Summary
VII型コラーゲンの200アミノ酸(aa 757から967)のストレッチに対してIgG抗体を精製し、我々の現在の仕事で説明する動物モデルで猛烈な表現型だけでなく、人間に特徴的な病理組織および免疫病理学的特徴を再現したマウスに繰り返し注入され後天性表皮水疱症(EBA)
Abstract
自己免疫現象は、健康な個体で発生しますが、自己寛容が失敗したときに、自己免疫応答が特定の病状になることがあります。によるWitebskyのは、自己免疫疾患などの診断の基準のいずれかを仮定すると、自己抗体の受動的伝達によって、実験動物における疾患の再生です。後天性表皮水疱症(EBA)、皮膚や粘膜の原型の臓器特異的自己免疫疾患のために、いくつかの実験モデルは、最近設立された。 VII型コラーゲンの200アミノ酸(aa 757から967)のストレッチに対してIgG抗体を精製し、我々の現在の仕事で説明する動物モデルで猛烈な表現型だけでなく、人間に特徴的な病理組織および免疫病理学的特徴を再現したマウスに繰り返し注入されEBA 1。本格的な広範な疾患は、通常、最初の注射後5-6日見られ、疾患の程度は、投与されたCの線量と相関しているollagen VII-特異的IgG。実験EBAにおける組織損傷(ブリスター形成)-4組織結合自己抗体2によって顆粒球の動員および活性化に依存している。モデルは唯一の遠心性自己免疫応答のT細胞非依存位相を再現したがって、このモデルでは、自己免疫組織損傷に関与する顆粒球依存性炎症経路の解剖を可能にします。また、その値は、in vivoで自己抗体のブリスター誘導可能性を示すとEBA 1,3、-6における水疱形成のメカニズムを調査研究の数によって強調される。最後に、このモデルでは、大幅に自己抗体によって誘発される疾患における新たな抗炎症治療薬の開発を容易にするでしょう。全体的に、EBAの受動転送動物モデルがアクセス可能で有益な疾患モデルであると研究者はEBAの病因ではないだけを分析するのではなく、基本的な生物学的にも臨床的に答えるのに役立ちます本質的な自己免疫の質問。
Protocol
1。病原性抗体の作製
注意:抗体は一晩0.1MグリシンpHは2.5から3(溶出バッファー)(ON)に格納されるべきではないとして精製と抗体の濃度は、同じ日に行われるべきである。
IgGのアフィニティー精製:免疫ウサギ血清25mlを使用します。
- 4でONウサギ血清を融解℃で、20℃で1xPBS(バッファを実行している)と、それを1:1で混合し、10分間1260 xgでそれを遠心血清脂肪酸である場合には必要に応じて、ろ紙でろ過工程は、遠心分離後に含まれている場合があります。
- 一方、G行列は1XPBSの10ベッドボリューム(ベッドボリューム=マトリックス容積()バッファを実行している)でカラムを充填したタンパク質を洗う。
- カラムに希釈し、濾過した血清を適用して、室温(RT)でロッキングプラットフォーム上で1時間インキュベートする。
- フロースルー(FT)は50ミリリットルの小瓶チューブ内を収集します。濃度までそれを捨てないでくださいと精製IgGの力価が知られている。
- 1XPBSの5ベッドボリュームで行列を洗い、その間に溶出したIgG画分を収集するために50mlのFalconチューブを準備する。ピペット1ミリリットルのpH中和バッファー:各チューブの1MトリスpH 10(そうでなければ、収集する溶出液の量に対する1時20分TRIS緩衝液の割合)。
- カラムに0.1MグリシンpHは2.5から3と50 mlの画分(s)を収集してください。100〜150ミリリットルの溶出バッファーを適用する。 2〜3倍管を裏返して、pHを測定し、pHが7.2から7.4に達するまで中和バッファーを追加します。
- IgGの溶出液数滴を収集し、エタロンは280nmでODを測定するよう溶出緩衝液を用いて。 ODは<0.1ストップ収集している場合。
- プロテインG行列を再生成し、製造元の指示に従って保管してください。
アミコン管と限外ろ過による濃縮:
- 15-20分を遠心分離することによって1XPBSとアミコンウルトラ(15ミリリットル/ 30KDa)限外濾過管を洗う4℃、3220×gでアミコンからFTを捨ててください。
- 3220 xgで25から30分間溶出したIgG画分、遠心15mlでAmiconsと4を埋める℃、遠心分離時間は常に溶出液のタンパク質含有量に依存します。
- FTを捨て、あなたは残っていない溶出画分を持っていないまで限外ろ過を繰り返す。
- 遠心分離により1XPBS 25から30分間で、広範囲に、2回濃縮したIgGを洗ってください。
- 1XPBSの1,500-2,000最終量100μlのアミコンフィルターから "スティッキー"、黄色がかった抗体溶液を収集します。
- 分光光度計や光度計を用いてIgG調製物の濃度を測定します。
コンク。 (mg / ml)でA = A(280 nm)の×希釈率/ 1,4 - 製造元の指示に従ってAmiconsを洗って保管してください。
2。マウスにVII型コラーゲン特異的IgGの注射
実際の実験手順を開始する前に、次のことを確認した実験プロトコールが書き込まれ、すべての材料は、実験のために用意されている。
- 病気の得点、ELISA法、蛍光抗体法(IF)の分析とミエロペルオキシダーゼ(MPO)アッセイ4のデータシートを準備します。
- 血液や臓器、cryomoldsならびに組織像処理や埋カセット用チューブにラベルする。
- 抗体溶液を、新しく調製または株式から解凍し、その反応性(IF顕微鏡および/またはELISAによる力価)に関して特徴付けられるべきである。滅菌濾過抗体溶液を注入するために必要な線量は250から1000μlの間で変化するようにPBSで希釈する必要があります。あなたは全体の実験を実行するための十分なIgGを持っていることを確認してください。
- ヘパリン20単位/ mlおよび8.7 mg / mlのケタミン/麻酔用1.3 mg / mlのキシラジン混合物:新鮮な抗凝固剤を準備します。マウスを犠牲にすると準備3.7%ホルムアルデヒドでチューブラベルを貼っている。
- (メス、はさみ、細かい点とcurv手術器具を滅菌エドforcepsの複数形)と注射器(インスリン注射器、1と2 mLシリンジ)、針、デジタルカメラや余分なメモリカードを準備します。
注:ケタミン/キシラジンまたはイソフルラン麻酔マウス上のすべての手順を実行したマウスは素早く回復としてイソフルランは、毎日の肌チェックのための好ましい麻酔のオプションです。しかし、写真を撮るときに、87 mg / kgのケタミンおよび13 mg / kgをキシラジンは、通常、皮下注射する。安楽死のためにケタミン/キシラジン投与量は130 mg / kgのケタミンおよび20 mg / kgをキシラジンに増加しています。
- 彼らの一般的な健康状態、皮膚、毛皮の外観のために既にマークの動物を確認し、それらを比較検討すると、(常に同じ耳に固執する)は、その耳の厚さを測定します。
- 観測値と臨床評価シート内の変更を登録します。
- 抗凝固剤の同じボリュームを含むシリンジで尾静脈20から30μL(2〜3滴)の血液を採取します。
- 毛皮を消毒し、80%エタノールを使用した肌。
- 。皮下インスリン注射器を使用して、バックに抗体溶液を注入する(特定のサイト(例えば、耳)の場合のみの小さなボリューム(10-50μL)を注入することが可能です。)
注射は、一日おきに4回繰り返す必要があります。 BALB / cおよび約20グラムの体重のC57BL6マウスは3-4日最大750μg/ gの体重/注射自己抗体に400から500の最初の投与後に疾患の開発を開始。
実験を終了する場合:
- 皮下に130 mg / kgおよび20 mg / kgのケタミン/キシラジンを注入することにより、深い麻酔下にマウスを置き、後部大静脈からそれらを血を抜くと心臓を切り取ってください。
- 皮膚などの器官/組織サンプル収集:尻尾、耳、血液や食道を、以前にラベル付けされ、PBSまたは3.7%ホルムアルデヒドは充填チューブに入れます。
に戻るとき実験室:
- 1200×gで、独立したプラズマに室温で10分間で血液を遠心分離し、適切にラベルしたチューブにプラズマを転送し、それに応じてそれらを格納します。
- 皮膚が正常cryomolds、ラベルを使用して最適なカット温度培地で生検し、-80℃で保管して埋め込む℃に
- ラベルされた埋め込み型の組織学のために意味の組織サンプルを配置し、パラフィン包埋までの3.7%ホルムアルデヒドに保管してください。
3。疾患の重症度の臨床評価
マウスは、皮膚や粘膜の病変を毎日検討すべきであるとの知見は、適切なフォームを使用して記録されるべきである。早期に安楽死のための基準は、5の疾患スコア( 表1)のカウントは、よりその20体表面の%と3日間連続で全体重の5〜10%の体重減少に影響を与え、皮膚病変です。
- その腹の上にマウスを置きます。右側で、すなわち頭部領域で開始耳と内側にだけでなく、外側に水疱、びらん、地殻を確認してください。左耳と同じように続ける。
- 左右の目が脱毛症、紅斑の徴候を制御し、びらん及び/又はクラストしています。
- おでこと鼻領域は鼻、唇や口の粘膜の腹の部分を続けると、次の通ってブラッシングされています。
- 上向きに動く、足から始めて右前脚を調べ、左前脚に切り替えます。左右の後ろ足と同じ手順。
- 湾曲した細かい点鉗子で首と背中エリアの毛皮を介してブラシ。
- その背中の上でマウスの電源を入れ、腹側だけでなく、手足の腹側以前と同じようにチェックしてください。
- 尾を確認してください。
- マウスは疾患を発症関連の身体の部分の写真を撮る。注目は写真の質と量に支払わなければならない。
- 臨床疾患スコアを計算。
4。皮膚および血漿サンプルの分析
- 、店の準備をし、および/または計画に従って収集したすべての組織を処理します。
- ウサギ抗体とマウス補体系成分のIFを検出するための凍結組織切片を切り取ります。
- 凍結組織および/または器官抽出物の異なるタンパク質と酵素含量(MPOアッセイ)を分析します。
- セクションパラフィン包埋組織と組織の損傷の程度を視覚化するためにH&Eで染色。
- ELISA、イムノブロットにより血漿を分析します。
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Representative Results
マウスでは、本格的な疾患における抗原特異的抗体結果の受身伝達、臨床組織学的および免疫病理学的なレベルで人間EBA似ている。水疱、痂皮、びらん、脱毛症は、耳、鼻、足、脚、背中、マウスの目の周りに開発しています。病気の最初の臨床症状は、おそらく耳および/または頭部領域に表示されます。特定ウサギIgG、およびマウス補体C3の沈着は、IF病変部周囲の皮膚の凍結切片で真皮表皮接合部に直接で検出される。皮膚病変部では表皮下水疱や炎症性浸潤が組織学的に見ている。
病原VII型コラーゲン特異的抗体の注入が中断された場合は、疾患活動性は徐々に低くなり、数週間以内に病変が治癒する。それにもかかわらず、炎症後の瘢痕性脱毛症のある程度は無期限に持続するかもしれません。
Characteriz組換え抗原のation(および病原性IgGの)
ネズミコラーゲン特異的IgGは、真皮表皮接合( 図2B)にバインドします。特異性は、免疫ブロット( 図2C、レーン3,4および7)により評価される。
疾患活動性を記録
疾患の臨床評価は、我々が開発したスコアリングシステム( 表1)に基づいています、1、皮膚表面の1%未満、2、皮膚表面の1〜5%、0、無病変3、5 -皮膚表面の10%、4、皮膚表面の10〜20%が影響を受けます。マウスVII型コラーゲンに対するIgGは、紅斑、脱毛症、水疱、びらん、耳、目、鼻、手足およびBALB / cマウス( 図3)のトランク上のかさぶたのように皮膚病変を誘発する。
組織結合および循環コラーゲン特異的抗体の分析
ウサギIgG、およびマウス補体C3の沈着がdetecアール凍結、病変部周囲の組織切片中のTED(それぞれ図4DおよびE)。表皮下水疱や炎症性浸潤を組織学的試料( 図4F)で見られている。循環ウサギ抗体は、ELISA( 図5)によって分析される。凍結組織および/または器官抽出物は、それらのタンパク質と酵素のコンテンツの異なるアッセイ(MPOアッセイ)によって分析される。
図1。 in vivoでの VII型コラーゲン特異的抗体の受動的伝達によって誘導されたブリスター。ウサギ、ネズミVII型コラーゲンおよびウサギIgGで免疫の全体的なスキームは、免疫血清から精製される。その後、特定の自己抗体は注入/出血スケジュールに従ってマウスに皮下注射する。マウスは、一般的な健康状態や日常の病気の兆候がないかチェックされている。
図2。病原VII型コラーゲン特異的IgGのキャラ。免疫前ウサギ血清を無蒸着でマウスVII型コラーゲン特異的免疫ウサギ血清の結果()でインキュベート塩スプリット正常マウス皮膚切片の分析とで自己抗体の沈着、IF間接真皮表皮接合部(B)は、それぞれ。特異的抗体は、それらが(C、レーン3,4および7)組換えマウスVII型コラーゲンの断片の重複セットをイムノブロットを行った場合に対して提起された抗原を認識しています。
図3。マウスの臨床評価。IgGマウスVII型コラーゲンには、脱毛症、水疱、びらん、痂皮耳、目、鼻、Li等の皮膚病変を誘発するMBSおよびBALB / cマウス(AD)のトランク。無関心タンパク質に対するNRIgG又はABSで注入されたものが0(E)のスコアを持っていたのに対し、特定の自己抗体を注射したマウスは、4のスコアに到達。臨床スコアは以下のように計算した:0、無病変; 1、皮膚表面の1%未満、2、皮膚表面の1〜5%、3、皮膚表面の5〜10%、4、10 - 皮膚表面の20%が影響を受けます。 3日間連続、全体重の5〜10%の重量損失は、最終的なスコアで余分なポイントとしてカウントされます。
図4。ウサギIgG(D)、およびマウス補体C3(E)のVII型コラーゲン特異的IgG。沈着を注射したマウスにおけるヒストグラムと免疫病理学的所見は、病変部周囲の皮膚の凍結切片で真皮表皮接合部にいるのならば、 生体内で直接することによって検出される。皮膚病変部表皮下水疱や炎症infにiltrateは、組織学(F)で見られます。ウサギIgG(A)は、マウス補体C3(B)は、もの付着は、コントロール(C)に見られる表皮下水疱形成はありません。
図5。ウサギ循環抗体のVII型コラーゲン特異的IgGを注射したマウス由来の血漿のイムノアッセイ。血漿レベルをELISA法により測定した。
第1表。疾患のスコアシートを猛烈なスキンは大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください 。
システムの得点:
- 0、無病変;
- 1、皮膚表面の1%未満;
- 2、皮膚表面の1〜5%;
- 3、皮膚のsuの5〜10%rface;
- 4は、皮膚表面の10〜20%が影響を受けます。
得点余分なヒント:
- 最終スコアの17の余分なポイントとして、3日間連続してカウント中に全体重の5〜10%の体重減少。
- 彼らは単に観察の下で撮影、定量化されていない水疱や脱毛症とペアになっていない場合は足で目の周りの耳に紅斑は、ちょうど進行中の免疫反応の最初の徴候である。
- 尾上のマークは、その悪化は必ずしも病気が原因ではないかもしれませんので、彼らは最初から存在しているなら、かまや戦いのマークである可能性があります。それらをカウントするために乗り切る慎重に検討してください!
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Discussion
実験動物への自己抗体の受動的な転送は、その病原性7、-12を実証するための主要なアプローチです。この方法により得られた動物モデルは、自己免疫13の間接的な証拠であることに加えて、病原性機構の遠心性の相の調査を可能にします。後天性表皮水疱症(EBA)の膨れ抗体誘導性顆粒球依存皮膚の受動的伝達モデルは、自己免疫性皮膚疾患における組織損傷のメカニズムを分析するために使用された。これはよくVII型コラーゲンに対する自己免疫の限界を超えて拡張する抗体媒介臓器特異的自己免疫疾患の根本的な、生物学的および臨床的に重要な側面を研究するために絶妙に有益なモデル疾患として、また浮上した。最後に、このモデルは、基底膜の生物学を含む基礎的な生物学的および病態生理学的過程、免疫複合体による顆粒球の活性化を研究するために使用することができるDの補体活性化。
ex vivoで 、動物モデルなど、いくつかの実験的な設定は、自己免疫性皮膚疾患EBAの14のために利用可能であるが、断然顆粒依存性炎症経路を勉強するのが最も適しているのは、動物への自己抗体の受動的な移動である。顆粒球は以前に自己抗体が15と一緒にインキュベート皮膚切片に追加されますex vivoでのモデルとは対照的に、ここでの白血球の浸潤が自発的にマウスで再現されています。我々は、ウサギやヤギなど他の生物における抗原に対して惹起された特異的な抗体で動作するように選択した場合、さらに、私たちは、限られた患者血清の可用性の問題を回避するため、我々はまた、補体活性化および顆粒球動員16を再現するための良いチャンスを持っています。
パッシブ転送モードにおける顆粒球依存ブリスターの正常再生のためのEBAのlは、それが水疱、痂皮と脱毛症びらんを通じて紅斑および浮腫を皮切りに、十分に病気の兆候を獲得できるようにすることが重要です。マウスの評価は、以前に学習する必要があるプロセスです。病気の採点はコラボレーターや援助者による実験を通じて、同一人物によって行われ、常に出向しなければならない。各実験病のための標準化スコアリングシステムの開発と利用は、最も重要なのです。同封のスコアシートは、読者皮膚皮膚病がマウスでどのように評価されるかの洞察力を与える必要があります。
などの映像のように行わとき、自己抗体誘発性表皮水疱のモデルが大幅に自己抗体および組織損傷を生じることによって引き起こさ顆粒依存性炎症経路のさらなる切開を容易にするでしょう。医学研究においては、その値が新しい抗原-Sの開発とテストの有望な視点でサポートされていますpecific T細胞およびB細胞の抗炎症療法を対象とした。最後に、基本的な生物学的にも臨床的に本質的な自己免疫の質問に答えるのに役立つだろう。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者は、フライブルク大学(CSに)医学部からドイツ学術振興SI-1281/4-1とBIOSにからの補助金によって支援を認める。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
recombinant antigen | The plasmids encoding for the recombinant forms of murine collagen VII are available from the corresponding author. | ||
immune rabbit serum | www.eurogentec.com | We had New Zealand White rabbits immunized with 200 μg of antigen, 3 times at 2 week intervals. For this purpose we have used the services of Eurogentec S.A., Belgium. | |
Protein G agarose | Roche Applied Science | 11243233001 | |
Balb/c mice | Charles River Laboratories | ||
OCT compound, Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4583 | OCT, optimal cutting temperature |
Cryomold standard | Sakura Finetek | 4557 | 25 mm × 20 mm × 5 mm |
Cryomold intermediate | Sakura Finetek | 4566 | 15 mm × 15 mm × 5 mm |
Uni-Link-Einbettkassette | R. Langenbrinck | 09-0503 | Histology processing and embedding cassettes |
Spezial-Tatowierfarbe Schwarz | H. Hauptnerund Richard Herberholz GmbH Co. KG | 71492000 | tattooing paste |
Tatowierzange TZ1 | EBECO E. Becker Co GmbH | tattooing device | |
Heparin | Carl Roth GmbH Co. | 7692.1 | |
Formaldehyde 37% | Carl Roth GmbH Co. | 7386 | |
Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | K2753-1G | |
Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | X1251-1G | |
sterile PBS | Biochrom | L182-50 | |
digital camera | Nikon | Coolpix 5400 | |
Syringe driven filter unit 0.45 μm | Millipore | ||
Caliper | Mitutoyo 7309 | 1667338 | Farnell (distributor) |
disease scoring sheet | example enclosed |
References
- Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen. J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).
- Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 225, 401-413 (2011).
- Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes. Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).
- Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage. J. Pathol. 212, 56-65 (2007).
- Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).
- Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).
- Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).
- Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme. Science. 286, 1732-1735 (1999).
- Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice. PLoS One. 7, e31066 (2012).
- Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180. J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).
- Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease. N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).
- Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse. Science. 190, 397-399 (1975).
- Rose, N. R., Bona, C. Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited. Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).
- Sitaru, C. Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita. Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).
- Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin. Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).
- Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice. Immunol. Lett. , (2012).
- Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 224, 234-244 (2011).