Summary
Sirkulerende kreftceller er isolert fra blodet av kreftpasienter uten å bli påført cellulær skade. Isolering av kreftceller gjøres ved hjelp av en bimolecular overflate av E-selektin i tillegg til antistoffer mot epiteliale markører. Et nanorør belegg fremmer spesielt kreft celle adhesjon resulterer i høye capture renhet.
Abstract
Sirkulerende kreftceller (CTC) er celler som formidler fra en primærtumor i hele sirkulasjonssystemet og som kan til slutt danne sekundære svulster i fjerne områder. CTC telling kan brukes til å følge sykdomsutviklingen basert på sammenhengen mellom CTC konsentrasjon i blodet og sykdommens alvorlighetsgrad en. Som en behandling verktøy, kunne CTC studeres i laboratoriet for å utvikle personlige behandlingsformer. For dette formål må CTC isolasjon forårsaker ingen cellulær skade, og kontaminering av andre celletyper, særlig leukocytter, må unngås så mye som mulig to. Mange av dagens teknikker, inkludert den eneste FDA-godkjente enhet for CTC oppregning, ødelegge CTC som en del av isolasjon prosessen (for mer informasjon se Ref. 2). En microfluidic enheten til fange levedyktig CTC er beskrevet, består av en overflate functionalized med E-selektin glykoprotein i tillegg til antistoffer mot epiteliale markører 3. For å styrke enheten prestaMance en nanopartikkel belegg ble brukt som består av halloysite nanorør, en aluminosilicate nanopartikkel høstet fra leire 4. De E-selektin molekyler gi et middel til å fange raske bevegelser CTC som er pumpet gjennom enheten, låne en fordel fremfor alternative microfluidic enheter hvori er lengre saksbehandlingstid nødvendig for å gi målceller med tilstrekkelig tid til å samhandle med en overflate. De antistoffer mot epitel mål gi CTC-spesifisitet til enheten, samt gi en lett justerbar parameter å stille isolasjon. Til slutt lar halloysite nanorør belegget betydelig forbedret isolasjon i forhold til andre teknikker ved å bidra til å fange raske celler, som gir økt areal for protein adsorpsjon, og avvise forurensende leukocytter 3,4. Denne enheten er produsert av en grei teknikk ved hjelp av off-the-hyllematerialer, og har blitt brukt til å fange kreftceller fra blodet av metastatiskkreftpasienter. Fangede celler opprettholdes i inntil 15 dager i kultur etter isolasjon, og disse prøvene består typisk av> 50% levedyktige primære kreftceller fra hver pasient. Denne enheten har blitt brukt til å fange levedyktig CTC fra både utvannet fullblod og Buffy Coat prøver. Til syvende og sist, presenterer vi en teknikk med funksjonalitet i en klinisk setting å utvikle personlige kreft terapier.
Protocol
Følgende protokoll er til produksjon av en enkelt microtube enhet.
1. Utarbeidelse av Halloysite Nanotube Solution
- Sonicate (10-13 W (RMS)) 250 mL halloysite nanorør løsning (6,6 wt% i vann) 30 sek. Cool løsning med kaldt vann og gjenta sonikator gang. Avkjøl igjen.
- Tegn sonicated løsning i en sprøyte, feste en 0,45 mikrometer sprøyte filter, og filter løsning i ren microfuge tube. Vortex løsningen innimellom for å opprettholde homogenitet.
2. Belegg av Microtube indre overflaten med halloysite nanorør
- Skaffe 50 cm lang del av Micro-Renathane microtubing (300 mikrometer indre diameter, 35,3 mL indre volum). Skjær den ene enden av microtube på en diagonal og sette inn en liten IDEX adapter stykke. Sett nålen på en 3/10 cc 29G sprøyte inn i den andre enden av microtube.
- For å rengjøre microtube, plasser den åpne enden av microtube (sluttenmed adapter) til 70% etanol og uavgjort ~ 50 mL etanol i sprøyten for å fylle microtube.
- Skyll etanol ut av microtube ved å tegne en sjenerøs mengde destillert vann i sprøyten.
- Løsne sprøyten fra microtube, tømme sprøyten, og deretter fest til microtube.
- Forbered en løsning på 0,02% w / v poly-L lysin i vann. Tegn 50 mL i microtube og la sitte i 5 min ved romtemperatur (RT).
- Tegn 100 mL filtrert nanorør løsning i microtube og la inkuber for 3 min ved RT.
- Tegn 100 mL vann gjennom microtube å skylle ut nanorør løsningen. Tillat belagt microtube å sitte, fylt med vann, overnatta på RT.
3. Utarbeidelse av mikrorør for celleisolasjon
- Forbered en løsning på 10 mikrogram / ml protein G i 1X Dulbecco sin fosfatbufret saltløsning (PBS, 7,0 pH - 7,2). Tegn 50 mL PBS gjennom microtube og deretter trekke 50 mL avprotein-G løsning og tillate å ruge på 1,5 timer på RT.
- Forbered en løsning som inneholder 5 mikrogram / ml E-selektin-IgG og 50 mikrogram / ml antistoff (anti-EpCAM for de fleste kreft prøver, anti-PSMA for prostatakreft prøver) i PBS. Tegn 50 mL av E-selektin og antistoff løsning i microtube og la inkuber for to timer på RT.
- Uspesifikke cellulær adhesjon er blokkert med 5% melkeprotein. Forbered en løsning på 5% (w / v) melkeprotein i PBS. Tegn 50 mL melk protein løsning i microtube og la inkuber for en time ved RT.
- Tegn 50 mL PBS i røret og la på RT til blod eller Buffy Coat prøver er klare for behandling.
- 10 min før du bruker microtube for isolasjon, trekke 50 mL PBS som har blitt mettet med Ca 2 + ("PBS +") for å aktivere selektin molekyler.
4. Klargjøring av prøver for celleisolasjon
- Tegn eller skaffe 10 ml blod fra pasienten i hepariniserttube.
- Plass 10 ml Ficoll-Paque lymfocyttisolasjonsmetoder løsning i 50 ml sentrifugerør. Forsiktig lag 10 ml fullblod oppå Ficoll ikke å blande blod og Ficoll.
- Sentrifuger ved 2000x g for 15 min ved 4 ° C med minimal retardasjon.
- Fjern Buffy Coat lag og plass i ny tube.
- Vask Buffy Coat med PBS (sentrifuger ved 230x g for 10 min, kast supernatanten).
- Forsiktig resuspender celler med 1 ml RBC buffer og inkuberes i 10 min ved RT å lysere erytrocytter.
- Tilsett 10 mL PBS, bland forsiktig og sentrifuger ved 230x g for 10 min. Kast supernatanten og forsiktig resuspender pelleten i 3-4 mL PBS +.
5. Celleisolasjon
- Fest den ene enden av functionalized microtube til en 5 ml sprøyte med IDEX adaptere.
- Sett sprøyten på en sprøytepumpe.
- Senk den åpne enden av functionalized microtube inn i cellen suspension.
- Behandle cellesuspensjon gjennom microtube på 1-4 ml / time.
- Overfør den åpne enden av microtube til et rør som inneholder PBS + og trekke 300 mL PBS + til sprøyten på 0.016 ml / min for å fjerne ubundet og løst bundet celler fra microtube.
- Plasser den åpne enden av microtube til et rent rør. Fjern sprøyta fra microtube og fest en sprøyte fylt med Accutase. Forsiktig perfuse nok Accutase i microtube å fylle (~ 50 mL) og la til inkuber ved RT i 10 min.
- Fest en sprøyte fylt med 1 ml vekstmedier (79% RPMI, 20% FBS, 1% penicillin streptomycin) og perfuse inn microtube, innsamling av avløpsvann inn i vev kultur behandlet bra plate.
- Kultur celler ved 37 ° C og 5% CO 2 under fuktet forhold.
6. Representative Resultater
Målet med denne teknikken er å isolere levedyktige kreftceller fra blodet til kreftpasienter. Flere metoder finnes for å identifisere kreftceller i kultur, en nødvendig bekreftelse av enheten suksess. Vi har valgt å farge celler i kultur med antistoffer mot epitel moieties som EpCAM (epiteliale mobil adhesjonsmolekyl) eller PSMA (prostata spesifikt membran antigen), i tillegg til DAPI å identifisere intakt cellekjerner (Fig. 2 og 3). Antallet kreftceller fanget ved hjelp av denne teknikken er nødvendigvis en funksjon av antall CTCs i startelleveren prøven, og pasienten variasjon kan være høy. I behandling av prøver tatt fra pasienter diagnostisert med stadium IV kreft, vi rutinemessig fange mellom 100 og 500 kreftceller per tube av blod, med renhet> 50%. Umiddelbart etter kan isolert sett større antall forurensende leukocytter være til stede. Men disse tallene vil bli tømt etter inkubasjon i kultur medium for opp til 5 dager.
Figur 2. Representative data fra CTC isolasjon fra blodprøver tatt fra en brystkreft pasient og en lunge kreft pasient. Antall levedyktige celler positivt identifisert som CTC basert på EpCAM farging er representert ved de solide barer og hører til venstre samordner og andelen av celler som ble identifisert som CTC forhold til det totale antallet fangede celler er representert ved de åpne barene og målt på høyre samordner. Resultatene etter fem dager i kultur. 
Figur 3. Representative mikrografer fra separate givere (A og B) i CTC i kultur 5 dager senere til isolatipå fra en kreftpasient blodprøve. Celler ble fluorescently farget for EpCAM med AlexaFluor 488 (grønn) og 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) å visualisere kjernen (blå).
Discussion
Det er ofte slik at de tidlige trinnene i oppdagelsen av nye kreftbehandling utnytte kreft cellelinjer, som skal bære tvilsom likhet med primære kreftceller likevel forbli i bruk på grunn av sin brukervennlighet i laboratoriet. Forskning på utvikling av nye kreft terapier ville bli fremskyndet hvis primære humane kreftceller ble utnyttet tidlig i romanen forskning. CTC er det lettest tilgjengelige type kreftcelle, på grunn av deres tilstedeværelse i blod og gleden over en standard blodprøvetaking. I tillegg sirkulerende tumorceller representere et nødvendig skritt i prosessen med metastase 5,6, slik at deres relevans i forhold til sykdom og verktøyet for målretting nye legemidler er klar. Isolering av CTC fra blod in vitro kompliseres av deres lave konsentrasjoner: i størrelsesorden én per million leukocytter eller ett per milliard erytrocytter 7. Flertallet av dagens metoder for å oppdage CTC i blodet, blant annet den eneste FDA-godkjente teknikk Cell Søk (Veridex), skade eller ødelegge celler i søkeprosessen, utelukker bruk utover telling. Metoden er beskrevet ovenfor ikke kompromiss celleviabilitet og dermed åpner døren for fremtidig klinisk forskning på kreft. Som gjenvinning av intakte celler er målet med denne teknikken, er det viktig at celler skal håndteres med forsiktighet, spesielt i blod separasjon trinn.
Det er en rekke av tunbare parametere i dette systemet som kan endres for å oppnå bedre avkastning avhengig kritiske egenskaper som for eksempel kreft type. I trinnene som er beskrevet ovenfor, hadde vi valgt å benytte EpCAM som en CTC-spesifikt antistoff for alle kreftformer unntatt ved behandling av prostatakreft prøvene, hvor anti-PSMA ble brukt. Ytterligere erstatninger for kreft-spesifikke antistoffer kan sikkert brukes til å forbedre ytelsen for enkelte pasienter. Videre kan selektin og antistoff konsentrasjoner endres for å forbedre fangst åtte.
"> En viktig egenskap ved enheten er inkorporering av E-selektin molekyler på overflaten. E-selektin normalt uttrykt på luminal overflaten av endotelceller og funksjon for å rekruttere rask bevegelse leukocytter til nettsteder på betennelse. Strømmer leukocytter binder midlertidig til selektin molekyler, noe som resulterer i en langsommere, bølgende atferd som letter langsommere og sterkere binding av cellen til endotelet ved integriner. Overbevisende eksperimentelle bevis eksisterer som gjør slik at CTC kan extravasate ved en tilsvarende mekanisme 9,10. Inkludering av selectin også gjør at enheten kan brukes til større flyt, priser som ellers ville hindre celler fra å binde seg til antistoffene 11. Dermed vår enhet etterligner fysiologisk en venule til biomimetically fange flyter CTC uten å bli påført cellulær skade.Forbedret enhetens ytelse kan tilskrives tillegg av halloysite nanorør belegg til luminal overflatenav enheten. Tidligere studier har vist at det er tre viktige komponenter av nanorør belegg som gir forbedret funksjonalitet. Først gir nanorør belegget økt areal, noe som åpner for større protein deponering på overflaten fire. Andre, i å utføre atomic force mikroskopi på nanorør belegget har vi fastslått at enkelte nanorør stikker fra overflaten inn i flyten. Dette gjør selektin molekyler til å bli presentert så mye som én mikrometer over overflaten slik at cellene kan fanges og rekrutteres til overflaten tidligere i banen sin gjennom røret fire. Endelig er halloysite nanorør belegg stand til å forebygge leukocytt vedheft og spredning på overflaten, noe som åpner for et redusert antall leukocytter fanget sammen med CTC og dermed større påfølgende CTC renhet 3.
Disclosures
MRK er en vitenskapelig rådgiver CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).
Acknowledgments
Arbeidet er beskrevet ble støttet av Cornell Center på mikromiljøet & Metastase gjennom Award Number U54CA143876 fra National Cancer Institute. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle syn i National Cancer Institute eller National Institutes of Health. Dette arbeidet ble i tillegg finansiert delvis av en National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 um ID tubing | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health Science | 1507L | |
| 5mL syringe for pump | BD Biosciences | 309603 | |
| Connector small to large tubing | IDEX Health Science | P-770 | |
| Connector large tubing to syringe | IDEX Health Science | F-120 and P-659 | |
| Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 | |
| Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 | |
| PSMA Antibody (GCP-04) | Abcam | ab66911 | |
| 96 well plates (Microtest 96) | BD Biosciences | 35-3072 | |
| Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad | 216005508 | |
| Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 | |
| rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES | |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |
References
- Allard, W. J. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Hughes, A. D., King, M. R. Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).
- Hughes, A. D. Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).
- Hughes, A. D., King, M. R. Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells. Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).
- Al-Mehdi, A. B. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat. Med. 6, 100-102 (2000).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: Building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).
- Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).
- Geng, Y., Marshall, J., King, M. Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation. Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 Forthcoming.
- Stott, S. L. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).
