Summary
Células tumorais circulantes são isolados a partir do sangue de pacientes com cancro sem causar danos celulares. Isolamento de células tumorais é realizada usando uma superfície bimolecular da E-selectina para além de anticorpos contra marcadores epiteliais. Um revestimento de nanotubo especificamente promove a adesão de células cancerosas, resultando em purezas de captura elevadas.
Abstract
Células tumorais circulantes (CTC) são células que divulgam a partir de um tumor primário em todo o sistema circulatório e que em última instância pode formar tumores secundários em locais distantes. CTC contagem pode ser utilizado para seguir a progressão da doença com base na correlação entre a concentração de CTC no sangue e gravidade da doença 1. Como uma ferramenta de tratamento, CTC poderia ser estudado em laboratório para desenvolver terapias personalizadas. Para este fim, o isolamento CTC deve causar nenhum dano celular, e contaminação por outros tipos de células, em particular de leucócitos, devem ser evitados tanto quanto possível 2. Muitas das técnicas atuais, incluindo o dispositivo aprovado pela FDA único para a enumeração CTC, CTC destruir como parte do processo de isolamento (para mais informações, consulte Ref. 2). Um dispositivo micro para capturar CTC viável é descrito, constituído por uma superfície funcionalizada com E-selectina glicoproteína além de anticorpos contra marcadores epiteliais 3. Para melhorar desempenho do dispositivonho um revestimento de nanopartículas foi aplicado consistindo de nanotubos haloisite, um aluminossilicato de nanopartículas colhidas a partir de argila 4. As moléculas de E-selectina fornecer um meio para captar rápido CTC movendo que são bombeados através do dispositivo, dando uma vantagem sobre alternativos dispositivos microfluídicos em que vezes mais processamento são necessárias para fornecer células alvo com o tempo suficiente para interagir com uma superfície. Os anticorpos para alvos epiteliais fornecer CTC-especificidade para o dispositivo, bem como proporcionar um parâmetro prontamente ajustável para sintonizar o isolamento. Finalmente, o revestimento nanotubo haloisite permite o isolamento significativamente melhorada em comparação com outras técnicas, ajudando a captura de forma rápida células que se deslocam, proporcionando maior área de superfície para adsorção de proteínas, e repelindo leucócitos contaminantes 3,4. Este dispositivo é produzido por uma técnica simples usando de prateleira de materiais, e tem sido utilizado com sucesso para capturar as células cancerosas do sangue de metastáticopacientes com câncer. Células capturadas são mantidos durante até 15 dias em cultura após isolamento, e estas amostras consistem tipicamente de> 50% viáveis células cancerosas primárias a partir de cada paciente. Este dispositivo tem sido utilizado para capturar CTC viável tanto sangue diluído todo e amostras do buffy coat. Por fim, apresentamos uma técnica com a funcionalidade em uma clínica para desenvolver terapias contra o câncer personalizados.
Protocol
O protocolo seguinte é para a produção de um dispositivo de microtubo único.
1. Preparação da solução de Nanotubos de haloisita
- Sonicado (10-13 W (rms)) 250 uL solução nanotubo haloisite (6,6% em peso em água) 30 seg. Solução legal com água fria e repita uma vez sonicação. Esfriar novamente.
- Desenhar solução sonicada para uma seringa, anexar um filtro de seringa de 0,45 uM, e solução de filtro para dentro do tubo de microcentrífuga limpo. Solução a vórtice ocasionalmente para manter a homogeneidade.
2. Revestimento de superfície Microtube interno com nanotubos de haloisita
- Obter 50 cm longa seção de Micro-Renathane microtubing (300 mM de diâmetro interior, 35,3 uL de volume interno). Corte uma extremidade do microtubo de uma diagonal e inserir um pedaço pequeno adaptador IDEX. Inserir a agulha de uma seringa 3/10 cc 29G na outra extremidade do microtubo.
- Para limpar o microtubo, colocar a extremidade aberta do microtubo (a extremidadecom o adaptador) em etanol 70% e draw ~ 50 uL de etanol para a seringa para encher microtubo.
- Lave o etanol a partir do microtubo desenhando um volume generoso de água destilada para a seringa.
- Retire a seringa do microtubo, esvaziar a seringa e volte para o microtubo.
- Prepara-se uma solução de 0,02% w / v de poli-L lisina em água. Desenhar 50 uL para o microtubo e permitir a sentar-se durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
- Desenhar 100 uL solução nanotubo e filtrada para o microtubo e deixa-se incubar durante 3 min a RT.
- Desenhe 100 uL de água através do microtubo para lavar a solução de nanotubos. Permitir microtubo revestido para sentar, cheio de água, durante a noite à RT.
3. Preparação de microtubos para isolamento de células
- Prepara-se uma solução de 10 mg / g de proteína mL em fosfato de Dulbecco 1X salino tamponado (PBS, pH 7,0 - 7,2). Desenhe 50 uL PBS através microtubo e desenhe 50 mL dea solução de proteína G-e deixa-se incubar durante 1,5 h à RT.
- Prepara-se uma solução contendo 5 ug / mL E-selectina-IgG e 50 anticorpo mcg / ml (anti-EpCAM para a maioria das amostras de cancro, anti-PSMA para amostras de cancro da próstata) em PBS. Desenhar 50 uL da E-selectina e solução de anticorpo para o microtubo e deixa-se incubar durante 2 horas à RT.
- Adesão celular não específica é bloqueado com proteína de leite de 5%. Prepara-se uma solução de 5% (w / v) de proteína de leite em PBS. Desenhar 50 uL solução de proteína do leite no microtubo e deixa-se incubar durante 1 hora à RT.
- Desenhe 50 uL de PBS em tubo e deixar à temperatura ambiente até amostras de sangue ou de buffy coat está pronto para processamento.
- 10 min antes de utilizar o microtubo para o isolamento, desenhar 50 uL de PBS que foi saturada com Ca 2 + ("PBS +") para activar as moléculas de selectina.
4. Preparação de amostras para o isolamento de células
- Desenhe ou obter 10 mL de sangue de paciente em heparinizadotubo.
- Colocam-se 10 mL de Ficoll-Paque solução de isolamento de linfócitos em 50 mL tubo de centrífuga. Suavemente camada de sangue 10 mL todo em cima de Ficoll de modo a não misturar o sangue e Ficoll.
- Centrifugar a 2000x g durante 15 min a 4 ° C com desaceleração mínima.
- Retire a camada de revestimento buffy e coloque em novo tubo.
- Buffy coat lavagem com PBS (centrifugue a 230x g durante 10 min, descartar o sobrenadante).
- Suavemente ressuspender as células com 1 mL de tampão de lise de RBC e incubar durante 10 min a RT para lisar os eritrócitos.
- Adicionar 10 ml de PBS, misturar suavemente, e centrifugue a 230x g durante 10 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento suavemente em 3 a 4 ml de PBS +.
5. Isolamento das células
- Anexar uma extremidade do microtubo funcionalizado a uma seringa de 5 ml usando adaptadores IDEX.
- Inserir a seringa para uma bomba de seringa.
- Submergir a extremidade aberta do microtubo funcionalizado para dentro da célula suspension.
- Processar a suspensão de células através do microtubo de 1 a 4 mL / h.
- Transferir a extremidade aberta do microtubo a um tubo contendo PBS + e desenhar 300 + PBS uL em seringa a 0,016 ml / min para remover as células não ligado e fracamente ligados do microtubo.
- Coloque a extremidade aberta do microtubo para um tubo limpo. Desconecte a seringa do microtubo e anexar uma seringa pré-cheia com Accutase. Suavemente perfundir Accutase suficiente para o microtubo para preencher (~ uL 50) e permitir que a incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
- Anexar um seringa pré-carregada com 1 mL de meio de crescimento (79% de RPMI, FBS 20%, 1% de penicilina estreptomicina) e perfundir em microtubo, recolha de efluente em cultura de tecidos bem tratados placa.
- Células de cultura a 37 ° C e 5% de CO2 sob condições humidificado.
6. Os resultados representativos
O objectivo desta técnica consiste em isolar as células cancerosas viáveis a partir do sangue de pacientes com cancro. Existem vários métodos para identificar as células cancerosas em cultura; uma verificação necessária de sucesso dispositivo. Nós escolhemos para corar as células em cultura com anticorpos contra porções epiteliais, tais como EpCAM (molécula de adesão celular epitelial) ou PSMA (próstata antigénio de membrana específica), além de DAPI para identificar núcleos de células intactas (Fig. 2 e 3). O número de células cancerosas capturado usando esta técnica é necessariamente uma função do número de CTC na amostra de partida, e variabilidade paciente pode ser elevado. No processamento de amostras colhidas de pacientes diagnosticados com câncer em estágio IV, que rotineiramente capturar entre 100 e 500 células cancerosas por tubo de sangue, com pureza> 50%. Imediatamente após o isolamento, um maior número de leucócitos contaminantes podem estar presentes. No entanto, estes números será esgotada de incubação a seguir no meio de cultura para até 5 dias.
Figura 2. Dados representativos de isolamento CTC a partir de amostras de sangue colhido de uma paciente com câncer de mama e um paciente com câncer de pulmão. O número de células viáveis positivamente identificados como CTC com base na coloração de EpCAM é representada pelas barras sólidas e pertencem à ordenadas da esquerda e da percentagem de células que foram identificados como CTC em comparação com o número total de células capturadas é representada pelas barras abertas e medido na ordenada a direita. Os resultados são depois de cinco dias em cultura. 
Figura 3. Micrografias representativos de dadores separadas (A e B) de CTC em cultura de 5 dias subsequentes para isolatiem a partir de uma amostra de sangue do cancro do paciente. As células foram coradas com fluorescência para EpCAM com AlexaFluor 488 (verde) e 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar o núcleo (azul).
Discussion
É frequentemente o caso em que os primeiros passos na descoberta de novas terapêuticas do cancro utilizam linhas de células cancerosas, que se assemelham questionável para as células cancerosas primárias ainda continuar a ser utilizado, devido à sua facilidade de utilização no laboratório. A investigação sobre o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer poderia ser acelerada se as células cancerosas humanas primárias foram utilizados no início da pesquisa romance. CTC são o tipo mais facilmente acessível de célula cancerosa, devido à sua presença no sangue e da facilidade de uma colheita de sangue padrão. Além disso, células tumorais circulantes representam um passo necessário no processo de metástase 5,6, pelo que a sua relevância para a doença e utilidade para o direcionamento de novas drogas é clara. Isolamento de CTC a partir de sangue in vitro é complicada pelas suas baixas concentrações: da ordem de um por milhão leucócitos ou a uma por bilhão eritrócitos 7. A maioria dos métodos actuais para a detecção de CTC no sangue, incluindo a célula única técnica aprovado pela FDA Pesquisa (Veridex), danos ou destruir as células no processo de detecção, impedindo o uso além de enumeração. O método descrito acima não comprometer a viabilidade celular e, assim, abre a porta para a investigação clínica sobre o cancro futuro. Como a recuperação de células intactas é o objetivo desta técnica, é imperativo que as células ser manuseados com cuidado, especialmente durante as etapas de separação de sangue.
Há um certo número de parâmetros ajustáveis no presente sistema que possa ser alterada para atingir rendimento melhorado, dependendo das características críticas, tais como o tipo de cancro. Nos passos acima descritos, que tinha escolhido para usar EpCAM como um anticorpo CTC-específico para todos os tipos de cancro, excepto quando o processamento de amostras de cancro da próstata, em que anti-PSMA foi usado. Outras substituições de cancro com anticorpos monoclonais específicos pode certamente ser usado para melhorar o desempenho para pacientes individuais. Além disso, as concentrações de selectina e anticorpo pode ser alterada para melhorar a captação 8.
"> Uma característica essencial do dispositivo é a incorporação de E-selectina moléculas sobre a superfície. E-selectina é normalmente expressa na superfície luminal das células endoteliais e de função para recrutar rápidas leucócitos que se deslocam para locais de inflamação. Leucócitos Flowing ligar transitoriamente para moléculas de selectina, resultando em um ritmo mais lento, comportamento circulante que facilita a ligação mais lento e mais forte da célula para o endotélio, por integrinas. evidência experimental convincente existe que faz o caso que CTC pode extravasamento por um mecanismo semelhante 9,10. A inclusão de selectina também permite que o dispositivo a ser operado a maiores taxas de fluxo, as taxas de que, caso contrário evitar que as células de se ligarem a anticorpos 11. Assim nosso dispositivo fisiologicamente imita uma vénula para capturar biomimetically fluindo CTC sem causar dano celular.O desempenho do dispositivo melhorado pode ser atribuída à adição do revestimento nanotubo haloisite para a superfície luminaldo dispositivo. Estudos anteriores demonstraram que existem três principais componentes do revestimento nanotubo que permite a funcionalidade melhorada. Em primeiro lugar, o revestimento de nanotubos proporciona uma área de superfície aumentada, permitindo maior deposição de proteína sobre a superfície 4. Em segundo lugar, na realização de microscopia de força atómica no revestimento nanotubo determinámos que nanotubos individuais sobressair da superfície para o fluxo. Isto permite que as moléculas de selectina a ser apresentada tanto como um micron acima da superfície de modo que as células podem ser capturados e recrutados para a superfície anterior no seu percurso através do tubo 4. Finalmente, o revestimento nanotubo haloisite é capaz de prevenir a adesão de leucócitos e espalhamento à superfície, permitindo a um número reduzido de leucócitos capturados juntamente com o CTC e, assim, uma maior purezas subsequentes CTC 3.
Disclosures
MRK é consultor científico de CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).
Acknowledgments
O trabalho descrito foi apoiado pelo Centro de Cornell sobre o microambiente e metástases através do número Prêmio U54CA143876 do National Cancer Institute. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Câncer ou o National Institutes of Health. Este trabalho foi ainda financiado em parte por um National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 um ID tubing | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health Science | 1507L | |
| 5mL syringe for pump | BD Biosciences | 309603 | |
| Connector small to large tubing | IDEX Health Science | P-770 | |
| Connector large tubing to syringe | IDEX Health Science | F-120 and P-659 | |
| Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 | |
| Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 | |
| PSMA Antibody (GCP-04) | Abcam | ab66911 | |
| 96 well plates (Microtest 96) | BD Biosciences | 35-3072 | |
| Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad | 216005508 | |
| Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 | |
| rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES | |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |
References
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