prøver. I sidste ende, præsenterer vi en teknik med funktionalitet i et klinisk indstilling til at udvikle personlige behandlinger mod kræft.
Protocol
Følgende protokol til fremstilling af en enkelt mikrorør enhed.
1. Fremstillinq af halloysit nanorør opløsning
- Sonikatet (10-13 W (rms)) 250 ul halloysit nanorør opløsning (6,6 vægt-% i vand) 30 sek. Afkølede opløsning med koldt vand og gentagelse sonikering gang. Cool igen.
- Trække sonikerede opløsning ind i en sprøjte, vedhæfte et 0,45 um sprøjtefilter og filtreres opløsningen til rent mikrofugerør. Vortex løsningen lejlighedsvis at opretholde homogenitet.
2. Coating af mikrorør indre overflade med halloysite nanorør
- Få 50 cm lang sektion af Micro-Renathane microtubing (300 um indvendig diameter, 35,3 ul indre volumen). Skåret ene ende af mikrorør ved en diagonal og indsætte et lille IDEX adapter stykke. Indsætte nålen i en 3/10 cc 29g sprøjte ind i den anden ende af mikrorør.
- For at rengøre mikrorør, skal du placere den åbne ende af mikrorør (endenmed adapteren) i 70% ethanol og trækning ~ 50 pi ethanol i sprøjten for at fylde mikrorør.
- Skyl ethanol ud af mikrorør ved at trække en generøs volumen destilleret vand ind i sprøjten.
- Frigør sprøjten fra mikrorør, tømme sprøjten, og derefter vedhæfte til mikrorør.
- Fremstilling af en opløsning af 0,02% vægt / volumen poly-L lysin i vand. Trække 50 uL i mikrorør og tillade at sidde i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Trække 100 uL filtreret nanorør opløsning i mikrorør og tillade at inkubere i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Tegn 100 gl vand gennem mikrorør at skylle ud nanorør løsningen. Tillad belagt mikrorør at sidde, fyldt med vand, natten over ved stuetemperatur.
3. Fremstillinq af mikrorør til celleisolering
- Fremstilling af en opløsning af 10 ug / ml protein G i 1X Dulbeccos phosphatpufrede saltopløsning (PBS, pH 7,0 - 7,2). Tegn 50 pi PBS gennem mikrorør og derefter trække 50 piprotein-G-opløsningen og tillade at inkubere i 1,5 timer ved stuetemperatur.
- Fremstilling af en opløsning indeholdende 5 ug / ml E-selektin-IgG og 50 ug / ml antistof (anti-EpCAM for de fleste cancerceller prøver, anti-PSMA for prostatacancer prøver) i PBS. Trække 50 pi af E-selectin og antistof opløsning i mikrorør og tillade at inkubere i 2 timer ved stuetemperatur.
- Uspecifik cellulær adhæsion er blokeret med 5% mælkeprotein. Fremstilling af en opløsning af 5% (w / v) mælkeprotein i PBS. Trække 50 uL mælkeprotein opløsning i mikrorør og tillade at inkubere i 1 time ved stuetemperatur.
- Trække 50 pi PBS i rør og henstår ved stuetemperatur, indtil blod eller buffy coat prøver er klar til behandling.
- 10 min før anvendelse af mikrorør til isolering, trækker 50 pi PBS, som er blevet mættet med Ca2 + ("PBS +") til at aktivere selectinmolekyler.
4. Forberedelse af prøver til celleisolering
- Tegn eller få 10 ml blod fra patienten i hepariniseretrør.
- 10 ml Ficoll-Paque lymfocyt isolation opløsning i 50 ml centrifugerør. Forsigtigt lag 10 ml helblod oven på Ficoll ikke at blande blod og Ficoll.
- Der centrifugeres ved 2000 x g i 15 minutter ved 4 ° C med en minimal deceleration.
- Fjerne buffy coat-laget og anbringes i nye rør.
- Vask buffy coat med PBS (centrifuge på 230x g i 10 min, supernatanten).
- Forsigtigt resuspender cellerne med 1 ml RBC-puffer og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur for at lysere erythrocytter.
- Tilsæt 10 ml PBS, blandes forsigtigt, og der centrifugeres ved 230x g i 10 min. Supernatanten kasseres, og forsigtigt pellet resuspenderes i 3-4 ml PBS +.
5. Celleisolering
- Vedhæfte den ene ende af den funktionaliserede mikrorør til en 5 ml sprøjte med IDEX adaptere.
- Sæt sprøjten på en sprøjtepumpe.
- Nedsænkes den åbne ende af den funktionaliserede mikrorør i cellen Suspension.
- Forarbejde cellesuspensionen gennem mikrorør ved 1 til 4 ml / time.
- Overfører den åbne ende af mikrorør til et rør indeholdende PBS + og trække 300 pi PBS + i sprøjten ved 0,016 ml / min for at fjerne ubundet og løst bundne celler fra mikrorør.
- Anbring den åbne ende af mikrorør i et rent rør. Fjern injektionssprøjten fra mikrorør og vedlægge en sprøjte udfyldt med Accutase. Forsigtigt perfundere nok Accutase i mikrorør at fylde (~ 50 uL) og tillade at inkubere ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Vedhæfte en sprøjte forfyldt med 1 ml vækstmedium (79% RPMI, 20% FBS, 1% penicillin streptomycin) og perfundere i mikrorør, opsamling spildevand i vævskultur behandlet brøndsplade.
- Dyrkning af celler ved 37 ° C og 5% CO2 under fugtige betingelser.
6. Repræsentative resultater
Målet med denne teknik er at isolere levedygtige cancerceller fra blodet hos cancerpatienter. Adskillige metoder findes at identificere cancerceller i kultur, en nødvendig kontrol af indretningen succes. Vi har valgt at farve celler i kultur med antistoffer mod epitele dele, såsom EpCAM (epithelial cellulært adhæsionsmolekyle) eller PSMA (prostataspecifikt membran-antigen), foruden DAPI at identificere intakt cellekerner (fig. 2 og 3). Antallet af cancerceller indfanget ved hjælp af denne teknik er nødvendigvis en funktion af antallet af CTCs i udgangsblandingen prøven, og patient-variabilitet kan være høj. I behandlingen prøver fra patienter diagnosticeret med stadie IV kræft, rutinemæssigt vi fanger mellem 100 og 500 kræftceller pr rør af blod, ved renhedsgrader> 50%. Umiddelbart efter isolering, kan et større antal af kontaminerende leukocytter være til stede. Men disse tal vil blive udtømt efter inkubation i dyrkningsmedium i op til 5 dage.
Figur 2. Repræsentative data fra CTC isolation fra blodprøver taget fra en patient med brystcancer og en lungecancerpatient. Antallet af levedygtige celler positivt identificeret som CTC baseret på EpCAM farvning er repræsenteret ved de udfyldte søjler og vedrører den venstre ordinat og procentdelen af celler, der blev identificeret som CTC sammenlignet med det samlede antal af indfangede celler er repræsenteret ved de åbne blokke og målt på den højre ordinat. Resultaterne efter fem dage i kultur. 
Figur 3. Repræsentative mikrografer fra separate donorer (A og B) af CTC i kultur 5 dage senere til isolatipå fra en cancerpatient blodprøve. Cellerne blev fluorescens farvet for EpCAM med AlexaFluor 488 (grøn) og 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til at visualisere kernen (blå).
Discussion
Det er ofte tilfældet, at de tidlige trin i opdagelsen af nye kræftmedicin udnytte kræft cellelinjer, der bærer tvivlsom lighed med primære kræftceller alligevel forblive i brug på grund af deres brugervenlighed i laboratoriet. Forskning i udviklingen af nye kræftbehandlingsformer ville blive fremskyndet, hvis primære humane kræftceller blev udnyttet tidligt i romanen forskning. CTC er lettest tilgængelige type cancercelle, på grund af deres tilstedeværelse i blod og den lethed, hvormed en standard blodprøve. Desuden repræsenterer cirkulerende tumorceller et nødvendigt skridt i processen med metastaser 5,6, så deres relevans for sygdommen og værktøj til at målrette nye lægemidler er klar. Isolering af CTC fra blod in vitro kompliceres af deres lave koncentrationer: i størrelsesordenen én million leukocytter eller en per milliard erythrocytter 7. Størstedelen af de nuværende fremgangsmåder til påvisning CTC i blod, herunder den eneste FDA-godkendte teknik Cell Search (Veridex), skade eller ødelægge celler i afsløring processen, udelukker anvendelse ud over tælling. Den ovenfor beskrevne metode går ikke på kompromis cellernes levedygtighed og dermed åbner døren for fremtidig klinisk forskning i kræft. Da inddrivelse af intakte celler er målet med denne teknik, er det bydende nødvendigt, at celler skal håndteres med forsigtighed, især i blodseparering trin.
Der er en række justerbare parametre i systemet, der kan ændres for at opnå forbedret udbytte afhængigt kritiske egenskaber såsom cancer type. I de ovenfor beskrevne trin, havde vi valgt at bruge EpCAM som CTC-specifikt antistof for alle cancertyper, undtagen når behandlingen prostatacancer prøver, hvor anti-PSMA blev anvendt. Yderligere substitutioner af cancer-specifikke antistoffer bestemt kan anvendes til at forbedre ydeevnen for individuelle patienter. Endvidere kan selectin og antistof-koncentrationer ændres for at forbedre indfangning 8.
"> Et væsentligt træk ved anordningen er inkorporering af E-selectin-molekyler på overfladen. E-selectin udtrykkes normalt på den luminale overflade af endotelceller og fungerer til at rekruttere hurtige leukocytter til områder med inflammation. Flydende leukocytter binder transient at selectin molekyler, hvilket resulterer i en langsommere, rullende adfærd, der letter langsommere og stærkere binding af cellen til endotelet, som integriner. Overbevisende eksperimentelle beviser, der gør sådan, at CTC kan ekstravasere ved en lignende mekanisme 9,10. Optagelsen af selectin også kan enheden drives ved større strømningshastigheder, hastigheder, som ellers ville forhindre celler i at binde til antistoffer 11. Således vores enhed fysiologisk efterligner en venulen til biomimetically indfange strømmer CTC uden at påføre cellulær skade.Forbedret enhedens ydeevne kan tilskrives tilsætning af halloysit nanorør overtrækket til den luminale overfladeaf anordningen. Tidligere undersøgelser har vist, at der er tre væsentlige bestanddele af nanorør coating, der tillader forbedret funktionalitet. Første nanorør coatingen tilvejebringer forøget overfladeareal, hvilket tillader større protein aflejring på overfladen 4. Sekund under udførelsen atomic force-mikroskopi på nanorør coatingen har vi bestemt, at individuelle nanorør rager frem fra overfladen ind i strømmen. Dette tillader selectin molekyler, der skal præsenteres så meget som en mikron over overfladen, således at celler kan indfanges og rekrutteres til overfladen tidligere i deres bane gennem røret 4. Endelig halloysit nanorør coatingen er i stand til at forhindre leukocytadhæsion og spredning på overfladen, hvilket muliggør et reduceret antal leukocytter taget sammen med CTC og dermed større efterfølgende CTC renheder 3.
Disclosures
MRK er en videnskabelig rådgiver for CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).
Acknowledgments
Det beskrevne arbejde blev støttet af Cornell Center på mikromiljø & Metastase gennem Award nummer U54CA143876 fra National Cancer Institute. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Cancer Institute og National Institutes of Health. Dette arbejde blev desuden finansieret delvist af en National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 um ID tubing | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health Science | 1507L | |
| 5mL syringe for pump | BD Biosciences | 309603 | |
| Connector small to large tubing | IDEX Health Science | P-770 | |
| Connector large tubing to syringe | IDEX Health Science | F-120 and P-659 | |
| Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 | |
| Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 | |
| PSMA Antibody (GCP-04) | Abcam | ab66911 | |
| 96 well plates (Microtest 96) | BD Biosciences | 35-3072 | |
| Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad | 216005508 | |
| Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 | |
| rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES | |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |
References
- Allard, W. J. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Hughes, A. D., King, M. R. Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).
- Hughes, A. D. Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).
- Hughes, A. D., King, M. R. Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells. Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).
- Al-Mehdi, A. B. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat. Med. 6, 100-102 (2000).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: Building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).
- Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).
- Geng, Y., Marshall, J., King, M. Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation. Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 Forthcoming.
- Stott, S. L. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).
