Summary
Circulerende tumorcellen worden geïsoleerd uit het bloed van patiënten met kanker kan brengen zonder dat cellulaire schade. Isolatie van tumorcellen vindt plaats via een bimoleculaire oppervlak van E-selectine naast antilichamen tegen epitheliale markers. Een nanobuis coating bevordert specifiek kankercellen hechting resulteert in een hoge capture zuiverheden.
Abstract
Circulerende tumorcellen (CTC) zijn cellen die te verspreiden van een primaire tumor in de bloedsomloop en dat kan uiteindelijk secundaire tumoren vormen op verre locaties. CTC telling kunnen worden gebruikt om progressie basis van de correlatie tussen CTC concentratie in het bloed en ernst van de ziekte 1 volgt. Als een behandeling tool, kan CTC worden bestudeerd in het laboratorium om gepersonaliseerde therapieën te ontwikkelen. Daartoe moet de isolatie CTC geen cellulaire schade, en vervuiling door andere cellen, met name leukocyten veroorzaken, worden zo veel mogelijk twee vermeden. Veel van de huidige technieken, met inbegrip van de enige door de FDA goedgekeurde apparaat voor CTC opsomming, te vernietigen CTC als onderdeel van de isolatie proces (zie voor meer informatie Ref. 2). Een microfluïdische apparaat levensvatbare CTC vangen beschreven, bestaande uit een oppervlak gefunctionaliseerd met E-selectine glycoproteïne naast antilichamen tegen epitheliale markers 3. Om het apparaat prestaties te verbeterenMance een nanodeeltje coating werd aangebracht bestaande uit halloysiet nanobuisjes, een aluminosilicaat nanodeeltjes geoogst van klei 4. De E-selectine moleculen vormen een middel om snel bewegende CTC die worden gepompt door het apparaat te lenen een voordeel ten opzichte van alternatieve microfluïdische apparaten waarin langere doorlooptijden die nodig zijn om target cellen te voorzien van voldoende tijd om te communiceren met een oppervlakte vast te leggen. De antilichamen epitheliale doelen voorzien CTC specificiteit van de inrichting alsmede een gemakkelijk instelbare parameter aan isolatie af te stemmen. Ten slotte is de halloysiet nanobuis coating voor sterk verbeterde isolatie ten opzichte van andere technieken door te helpen bij snel bewegende cellen vast te leggen, het verstrekken van grotere oppervlak voor eiwit adsorptie, en afstoten besmetten leukocyten 3,4. Dit apparaat wordt geproduceerd door een eenvoudige techniek met behulp van kant-en-klare materialen en is met succes gebruikt om kankercellen te vangen uit het bloed van uitgezaaidekankerpatiënten. Gevangen cellen worden gehandhaafd tot 15 dagen in cultuur na isolatie, en deze monsters bestaan meestal uit van> 50% levensvatbare primaire kanker cellen van elke patiënt. Dit apparaat is gebruikt om levensvatbare CTC vast te leggen van zowel verdund volbloed en buffycoat monsters. Uiteindelijk presenteren we een techniek met functionaliteit in een klinische setting om gepersonaliseerde kanker therapieën te ontwikkelen.
Protocol
Het volgende protocol is voor de productie van een microbuisjes apparaat.
1. Voorbereiding van halloysiet Nanotube Solution
- Bewerk met ultrasone trillingen (10-13 W (rms)) 250 il halloysiet nanobuis oplossing (6,6 gew% in water) 30 sec. Cool oplossing met koud water en herhaal sonicatie een keer. Laat weer afkoelen.
- Teken gesoniceerde oplossing in een spuit, sluit een 0,45 pm spuitfilter, en filter oplossing in schone microfugebuis. Vortex de oplossing af tot homogeniteit te handhaven.
2. Coating van microbuisjes de binnenkant met halloysiet nanobuisjes
- Zorg voor 50 cm lange sectie van micro-Renathane microtubing (300 micrometer inwendige diameter, 35,3 pl innerlijke volume). Snijd het ene uiteinde van de microbuisjes op een diagonaal en in te voegen in een klein IDEX adapter stuk. Steek de naald van een 3/10 cc 29g spuit in de andere uiteinde van de microbuisjes.
- Om de microbuisjes schoon te maken, plaatst u het open uiteinde van microbuisjes (het eindemet de adapter) in 70% ethanol en gelijkspel ~ 50 pl ethanol in de spuit om microbuisjes te vullen.
- Spoel de ethanol uit de microbuisjes door het tekenen van een royale hoeveelheid gedestilleerd water in de spuit.
- Maak de spuit van de microbuisjes, het legen van de spuit, en dan vast aan de microbuisjes.
- Een oplossing van 0,02% w / v poly-L lysine in water. Trek 50 pL de microbuisjes en laat hem 5 min bij kamertemperatuur (RT).
- Teken 100 ul gefilterd nanobuis oplossing in de microbuisjes en laat incubeer gedurende 3 minuten bij RT.
- Teken 100 ul water door de microbuisjes te spoelen de nanobuis oplossing. Laat gecoat microbuisjes te zitten, gevuld met water, 's nachts bij kamertemperatuur.
3. Voorbereiding van microbuizen voor celisolatie
- Een oplossing van 10 pg / ml proteïne G in fosfaat 1X Dulbecco's gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,0 - 7,2). Teken 50 pL PBS door microbuisjes en teken dan 50 pihet eiwit-G oplossing en laat gedurende 1,5 uur incuberen bij kamertemperatuur.
- Bereid een oplossing van 5 ug / ml E-selectine-IgG en 50 ug / ml antilichaam (anti-EpCAM meeste carcinoom, anti-PSMA voor prostaatkanker monsters) in PBS. Trek 50 ul van de E-selectine antilichamen oplossing in de microbuisjes en laat gedurende 2 uur incuberen bij kamertemperatuur.
- Specifieke cellulaire hechting geblokkeerd met 5% melkeiwit. Een oplossing van 5% (w / v) melkeiwit in PBS. Trek 50 pL melkeiwit oplossing in de microbuisjes en laat gedurende 1 uur incuberen bij kamertemperatuur.
- Teken 50 ul PBS in de buis en laat bij kamertemperatuur tot bloed-of buffy coat monsters zijn klaar voor verwerking.
- 10 minuten voorafgaand aan het gebruik van de microbuisjes voor isolatie, trekken 50 ul PBS die is verzadigd met Ca 2 + ("PBS +") om de selectine moleculen te activeren.
4. Bereiding van monsters celisolatie
- Teken of 10 ml bloed te verkrijgen van de patiënt in gehepariniseerdebuis.
- Breng 10 ml Ficoll-Paque lymfocyten isolatie-oplossing in 50 ml centrifugebuis. Voorzichtig laag 10 ml totaal bloed op Ficoll zodat geen bloed en Ficoll mengen.
- Centrifugeer bij 2000x g gedurende 15 min bij 4 ° C met minimale vertraging.
- Verwijder de buffy coat laag en plaats in de nieuwe buis.
- Was de buffy coat met PBS (centrifugeer bij 230x g gedurende 10 min, schenk de bovenstaande).
- Voorzichtig mengen cellen met 1 ml RBC lysisbuffer en geïncubeerd 10 min bij kamertemperatuur aan erythrocyten lyseren.
- Voeg 10 ml PBS, meng voorzichtig en centrifugeer bij 230x g gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant en voorzichtig de pellet opnieuw in suspensie in 3 tot 4 ml PBS +.
5. Celisolatie
- Het ene uiteinde van het gefunctionaliseerde microbuisjes een 5 ml gebruikt IDEX adapters.
- Plaats de spuit op een injectiepomp.
- Dompel het open uiteinde van de gefunctionaliseerde microbuisjes in de cel suspension.
- Werkwijze de celsuspensie door microbuisjes op 1 tot 4 mL / uur.
- Breng het open uiteinde van de microbuisjes een buis met PBS + en stelt 300 ul PBS + in de injectiespuit bij 0.016 ml / min om ongebonden en losjes cellen uit de microbuisjes.
- De open uiteinde van de microbuisjes in een schone buis. Haal de spuit uit de microbuisjes en bevestig een spuit voorgevuld met Accutase. Voorzichtig doorstroomd voldoende Accutase in de microbuisjes vullen (~ 50 pi) en laat bij kamertemperatuur incuberen gedurende 10 minuten.
- Maak een spuit voorgevuld met 1 ml van de groei media (79% RPMI, 20% FBS, 1% penicilline streptomycine) en perfuseren in microbuisjes, het verzamelen van afvalwater in weefselkweek goed behandeld plaat.
- Kweekcellen bij 37 ° C en 5% CO2 onder vochtige omstandigheden.
6. Representatieve resultaten
Het doel van deze techniek is levensvatbare kankercellen isoleren uit het bloed van patiënten met kanker. Er bestaan verschillende manieren om kankercellen te herkennen in cultuur; een noodzakelijke controle van het apparaat succes. We hebben gekozen cellen in kweek vlek met antilichamen tegen epitheliale groepen zoals EpCAM (epitheliale cellulaire adhesie molecule) of PSMA (prostaat-specifiek antigen membraan) naast DAPI intacte celkernen (Fig. 2 en 3) bepalen. Het aantal kankercellen opgenomen met deze techniek noodzakelijk een functie van het aantal CTC in de uitgangsmonster en variabiliteit kan hoog zijn. Bij de verwerking monsters van patiënten met kanker fase IV wij routinematig vangen tussen 100 en 500 kankercellen per buis bloed op zuiverheid> 50%. Onmiddellijk na isolatie, kan een groter aantal van besmetting van leukocyten aanwezig zijn. Maar deze aantallen wordt uitgeput volgende incubatie in kweekmedium voor maximaal 5 dagen.
Figuur 2. Vertegenwoordiger gegevens van CTC isolatie van bloedmonsters van een borstkanker patiënt en een longkanker patiënt. Het aantal levensvatbare cellen geïdentificeerd als CTC op EpCAM kleuring wordt vertegenwoordigd door de vaste staven en hebben betrekking op de linker coördineren en het percentage cellen werden geïdentificeerd als CTC vergelijking met het totale aantal cellen opgenomen wordt vertegenwoordigd door de open staven en gemeten rechts ordinaat. De resultaten worden vijf dagen in kweek. 
Figuur 3. Representatieve microfoto van verschillende donoren (A en B) van CTC in cultuur 5 dagen na het isolativerlengde van een kankerpatiënt bloedmonster. Cellen werden fluorescerend gekleurd EpCAM met AlexaFluor 488 (groen) en 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) van de kern (blauw) zichtbaar.
Discussion
Het is vaak het geval dat de eerste stappen in de ontdekking van nieuwe kanker medicijnen gebruik maken van cellijnen, die de vraag gelijkenis met primaire kankercellen te dragen nog in gebruik blijven als gevolg van hun gebruiksgemak in het laboratorium. Onderzoek naar de ontwikkeling van nieuwe kankertherapieën zou worden versneld als de primaire menselijke kankercellen werden in het begin van nieuw onderzoek gebruikt. CTC de meest toegankelijke type kanker cellen, vanwege hun aanwezigheid in het bloed en het gemak van een standaard bloedafname. Daarnaast circulerende tumorcellen vormen een noodzakelijke stap in het proces van metastasering 5,6, zodat de relevantie ervan voor de ziekte en het nut voor het richten van nieuwe geneesmiddelen is duidelijk. Isolatie van CTC uit bloed in vitro wordt bemoeilijkt door de lage concentraties: in de orde van een per miljoen leukocyten of een per miljard erythrocyten 7. De meerderheid van de huidige methoden voor het opsporen van CTC in het bloed, met inbegrip van de enige door de FDA goedgekeurde techniek Cell Zoeken (Veridex), beschadigen of vernietigen cellen in het detectie proces, zich verzet tegen het gebruik buiten opsomming. De hierboven beschreven methode niet ten koste gaat levensvatbaarheid van de cellen en dus opent de deur voor toekomstige klinische onderzoek naar kanker. Als het herstel van intacte cellen is het doel van deze techniek, is het noodzakelijk dat cellen met zorg worden behandeld, vooral tijdens het bloed gescheiden stappen.
Er zijn een aantal instelbare parameters in dit systeem kan worden aangepast aan verbeterde opbrengst afhankelijk essentiële kenmerken zoals kanker soort bereikt. In de hierboven beschreven stappen waren we gekozen EpCAM als een CTC specifiek antilichaam voor alle soorten kanker, behalve bij de verwerking prostaatkanker monsters, waarbij anti-PSMA gebruikt. Verdere substituties van kanker-specifieke antilichamen zeker worden gebruikt om de prestatie van individuele patiënten te verbeteren. Bovendien kan selectine en antilichaam concentraties worden gewijzigd om daaronder het afvangen 8 te verbeteren.
"> Een essentieel kenmerk van het apparaat is de integratie van E-selectine moleculen op het oppervlak. E-selectine wordt normaal gesproken uitgedrukt op de luminale oppervlak van endotheelcellen en functie om snel bewegende leukocyten aantrekken naar sites van de ontsteking. Flowing leukocyten binden tijdelijk aan selectine moleculen, resulterend in een tragere rollen gedrag langzamer sterkere binding van de cel aan het endotheel van integrinen vergemakkelijkt. overtuigend experimenteel bewijs dat doet het geval dat CTC kan extravasaat door een gelijkaardig mechanisme 9,10. het opnemen van selectine ook kan het apparaat voor gebruik op grotere debieten, de tarieven die anders zouden cellen te voorkomen dat de binding aan antilichamen 11. Dus ons apparaat bootst een fysiologisch venule om biomimetically vloeiende CTC vast te leggen zonder het toebrengen van cellulaire schade.Verbeterde werking van het apparaat kan worden toegeschreven aan de toevoeging van de halloysiet buisje coating op het oppervlak luminalevan de inrichting. Eerdere studies hebben aangetoond dat er drie belangrijke componenten van de nanobuis coating die zorgt voor een verbeterde functionaliteit. Ten eerste, de nanobuis coating zorgt voor grotere oppervlakte, waardoor meer eiwit afzetting op het oppervlak 4. Ten tweede, bij het uitvoeren van atomaire kracht microscopie op het nanobuisje coating hebben we vastgesteld dat individuele nanotubes boven het oppervlak uitsteken in de stroom. Hierdoor selectine moleculen worden gepresenteerd liefst een micron boven de grond, zodat cellen kunnen worden vastgelegd en aangetrokken naar het oppervlak eerder in hun baan door de buis 4. Ten slotte halloysiet buisje coating kan leukocytadhesie voorkomen en verspreiding op het oppervlak zodat een beperkt aantal leukocyten met de CTC opgevangen en dus meer latere CTC zuiverheden 3.
Disclosures
MRK is een wetenschappelijke adviseur van CellTraffix, Inc (Rochester, NY).
Acknowledgments
Het werk beschreven werd ondersteund door de Cornell Center op de micro-omgeving en metastasen door Award Aantal U54CA143876 van het National Cancer Institute. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Cancer Institute en de National Institutes of Health. Dit werk werd bovendien deels gefinancierd door een National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 um ID tubing | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health Science | 1507L | |
| 5mL syringe for pump | BD Biosciences | 309603 | |
| Connector small to large tubing | IDEX Health Science | P-770 | |
| Connector large tubing to syringe | IDEX Health Science | F-120 and P-659 | |
| Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 | |
| Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 | |
| PSMA Antibody (GCP-04) | Abcam | ab66911 | |
| 96 well plates (Microtest 96) | BD Biosciences | 35-3072 | |
| Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad | 216005508 | |
| Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 | |
| rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES | |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |
References
- Allard, W. J. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Hughes, A. D., King, M. R. Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).
- Hughes, A. D. Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).
- Hughes, A. D., King, M. R. Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells. Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).
- Al-Mehdi, A. B. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat. Med. 6, 100-102 (2000).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: Building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).
- Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).
- Geng, Y., Marshall, J., King, M. Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation. Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 Forthcoming.
- Stott, S. L. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).
