Summary
हमारे वर्तमान काम में वर्णित है, 200 कोलेजन सातवीं के अमीनो एसिड (757-967 आ) के एक खंड के खिलाफ आईजीजी शुद्ध पशु मॉडल में बार - बार blistering के रूप में के रूप में अच्छी तरह से phenotype histo और immunopathological मानव के लक्षण सुविधाओं reproducing चूहों में इंजेक्ट कर रहे हैं बाह्यत्वचालयन bullosa acquisita (EBA)
Abstract
Autoimmune घटना स्वस्थ व्यक्तियों में पाए जाते हैं, लेकिन जब आत्म सहिष्णुता में विफल रहता है, autoimmune प्रतिक्रिया विशिष्ट विकृति में परिणाम हो सकता है. के अनुसार Witebsky postulates, एक autoimmune के रूप में एक रोग निदान में मापदंड के autoantibodies के निष्क्रिय हस्तांतरण द्वारा प्रायोगिक पशुओं में रोग के प्रजनन है. बाह्यत्वचालयन लिए bullosa (EBA) acquisita, एक मूलादर्शीय त्वचा और श्लेष्मा झिल्ली के अंग विशेष autoimmune रोग, कई प्रयोगात्मक मॉडल हाल ही में स्थापित किए गए थे. हमारे वर्तमान काम में वर्णित है, 200 कोलेजन सातवीं के अमीनो एसिड (757-967 आ) के एक खंड के खिलाफ आईजीजी शुद्ध पशु मॉडल में बार - बार blistering के रूप में के रूप में अच्छी तरह से phenotype histo और immunopathological मानव के लक्षण सुविधाओं reproducing चूहों में इंजेक्ट कर रहे हैं 1 EBA. पूर्ण विकसित व्यापक रोग आमतौर पर 5-6 दिनों पहले इंजेक्शन के बाद देखा जाता है और बीमारी की हद तक प्रशासित ग की खुराक के साथ संबद्धollagen आईजीजी सातवीं - विशिष्ट. प्रयोगात्मक EBA (छाला गठन) में ऊतकों को नुकसान और granulocytes की भर्ती सक्रियण पर बाध्य ऊतक 2 autoantibodies, -4 से निर्भर करता है. इसलिए, इस मॉडल granulocyte निर्भर सूजन autoimmune ऊतकों को नुकसान में शामिल मार्ग के विच्छेदन के लिए अनुमति देता है, मॉडल के रूप में केवल अपवाही autoimmune प्रतिक्रिया की टी सेल स्वतंत्र चरण reproduces. इसके अलावा, अपने मूल्य autoantibodies के vivo में फफोला उत्प्रेरण संभावित प्रदर्शन और 1,3 EBA, -6 में छाला गठन की व्यवस्था की जांच के अध्ययन का एक नंबर से रेखांकित किया है. अंत में, इस मॉडल बहुत autoantibody प्रेरित रोगों में नए विरोधी भड़काऊ के उपचारों के विकास की सुविधा होगी. कुल मिलाकर, EBA के निष्क्रिय हस्तांतरण पशु मॉडल एक सुलभ और शिक्षाप्रद रोग मॉडल है और शोधकर्ताओं ने न केवल EBA रोगजनन का विश्लेषण करने के लिए, लेकिन मौलिक biologically और नैदानिक जवाब में मदद मिलेगीआवश्यक autoimmunity सवालों.
Protocol
1. रोगजनक एंटीबॉडी तैयार
नोट: शोधन और एंटीबॉडी के एकाग्रता उसी दिन पर किया जाना चाहिए, क्योंकि एंटीबॉडी 0.1 एम ग्लाइसिन 2.5-3 पीएच (क्षालन बफर) रात खत्म (ON) में संग्रहीत किया जा नहीं कर रहे हैं.
आईजीजी के संबंध शुद्धीकरण: प्रतिरक्षा खरगोश के सीरम के 25 मिलीलीटर का उपयोग करें:
- 4 में खरगोश पर पिघलना के सीरम ° सी, यह 1xPBS (बफर चल रहा है) के साथ 01:01 मिश्रण और 1260 XG में यह 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र वैकल्पिक रूप से, फिल्टर पेपर के साथ एक फिल्टर कदम centrifugation मामले में सीरम फैटी है के बाद शामिल किया जा सकता है.
- इस बीच, प्रोटीन जी मैट्रिक्स 10 1XPBS (बफर चल रहा है) के बिस्तर मात्रा (बिस्तर मात्रा = मैट्रिक्स मात्रा) के साथ स्तंभ भर धो लो.
- पतला और फ़िल्टर्ड स्तंभ सीरम लागू करें और कमरे के तापमान (आर टी) पर कमाल मंच पर 1 घंटा सेते हैं.
- प्रवाह के माध्यम से (एफटी) एक 50 मिलीलीटर flacon ट्यूब में ले लीजिए. क्या यह नहीं त्यागने एकाग्रता तकऔर शुद्ध आईजीजी के अनुमापांक जाना जाता है.
- मैट्रिक्स 5 1XPBS की मात्रा के साथ बिस्तर धो और eluted आईजीजी अंश को इकट्ठा करने के लिए बीच में 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों तैयार. पिपेट 1 मिलीलीटर पीएच को निष्क्रिय बफर: प्रत्येक ट्यूब में 1 एम TRIS 10 पीएच (अन्यथा 1:20 TRIS बफर के प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक की राशि एकत्रित करने के लिए सापेक्ष अनुपात).
- स्तंभ 0.1 एम ग्लाइसिन पीएच 2.5-3 और 50 मिलीलीटर अंश (ओं) इकट्ठा: 100-150 मिलीलीटर क्षालन बफर लागू. 2-3x ट्यूब फ्लिप, पीएच को मापने के लिए और जब तक आप को निष्क्रिय बफर जोड़ने 7.2-7.4 पीएच तक पहुँच है.
- आईजीजी प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक की कुछ बूँदें ले लीजिए और क्षालन बफर का उपयोग कर के रूप में 280 एनएम पर ETALON आयुध डिपो को मापने के. यदि आयुध डिपो <0.1 बंद एकत्रित कर रहा है.
- प्रोटीन जी मैट्रिक्स पुनर्जन्म और यह निर्माता के निर्देशों का पालन करने की दुकान है.
Amicon ट्यूबों के साथ ultrafiltration द्वारा एकाग्रता:
- (15 मिलीग्राम / 30KDa) 1XPBS साथ 15-20 मिनट centrifuging द्वारा Amicon अल्ट्रा धो ultrafiltration ट्यूबों4 डिग्री सेल्सियस पर 3220 XG Amicon से एफटी त्यागें.
- Eluted आईजीजी अंश और अपकेंद्रित्र के 15 मिलीलीटर के साथ 3220 XG पर 25-30 मिनट और 4 के लिए Amicons भरें डिग्री सेल्सियस; centrifugation समय हमेशा प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक के प्रोटीन सामग्री पर निर्भर करता है.
- एफटी त्यागें और ultrafiltration दोहराएँ जब तक आप कोई अंश eluted छोड़ दिया है.
- केंद्रित आईजीजी 1XPBS centrifugation द्वारा 25-30 मिनट के साथ बड़े पैमाने पर दो बार, धो लें.
- "" चिपचिपा के 1,500-2,000 μl 1XPBS की एक अंतिम मात्रा में Amicon फिल्टर से पीले एंटीबॉडी समाधान ले लीजिए.
- आईजीजी एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या NanoDrop का उपयोग कर तैयारी के उपाय एकाग्रता:
सान्द्र. (मिलीग्राम / एमएल) = एक (280 एनएम) कमजोर पड़ने कारक x 1,4 / - धो और निर्माता के निर्देशों का पालन Amicons की दुकान.
2. कोलेजन VII-विशिष्ट आईजीजी के चूहों में इंजेक्शन
वास्तविक प्रयोगात्मक प्रक्रिया शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि प्रयोगात्मक समर्थकtocol लिखा है और सभी सामग्री के प्रयोग के लिए तैयार कर रहे हैं.
- रोग स्कोरिंग, ELISAs, इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) विश्लेषण और myeloperoxidase (MPO) 4 परख के लिए डाटा शीट तैयार.
- रक्त और अंगों, cryomolds के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊतक विज्ञान प्रसंस्करण और कैसेट embedding के लिए ट्यूब लेबल.
- एंटीबॉडी समाधान नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए या शेयरों से thawed और (IF माइक्रोस्कोपी और / या एलिसा द्वारा अनुमापांक) उनके जेट के संबंध के साथ होती है. बाँझ फ़िल्टर्ड एंटीबॉडी समाधान एक तरीका है कि इंजेक्शन के लिए आवश्यक खुराक 250-1000 μl के बीच बदलता में पीबीएस में पतला होना चाहिए. सुनिश्चित करें कि आप पर्याप्त पूरे प्रयोग करने आईजीजी.
- हेपरिन 20 / यू मिलीग्राम और 8.7 मिलीग्राम / एमएल ketamine / 1.3 मिलीग्राम / एमएल संज्ञाहरण के लिए xylazine मिश्रण: ताजा anticoagulant तैयार करें जब त्याग चूहों 3.7% formaldehyde तैयार ट्यूबों के साथ लेबल है.
- शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित (स्केलपेल, कैंची, ठीक बिंदु और curvएड) forcipes और (इंसुलिन सीरिंज, 1 और 2 मिलीलीटर सीरिंज) सीरिंज, सुई, डिजिटल कैमरा और अतिरिक्त मेमोरी कार्ड तैयार.
नोट: ketamine / xylazine या isoflurane narcotized चूहों पर सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन isoflurane दैनिक त्वचा की जांच के लिए पसंदीदा संज्ञाहरण विकल्प है, क्योंकि चूहों जल्दी से ठीक हो. हालांकि, जब चित्रों, 87 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 13 xylazine मिलीग्राम / किग्रा लेने आमतौर पर subcutaneously इंजेक्शन है. इच्छामृत्यु के लिए खुराक / ketamine xylazine ketamine 130 / किलो मिलीग्राम और 20 xylazine मिलीग्राम / किलो की वृद्धि हुई है.
- उनके सामान्य स्वास्थ्य हालत त्वचा, और फर उपस्थिति के लिए पहले से ही जानवरों के रूप में चिह्नित की जाँच करें, उन्हें वजन और उनके कान मोटाई मापने (हमेशा एक ही कान के लिए छड़ी).
- मनाया मूल्यों और नैदानिक मूल्यांकन चादर में परिवर्तन.
- एक सिरिंज युक्त anticoagulant का एक ही मात्रा में पूंछ नस से 20-30 (2-3 बूँदें) μl रक्त ले लीजिए.
- फर शुद्ध करना और80% इथेनॉल का उपयोग त्वचा.
- एक इंसुलिन सिरिंज का उपयोग कर वापस में subcutaneously एंटीबॉडी समाधान सुई (कुछ साइटों (जैसे, कान) के लिए केवल छोटी मात्रा (10-50 μl) इंजेक्शन संभव है.).
इंजेक्शन हर दूसरे दिन दोहराया जाना चाहिए, 4 बार. / Balb ग और लगभग 20 ग्राम के एक शरीर के वजन के C57BL6 चूहों 400-500 के पहले प्रशासन के बाद 750 ग्राम / जी / वजन इंजेक्शन शरीर autoantibodies 3-4 दिनों रोग विकसित करने के लिए शुरू.
जब प्रयोग परिष्करण:
- गहरी निद्रावहन के तहत 130 किलो / मिलीग्राम और 20 मिलीग्राम / किग्रा / ketamine xylazine subcutaneously इंजेक्शन द्वारा चूहों रखो, उन्हें पीछे वेना कावा से रक्तहीन और दिल में कटौती से बाहर.
- त्वचा के रूप में / अंगों और ऊतकों के नमूनों ले लीजिए: पूंछ, कान, रक्त, और घुटकी और उन्हें पहले लेबल और पीबीएस या 3.7% formaldehyde भर ट्यूब में डाल दिया है.
जब लौटनेप्रयोगशाला:
- 1200 XG, अलग प्लाज्मा आरटी पर 10 मिनट में रक्त अपकेंद्रित्र, ठीक से लेबल ट्यूबों प्लाज्मा हस्तांतरण और तदनुसार उन्हें स्टोर.
- एमबेड करें त्वचा इष्टतम कट तापमान मध्यम में बायोप्सी cryomolds, ठीक से लेबल का उपयोग कर रहे हैं, और उन्हें -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस
- ऊतक लेबल embedding molds में ऊतक विज्ञान के लिए मतलब नमूनों प्लेस और उन्हें आयल embedding तक 3.7% formaldehyde में रखना.
3. रोग की गंभीरता के नैदानिक मूल्यांकन
चूहे त्वचा और mucosa के घावों के लिए दैनिक जांच की जाना चाहिए और निष्कर्ष उपयुक्त रूपों का उपयोग कर दर्ज किया जाना चाहिए. जल्दी इच्छामृत्यु के लिए मापदंड त्वचा शरीर की सतह के 20% और अधिक है कि लगातार तीन दिनों में शरीर के कुल वजन का 5-10% की एक वजन घटाने को प्रभावित घावों, 5 की एक बीमारी स्कोर (1 टेबल) के लिए गिनती.
- उसके पेट पर माउस रखें. सिर क्षेत्र के साथ शुरू, अर्थात् अधिकार के साथकान के और फफोले, erosions, भीतरी पर पपड़ी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाहरी तरफ की जांच करने के लिए. बाएं कान के साथ उसी तरह जारी.
- सही और बाईं आंख पर्विल के संकेत के लिए नियंत्रित कर रहे हैं, खालित्य, erosions और / या परत.
- माथे और थूथन क्षेत्र अगले के माध्यम से ब्रश कर रहे हैं, थूथन, होंठ और मुँह की म्यूकस झिल्ली के उदर भाग के साथ जारी है.
- सही सामने पंजा से शुरू, ऊपर से बढ़ पैर की जांच करना; बाईं सामने पैर स्विच. सही और बाएँ पिछले पैरों के साथ एक ही प्रक्रिया.
- एक घुमावदार ठीक बिंदु संदंश के साथ गर्दन और पीठ क्षेत्र पर फर के माध्यम से ब्रश.
- अपनी पीठ पर माउस मुड़ें और उदर के हिस्सा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंगों के उदर पहले के रूप में उसी तरह पक्षों की जाँच करें.
- पूंछ की जाँच करें.
- जहां चूहों रोग विकसित प्रासंगिक शरीर के अंगों की तस्वीरें ले लो. ध्यान और तस्वीरों की गुणवत्ता और मात्रा में करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए.
- नैदानिक रोग स्कोर की गणना.
4. त्वचा और प्लाज्मा नमूनों का विश्लेषण
- तैयार है, स्टोर, और / या योजना के अनुसार सभी एकत्र ऊतकों की प्रक्रिया.
- के लिए जमे हुए ऊतक वर्गों कटौती यदि खरगोश एंटीबॉडी और माउस पूरक प्रणाली घटकों का पता लगाने.
- जमे हुए ऊतकों और / या अंग अर्क के विभिन्न प्रोटीन और एंजाइम सामग्री (MPO परख) का विश्लेषण.
- धारा पैराफिन ऊतक एम्बेडेड और एच एंड ई के साथ दाग ऊतकों को नुकसान की हद तक कल्पना.
- प्लाज्मा एलिसा, immunoblot द्वारा विश्लेषण.
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Representative Results
प्रतिजन चूहों में एक पूर्ण विकसित रोग में विशिष्ट एंटीबॉडी परिणाम, नैदानिक, histological और immunopathological स्तरों पर मानव EBA जैसी निष्क्रिय हस्तांतरण. फफोले, crusts, erosions और खालित्य कान, थूथन, पंजे, पैर, पीठ और चूहों की आंखों के आसपास पर विकसित करना. बीमारी का पहला नैदानिक लक्षण सबसे शायद कान और / या सिर क्षेत्र पर दिखाई देगा. विशिष्ट खरगोश आईजीजी और माउस पूरक C3 के बयान यदि perilesional त्वचा की cryosections में त्वचीय epidermal जंक्शन पर प्रत्यक्ष द्वारा पता चला है. ऊतक विज्ञान के द्वारा lesional त्वचा subepidermal फफोले और सूजन में देखा घुसपैठ कर रहे हैं.
हालांकि, अगर रोगजनक कोलेजन सातवीं विशिष्ट एंटीबॉडी के इंजेक्शन बंद कर दिया है, रोग गतिविधि धीरे - धीरे कम हो जाता है, और कई हफ्तों के भीतर घावों को चंगा. फिर भी, postinflammatory किणयुक्त खालित्य की एक निश्चित डिग्री अनिश्चित काल तक बना रह सकता है.
Characterizरीकॉम्बीनैंट autoantigen समझना (और रोगजनक आईजीजी के)
Murine कोलेजन विशिष्ट आईजीजी त्वचीय-epidermal जंक्शन (चित्रा 2B) में बांधता है. विशिष्टता immunoblot (चित्रा 2C, 3 गलियों, 4 और 7) द्वारा मूल्यांकन किया है.
रोग गतिविधि स्कोरिंग
रोग के नैदानिक मूल्यांकन एक स्कोरिंग प्रणाली हम विकसित (1 टेबल) पर आधारित है:, 1, त्वचा की सतह के कम से कम 1%, 2, त्वचा की सतह के 1-5%, 0, कोई घावों 3, 5 - त्वचा की सतह के 10%, 4, त्वचा की सतह के 10-20% प्रभावित है. आईजीजी murine कोलेजन सातवीं के खिलाफ पर्विल, खालित्य, फफोले, erosions, कान, आंख, थूथन, अंग और ग / Balb चूहों (3 चित्रा) के ट्रंक पर crusts के रूप में cutaneous घावों लाती है.
ऊतक बाध्य और परिसंचारी कोलेजन विशिष्ट एंटीबॉडी का विश्लेषण
खरगोश आईजीजी और माउस पूरक C3 के बयान detecजमे हुए, perilesional ऊतक वर्गों में टेड (चित्रा 4D और ई क्रमशः). subepidermal फफोले और घुसपैठ भड़काऊ histological नमूने (चित्रा 4F) में देखा जाता है. घूम खरगोश एंटीबॉडी एलिसा (चित्रा 5) का विश्लेषण कर रहे हैं. जमे हुए ऊतकों और / या अंग अर्क अपने प्रोटीन और एंजाइम सामग्री के लिए अलग assays (MPO परख) का विश्लेषण कर रहे हैं.
चित्रा 1. Vivo में की समग्र योजना कोलेजन VII-विशिष्ट एंटीबॉडी के निष्क्रिय हस्तांतरण द्वारा प्रेरित blistering खरगोशों. Murine कोलेजन सातवीं और खरगोश आईजीजी के साथ प्रतिरक्षित प्रतिरक्षा सीरा से शुद्ध होता है. बाद में, विशिष्ट autoantibodies subcutaneously एक इंजेक्शन / खून बह रहा अनुसूची के बाद चूहों में इंजेक्ट कर रहे हैं. चूहे सामान्य स्वास्थ्य की स्थिति और रोग दैनिक संकेत के लिए जाँच की जा रही है.
चित्रा 2. रोगजनक कोलेजन सातवीं विशिष्ट आईजीजी की विशेषता अप्रत्यक्ष. यदि नमक विभाजित सामान्य माउस त्वचा पूर्व प्रतिरक्षा खरगोश सीरम और कोलेजन murine कोई बयान में सातवीं विशिष्ट प्रतिरक्षा खरगोश सीरम परिणाम (A) और पर autoantibodies के बयान के साथ incubated वर्गों का विश्लेषण त्वचीय epidermal जंक्शन (बी), क्रमशः. विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिजन वे जब अतिव्यापी रीकॉम्बीनैंट murine कोलेजन सातवीं टुकड़े का एक सेट के साथ immunoblot प्रदर्शन है के खिलाफ उठाए गए थे (सी, 3 लेन, 4 और 7) (ओं) को समझते हैं.
चित्रा 3. चूहों के नैदानिक मूल्यांकन murine कोलेजन सातवीं आईजीजी ऐसे खालित्य, छाले, erosions, कानों पर crusts, आँखें, थूथन, ली के रूप में cutaneous घावों लातीएमबीएस और / Balb ग चूहों (ई.) के ट्रंक. विशिष्ट autoantibodies साथ चूहों अंतःक्षिप्त 4 के स्कोर तक पहुँचते हैं, जबकि एक उदासीन प्रोटीन के खिलाफ NRIgG या पेट के साथ इंजेक्शन वाले 0 (ई) का स्कोर था. नैदानिक स्कोर के रूप में गणना की गई है: - 0, कोई घावों 1, त्वचा की सतह के कम से कम 1%, 2, त्वचा की सतह के 1-5%, 3, त्वचा की सतह के 5-10%, 10 4, त्वचा की सतह के 20% से प्रभावित है. अंतिम स्कोर में एक अतिरिक्त बिंदु के रूप में लगातार तीन दिन मायने रखता है के दौरान शरीर के कुल वजन का 5-10% के वजन में कमी.
चित्रा 4. कोलेजन सातवीं विशिष्ट आईजीजी. खरगोश आईजीजी (डी), और माउस पूरक C3 (ई) के बयान के इंजेक्शन के साथ चूहों में histo और immunopathological निष्कर्ष प्रत्यक्ष द्वारा यदि त्वचीय perilesional त्वचा की cryosections में epidermal जंक्शन पर, vivo में पता चला है. Lesional त्वचा subepidermal फफोले और भड़काऊ infiltrate ऊतक विज्ञान (एफ) द्वारा देखा जाता है. खरगोश (A) आईजीजी, माउस पूरक C3 (बी), और न ही कोई बयान subepidermal छाला गठन नियंत्रण (सी) में देखा है.
चित्रा 5. कोलेजन VII-विशिष्ट आईजीजी के साथ इंजेक्शन चूहों से प्लाज्मा के Immunoassay. खरगोश एंटीबॉडी परिसंचारी के प्लाज्मा स्तर एलिसा द्वारा मापा गया.
तालिका 1. त्वचा रोग स्कोरिंग चादर blistering. बड़ी मेज देखने के लिए यहां क्लिक करें .
प्रणाली स्कोरिंग:
- 0, कोई घावों;
- 1, त्वचा की सतह के कम से कम 1%;
- 2, त्वचा की सतह के 1-5%;
- 3, सु त्वचा के 5-10%rface;
- 4, त्वचा की सतह के 10-20% प्रभावित है.
अतिरिक्त संकेत स्कोरिंग:
- अंतिम स्कोर 17 में एक अतिरिक्त बिंदु के रूप में लगातार तीन दिन मायने रखता है के दौरान शरीर के कुल वजन का 5-10% के वजन में कमी.
- कानों पर पंजे पर आंखों के आसपास पर्विल, बस चल रहे एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का पहला संकेत, फफोले या खालित्य वे मात्रा निर्धारित है, न सिर्फ निगरानी में ले रहे हैं साथ अगर नहीं बनती.
- पूँछ पर मार्क्स काटने या लड़ाई के निशान हो सकता है, इसलिए यदि वे शुरुआत उनकी बिगड़ती से मौजूद बीमारी के कारण नहीं हो सकता है जरूरी. सावधानी से विचार करें उन्हें गिनती मौसम!
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Discussion
autoantibodies की प्रायोगिक पशुओं में निष्क्रिय हस्तांतरण उनके 7 pathogenicity, -12 के प्रदर्शन के लिए एक प्रमुख दृष्टिकोण है. इस पद्धति के माध्यम से प्राप्त पशु मॉडल, 13 autoimmunity के लिए अप्रत्यक्ष सबूत होने के अलावा, रोगजनक तंत्र के अपवाही चरण की जांच की अनुमति. एंटीबॉडी प्रेरित granulocyte निर्भर बाह्यत्वचालयन bullosa acquisita (EBA) blistering त्वचा के निष्क्रिय हस्तांतरण मॉडल autoimmune dermatoses में ऊतकों को नुकसान का तंत्र टुकड़े करना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह भी एक exquisitely शिक्षाप्रद मॉडल के लिए मौलिक, एंटीबॉडी की मध्यस्थता अंग विशेष autoimmune रोगों कि कोलेजन सातवीं के खिलाफ autoimmunity के सीमा से परे अच्छी तरह से विस्तार के जैविक और नैदानिक महत्वपूर्ण पहलुओं का अध्ययन रोग के रूप में उभरा. अंत में, इस मॉडल के लिए तहखाने झिल्ली जीव विज्ञान सहित मौलिक जैविक और pathophysiological प्रक्रियाओं, प्रतिरक्षा परिसरों द्वारा granulocyte सक्रियण का अध्ययन करने के लिए एक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैघ सक्रियण पूरक.
हालांकि पूर्व vivo और पशु मॉडल सहित कई प्रयोगात्मक सेटिंग, autoimmune त्वचा रोग EBA 14 के लिए उपलब्ध हैं, दूर से पशुओं में सबसे granulocyte निर्भर भड़काऊ रास्ते के अध्ययन के लिए उपयुक्त autoantibodies के निष्क्रिय हस्तांतरण है. पूर्व vivo मॉडल है, जहां granulocytes त्वचा पहले 15 autoantibodies साथ incubated वर्गों को जोड़ रहे हैं के विपरीत, यहाँ leukocytes की घुसपैठ अनायास चूहों द्वारा reproduced है. इसके अलावा, अगर हम विशिष्ट खरगोश और बकरी जैसे अन्य जीवों में प्रतिजन के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी के साथ काम करने के लिए चुनते हैं, हम सीमित रोगी सीरा उपलब्धता की समस्या से बचने के लिए और हम भी सक्रियण पूरक और granulocyte भर्ती 16 को पुन: पेश करने के लिए एक बेहतर मौका है.
निष्क्रिय अंतरण विधा में granulocyte निर्भर blistering के सफल प्रजनन के लिएEBA एल, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए पर्याप्त रूप से रोग के लक्षण स्कोर करने में सक्षम हो सकता है, फफोले, और crusts खालित्य के साथ erosions के माध्यम से पर्विल और edema के साथ शुरू. चूहों का मूल्यांकन एक प्रक्रिया है कि पहले से सीखा जा जरूरत है. रोग के स्कोरिंग के लिए एक ही व्यक्ति द्वारा प्रदर्शन किया जा प्रयोग भर में और हमेशा एक सहयोगी या सहायता व्यक्ति द्वारा दूसरे. विकास और प्रत्येक प्रयोगात्मक रोग के लिए एक मानकीकृत स्कोरिंग प्रणाली के उपयोग के outmost महत्व का है. संलग्न में स्कोरिंग चादर पाठक एक अंतर्दृष्टि कैसे त्वचा dermatoses चूहों में मूल्यांकन कर रहे हैं देना चाहिए.
जब वीडियो में दिखाए प्रदर्शन किया, autoantibody प्रेरित subepidermal blistering के मॉडल बहुत granulocyte निर्भर भड़काऊ autoantibodies और ऊतकों को नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा चालू रास्ते के आगे विच्छेदन की सुविधा होगी. चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में इसके मूल्य के विकास और परीक्षण नए प्रतिजन का वादा परिप्रेक्ष्य द्वारा समर्थित हैpecific टी और बी कोशिका विरोधी भड़काऊ उपचार लक्षित है. अंत में, यह मौलिक biologically और चिकित्सकीय आवश्यक autoimmunity सवालों का जवाब देने में मदद मिलेगी.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों Freiburg विश्वविद्यालय (सीएस) के मेडिकल संकाय से ड्यूश Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 और BIOSS से अनुदान द्वारा समर्थन को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| recombinant antigen | The plasmids encoding for the recombinant forms of murine collagen VII are available from the corresponding author. | ||
| immune rabbit serum | www.eurogentec.com | We had New Zealand White rabbits immunized with 200 μg of antigen, 3 times at 2 week intervals. For this purpose we have used the services of Eurogentec S.A., Belgium. | |
| Protein G agarose | Roche Applied Science | 11243233001 | |
| Balb/c mice | Charles River Laboratories | ||
| OCT compound, Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4583 | OCT, optimal cutting temperature |
| Cryomold standard | Sakura Finetek | 4557 | 25 mm × 20 mm × 5 mm |
| Cryomold intermediate | Sakura Finetek | 4566 | 15 mm × 15 mm × 5 mm |
| Uni-Link-Einbettkassette | R. Langenbrinck | 09-0503 | Histology processing and embedding cassettes |
| Spezial-Tatowierfarbe Schwarz | H. Hauptnerund Richard Herberholz GmbH Co. KG | 71492000 | tattooing paste |
| Tatowierzange TZ1 | EBECO E. Becker Co GmbH | tattooing device | |
| Heparin | Carl Roth GmbH Co. | 7692.1 | |
| Formaldehyde 37% | Carl Roth GmbH Co. | 7386 | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | K2753-1G | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | X1251-1G | |
| sterile PBS | Biochrom | L182-50 | |
| digital camera | Nikon | Coolpix 5400 | |
| Syringe driven filter unit 0.45 μm | Millipore | ||
| Caliper | Mitutoyo 7309 | 1667338 | Farnell (distributor) |
| disease scoring sheet | example enclosed |
References
- Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen. J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).
- Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 225, 401-413 (2011).
- Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes. Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).
- Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage. J. Pathol. 212, 56-65 (2007).
- Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).
- Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).
- Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).
- Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme. Science. 286, 1732-1735 (1999).
- Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice. PLoS One. 7, e31066 (2012).
- Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180. J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).
- Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease. N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).
- Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse. Science. 190, 397-399 (1975).
- Rose, N. R., Bona, C. Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited. Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).
- Sitaru, C. Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita. Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).
- Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin. Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).
- Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice. Immunol. Lett. , (2012).
- Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 224, 234-244 (2011).
