Summary
En el modelo animal descrito en el presente trabajo, se purificaron los anticuerpos IgG contra un tramo de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colágeno VII se inyecta repetidamente a ratones que reproducen el fenotipo de formación de ampollas, así como características de la histo-e inmunopatológicos característicos a humanos epidermólisis bullosa adquirida (EBA)
Abstract
Fenómenos autoinmunes se producen en individuos sanos, pero cuando la auto-tolerancia falla, la respuesta autoinmune puede dar lugar a una patología específica. Según Witebsky los postulados, uno de los criterios en el diagnóstico de una enfermedad autoinmune como es la reproducción de la enfermedad en animales de experimentación por la transferencia pasiva de anticuerpos. Para la epidermólisis bullosa adquirida (EBA), un prototipo de órganos específicos enfermedad autoinmune de la piel y membranas mucosas, varios modelos experimentales se establecieron recientemente. En el modelo animal descrito en el presente trabajo, se purificaron los anticuerpos IgG contra un tramo de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colágeno VII se inyecta repetidamente a ratones que reproducen el fenotipo de formación de ampollas, así como funciones de la histo-e inmunopatológicos característicos a humanos EBA 1. El estallido de la enfermedad generalizada se ve generalmente 5-6 días después de la primera inyección y la extensión de la enfermedad se correlaciona con la dosis administrada de la collagen VII-IgG específica. El daño tisular (formación de ampollas) en la EBA experimental depende del reclutamiento y activación de granulocitos de tejido unidas a autoanticuerpos 2, -4. Por lo tanto, este modelo permite la disección de la vía inflamatoria dependiente de granulocitos implicados en el daño tisular autoinmune, como el modelo reproduce sólo las células T independiente de la fase eferente de la respuesta autoinmune. Además, su valor es subrayada por un número de estudios que demuestran el potencial de inducción de blister de autoanticuerpos in vivo e investigando el mecanismo de la formación de ampollas en EBA 1,3, -6. Por último, este modelo facilitará en gran medida el desarrollo de nuevas terapias antiinflamatorias en enfermedades inducidas por el autoanticuerpo. En general, el modelo de transferencia pasiva de los animales EBA es un modelo de la enfermedad accesible e instructivo y ayudará a los investigadores a analizar no sólo la patogenia EBA pero para responder fundamental biológica y clínicamentepreguntas esenciales autoinmunidad.
Protocol
1. Preparación de anticuerpo patógeno
Nota: La purificación y concentración de los anticuerpos se debe realizar en el mismo día, ya que los anticuerpos no son para ser almacenados en 0,1 M de glicina pH 2,5 a 3 (tampón de elución) durante la noche (ON).
Purificación por afinidad de IgG: utilizar 25 ml de suero inmune de conejo:
- Descongele el suero de conejo en a 4 ° C, se mezcla 1:1 con tampón de 1xPBS () y centrifugar a 1260 se xg durante 10 min a 20 ° C. Opcionalmente, una etapa de filtración con papel de filtro podrían ser incluidos después de la centrifugación en caso de que el suero es graso.
- Mientras tanto, lavar la proteína G matriz llena la columna con 10 volúmenes de lecho (volumen del lecho = volumen de la matriz) de 1XPBS (running buffer).
- Aplicar el diluye y se filtra el suero a la columna y se incuba 1 h en la plataforma de agitación a temperatura ambiente (RT).
- Recoger el flujo a través (FT) en un tubo Falcon de 50 ml. No lo deseche hasta que la concentracióny el título de la IgG purificada se conoce.
- Lavar la matriz con 5 volúmenes de lecho de 1XPBS y mientras tanto preparar 50 ml tubos Falcon para la recogida de la fracción eluida con IgG. Pipetear 1 ml de tampón de pH neutralizante: 1 M Tris pH 10 en cada tubo (de lo contrario la proporción de 1:20 tampón TRIS relación a la cantidad de eluato a recoger).
- Aplicar 100-150 ml de tampón de elución: glicina 0,1 M pH 2.5-3 a la columna y recoger 50 ml fracción (s). Da la vuelta al tubo 2-3x, medir el pH y añadir tampón de neutralización hasta que haya alcanzado el pH 7.2-7.4.
- Recoger gotas de eluido IgG y utilizando el tampón de elución como etalón medir la DO a 280 nm. Si el OD es <0,1 recolección de parada.
- Regenerar la matriz de proteína G y almacenarlo siguiendo las instrucciones del fabricante.
Concentración por ultrafiltración Amicon con tubos:
- Lavar el Ultra Amicon (15 ml / 30kDa) tubos de ultrafiltración por centrifugación con 1XPBS min 15-20a 3.220 xg, a 4 ° C. Deseche la FT del Amicon.
- Llenar los Amicons con 15 ml de fracción eluida con IgG y centrifugar durante 25-30 min a 3.220 xg y 4 ° C, el tiempo de centrifugación siempre depende del contenido de proteína del eluato.
- Deseche FT y repetir hasta ultrafiltración tiene ninguna fracción eluida a la izquierda.
- Lavar el concentrado IgG ampliamente, dos veces, con 1XPBS 25-30 min de centrifugación.
- Recoger el "pegajosos", solución de anticuerpo amarillento del filtro Amicon en un volumen final de 1,500-2,000 l de 1XPBS.
- Medir la concentración de preparación de IgG usando un espectrofotómetro o NanoDrop:
Conc. (Mg / ml) = A (280 nm) x factor de dilución / 1,4 - Lavar y almacenar los Amicons siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. La inyección de colágeno VII-IgG específica en ratones
Antes de iniciar el procedimiento experimental actual, asegúrese de que el pro experimentaltocol está escrito y todos los materiales se preparan para el experimento.
- Preparar las hojas de datos para la toma de la enfermedad, las pruebas ELISA, inmunofluorescencia (IF) el análisis y la mieloperoxidasa (MPO) de ensayo 4.
- Etiquete los tubos de sangre y de órganos, así como criomoldes histología procesamiento y la inclusión cassettes.
- Las soluciones de anticuerpos debe ser preparado fresco o descongelado de las existencias y caracterizado con respecto a su reactividad (título por microscopía de IF y / o ELISA). La solución filtrada estéril de anticuerpos debe ser diluido en PBS de manera que la dosis requerida para la inyección varía entre 250-1000 l. Asegúrese de que tiene suficiente IgG para llevar a cabo el experimento.
- Preparar fresco anticoagulante: heparina 20 U / ml y 8,7 mg / ml de ketamina / 1,3 mg / ml de mezcla de xilazina para la anestesia. Al sacrificar los ratones han etiquetado tubos con 3,7% de formaldehído preparado.
- Esterilizar instrumental quirúrgico (bisturí, tijeras, punta fina y Curved forcipes) y preparar jeringas (jeringas de insulina, jeringas de 1 y 2 ml), agujas, cámara digital y tarjeta de memoria adicional.
Nota: Realice todos los procedimientos realizados en ratones narcotizados ketamina / xilazina o isoflurano isoflurano es la opción preferida para la anestesia de los controles diario de la piel, como los ratones se recuperan rápidamente.. Sin embargo, cuando se toman fotografías ketamina, 87 mg / kg y 13 mg xylazina / kg generalmente se inyecta por vía subcutánea. Para la eutanasia la dosis de ketamina / xilazina se aumenta a 130 mg / kg de ketamina y xilazina 20 mg / kg.
- Compruebe los animales ya marcados por su estado general de salud, la piel y la apariencia de piel, pesarlos y medir su espesor de la oreja (siempre se adhieren a la misma oreja).
- Registrar los valores observados y los cambios en la hoja de evaluación clínica.
- Recoger 20-30 l (2-3 gotas) de sangre de la vena de la cola en una jeringa que contiene el mismo volumen de anticoagulante.
- Desinfecte la piel ypiel con 80% de etanol.
- Se inyecta la solución de anticuerpo por vía subcutánea en la parte posterior usando una jeringa de insulina. (Para determinados sitios (por ejemplo, de las orejas) sólo volúmenes pequeños (10-50 l) son factibles de ser inyectado.)
Las inyecciones se repetirán cada segundo día, 4 veces. Balb / c y ratones C57BL6 de un peso corporal de aproximadamente 20 g comenzar a desarrollar la enfermedad 3-4 días después de la primera administración de 400-500 hasta 750 mg / g de peso corporal / inyección autoanticuerpos.
Al terminar el experimento:
- Poner los ratones bajo anestesia profunda mediante la inyección de 130 mg / kg y 20 mg / kg de ketamina / xilazina por vía subcutánea, ellos exsanguinate de la vena cava posterior y cortar el corazón.
- Recoger muestras de tejidos / órganos como la piel: rabo, las orejas, la sangre y el esófago y los pusieron en tubos previamente marcados y llenos de formaldehído PBS o el 3,7%.
Al volver a lalaboratorio:
- Se centrifuga la sangre a 1.200 xg, 10 min a TA para separar el plasma, el plasma transferir a tubos adecuadamente etiquetados y almacenarlos en consecuencia.
- Insertar la biopsia de piel en medio de la temperatura óptima de corte utilizando criomoldes correctamente, la etiqueta, y almacenar a -80 ° C.
- Coloque las muestras de tejidos destinados a la histología en los moldes de incrustación etiquetados y mantenerlos en el 3,7% de formaldehído hasta la inclusión en parafina.
3. Evaluación clínica de la gravedad de la enfermedad
Los ratones se examinaron diariamente para las lesiones de la piel y las mucosas y los resultados deben registrarse utilizando formularios correspondientes. Los criterios para una eutanasia precoz es lesiones de la piel que afecta a más que 20% de la superficie corporal y una pérdida de peso del 5-10% del peso corporal total en tres días consecutivos, contando para una puntuación de la enfermedad de 5 (Tabla 1).
- Coloque el cursor sobre su vientre. Comenzar con el área de la cabeza, es decir, con el derechooído y comprobar para ampollas, erosiones, costras en el interior así como en el lado exterior. Continúe de la misma manera con el oído izquierdo.
- Los ojos derecho e izquierdo son controlados para detectar signos de eritema, alopecia, erosiones y / o corteza.
- Frente y el área hocico se cepillan a través siguiente, continuando con la parte ventral de la boca, los labios y la mucosa de la boca.
- Examine la pata delantera derecha a partir de la pata, moviéndose hacia arriba, cambiar a la pata delantera izquierda. El mismo procedimiento que con las patas traseras derecha e izquierda.
- Cepille a través de la piel en el cuello y la zona de la espalda con unas pinzas de punta fina curva.
- Ponga el ratón sobre su espalda y comprobar la parte ventral, así como los lados ventrales de las extremidades de la misma forma que anteriormente.
- Compruebe la cola.
- Tome fotos de las partes del cuerpo pertinentes cuando los ratones desarrollan la enfermedad. Se debe prestar atención a la calidad y cantidad de las imágenes.
- Calcular los resultados clínicos de la enfermedad.
4. Análisis de muestras de piel y Plasma
- Elaborar, almacenar y / o procesar todos los tejidos recogidos de acuerdo con el plan.
- Corte secciones de tejido congeladas por si la detección de anticuerpos de conejo y de ratón componentes del sistema del complemento.
- Analizar los diferentes contenidos de proteína y enzima (MPO ensayo) de tejido congelados y / o extractos de órganos.
- Sección el tejido embebido en parafina y tinción con H & E para visualizar la magnitud del daño tisular.
- Analizar el plasma por ELISA, inmunotransferencia.
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Representative Results
La transferencia pasiva de anticuerpos específicos de antígenos resultado de una enfermedad por completo soplado en ratones, se asemejan a los niveles clínicos, histológicos e inmunopatológicos la EBA humana. Las ampollas, costras y alopecia, erosiones desarrollar en las orejas, el hocico, patas, piernas, espalda y alrededor de los ojos de los ratones. Los primeros signos clínicos de la enfermedad es muy probable que aparezcan en los oídos y / o área de la cabeza. La deposición de IgG específica de conejo, ratón y complemento C3 es detectado por IF directa en la unión dermo epidérmica en criosecciones de piel perilesional. En ampollas en la piel lesional subepidérmicas e infiltrado inflamatorio son vistos por histología.
Sin embargo, si la inyección de colágeno VII patógenos anticuerpos específicos se interrumpe, la actividad de la enfermedad se vuelve gradualmente más baja, y dentro de varias semanas curar las lesiones. No obstante, un cierto grado de postinflamatoria alopecia cicatricial puede persistir indefinidamente.
Characterizción del autoantígeno recombinante (y de microorganismos patógenos IgG)
Murino colágeno específico IgG se une a la unión dermo-epidérmica (Figura 2B). La especificidad se evaluó mediante inmunotransferencia (Figura 2C, carriles 3, 4 y 7).
Puntaje actividad de la enfermedad
La evaluación clínica de la enfermedad se basa en un sistema de puntuación que hemos desarrollado (Tabla 1): 0, sin lesiones; 1, menos del 1% de la superficie de la piel; 2, 1-5% de la superficie de la piel; 3, 5 - 10% de la superficie de la piel; 4, 10-20% de la superficie de la piel se ve afectado. Murino IgG contra el colágeno VII induce lesiones cutáneas tales como eritema, alopecia, ampollas, erosiones, costras en las orejas, los ojos, el hocico, las extremidades y el tronco de ratones Balb / c (Figura 3).
Análisis de tejido consolidados y circulando específicos de colágeno-anticuerpos
La deposición de IgG de conejo, ratón y complemento C3 son detecdo en las secciones congeladas de tejido perilesional (Figura 4 D y E, respectivamente). Las ampollas subepidérmicas y se infiltran en el inflamatoria se observa en las muestras histológicas (Figura 4F). Circulan anticuerpos de conejo se analizó por ELISA (Figura 5). De tejido congelado y / o extractos de órganos se analizan mediante ensayos diferentes para su contenido de proteínas y enzimas (ensayo MPO).
Figura 1. Esquema general de la formación de ampollas in vivo inducida por la transferencia pasiva de colágeno VII-anticuerpos específicos. Conejos son inmunizados con colágeno murino VII e IgG de conejo se purifica a partir de los sueros inmunes. Posteriormente, los autoanticuerpos específicos se inyectan subcutáneamente en ratones después de una inyección / calendario de sangrado. Los ratones se están comprobar que su estado general de salud y signos de la enfermedad diarias.
Figura 2. Caracterización de cepas patógenas de colágeno VII-IgG específica. IF indirecta de análisis normales divididos sal secciones de piel de ratón incubados con suero de conejo pre-inmune y murinos con colágeno VII resultados específicos inmune de conejo en suero en ninguna deposición (A) y la deposición de autoanticuerpos en la unión dermo epidérmica (B), respectivamente. Los anticuerpos específicos reconocen el antígeno (s) que se produjeron contra cuando inmunoblot con un conjunto de la superposición murina recombinante fragmentos de colágeno VII se lleva a cabo (C, carriles 3, 4 y 7).
Figura 3. La evaluación clínica de los ratones. Murino IgG a colágeno VII induce lesiones cutáneas tales como la alopecia, ampollas, erosiones, costras en las orejas, los ojos, hocico, limbs y el tronco de ratones Balb / c (AD). Los ratones inyectados con anticuerpos específicos alcanzar una puntuación de 4, mientras que los inyectados con NRIgG o Abs contra una proteína indiferente tuvo una puntuación de 0 (E). La puntuación clínica se calculó como sigue: 0, sin lesiones; 1, a menos de 1% de la superficie de la piel; 2, 1-5% de la superficie de la piel; 3, 5-10% de la superficie de la piel; 4 10, - 20% de la superficie de la piel se ve afectado. Pérdida de peso del 5-10% del peso corporal total durante tres días consecutivos como cuenta un punto extra en la calificación final.
Figura 4. Hallazgos Histo-y inmunopatológicas en ratones inyectados con colágeno VII-IgG específica. La deposición de IgG de conejo (D), y el ratón complemento C3 (E) es detectada por IF directa en la unión dérmica epidérmico en criosecciones de piel perilesional, in vivo. En ampollas en la piel lesional y subepidérmicas inf inflamatoriailtrate es visto por la histología (F). No deposición de IgG de conejo (A), ratón complemento C3 (B), ni es la formación de ampollas subepidérmicas visto en los controles (C).
Figura 5. Niveles de inmunoensayo de plasma de ratones inyectados con colágeno VII-IgG específica. Plasmáticas circulantes de anticuerpos de conejo fueron medidos por ELISA.
Tabla 1. Piel ampollas hoja enfermedad de puntuación. Haga clic aquí para ampliar la tabla .
Sistema de puntuación:
- 0, sin lesiones;
- 1, a menos de 1% de la superficie de la piel;
- 2, 1-5% de la superficie de la piel;
- 3, 5-10% de los su pielrface;
- 4, 10-20% de la superficie de la piel se ve afectado.
Consejos adicionales cuando PUNTUACIÓN:
- Pérdida de peso del 5-10% del peso corporal total durante tres días consecutivos como cuenta un punto extra en la calificación final 17.
- Eritema en las orejas, alrededor de los ojos en las patas son sólo los primeros signos de una reacción inmune en curso, si no se combina con ampollas o alopecia no están cuantificados, acaba de tomar en observación.
- Las marcas en la cola podría ser mordida o marcas de lucha, por lo que si están presentes desde el principio su empeoramiento no necesariamente podría ser debido a la enfermedad. Considere cuidadosamente capear para contarlas!
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Discussion
La transferencia pasiva de anticuerpos en animales de experimentación es un enfoque importante para demostrar su patogenicidad 7, -12. Los modelos animales obtenidos a través de este método, además de ser la evidencia indirecta de la autoinmunidad 13, permitir la investigación de la fase eferente de los mecanismos patogénicos. El modelo de transferencia pasiva de anticuerpos inducidos por granulocitos dependiente de la formación de ampollas en la piel epidermólisis bullosa adquirida (EBA) fue utilizado para diseccionar los mecanismos de daño tisular en dermatosis autoinmunes. Se supo también, como una enfermedad modelo exquisitamente instructivo estudiar fundamentales, biológica y clínicamente aspectos cruciales de las enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos órgano-específicas que van más allá de los límites de la autoinmunidad contra el colágeno VII. Por último, este modelo puede ser usado para estudiar los procesos biológicos fundamentales y patofisiológicos, incluyendo la biología de la membrana basal, la activación de granulocitos por complejos inmunes und activación del complemento.
Aunque varios parámetros experimentales, incluyendo ex vivo y modelos animales, están disponibles para la enfermedad autoinmune de la piel EBA 14, con mucho, el más adecuado para estudiar las vías inflamatorias dependientes de granulocitos es la transferencia pasiva de anticuerpos en animales. En contraste con el modelo ex vivo, donde los granulocitos se añaden a las secciones de piel previamente incubados con los autoanticuerpos 15, aquí la infiltración de leucocitos se reproducen espontáneamente por los ratones. Por otra parte, si decidimos trabajar con anticuerpos específicos dirigidos contra el antígeno en otros organismos, como el conejo y la cabra, evitamos el problema de la limitada disponibilidad de sueros de pacientes y también tenemos una mejor oportunidad de reproducir la activación del complemento y el reclutamiento de granulocitos 16.
Para el éxito de la reproducción de granulocitos dependiente de la formación de ampollas en el modo de transferencia pasival de EBA, es importante ser capaz de marcar adecuadamente los signos de la enfermedad, a partir de eritema y edema a través de ampollas, erosiones con costras y alopecia. La evaluación de los ratones es un proceso que necesita ser aprendida previamente. La puntuación de la enfermedad tiene que ser realizada por la misma persona, durante todo el experimento y apoyada siempre por un colaborador o persona ayuda. El desarrollo y uso de un sistema de puntuación normalizado para cada enfermedad experimental es de la mayor importancia. La hoja de registro adjunta debe dar al lector una idea de cómo se evalúan las dermatosis de piel en ratones.
Cuando se realiza como se muestra en el video, el modelo de autoanticuerpos inducida por la formación de ampollas subepidérmicas facilitará en gran medida la disección posterior de las vías inflamatorias granulocitos y dependientes provocados por autoanticuerpos y que resulta en daño a los tejidos. Su valor en la investigación médica con el apoyo de la perspectiva prometedora de desarrollo y prueba de nuevo antígeno-sESPECÍFICA T y de células B dirigida terapias antiinflamatorias. Por último, le ayudará a responder fundamentales biológica y clínicamente autoinmunidad preguntas esenciales.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores reconocen el apoyo de subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 y BIOSS de la Facultad de Medicina de la Universidad de Friburgo (para CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| recombinant antigen | The plasmids encoding for the recombinant forms of murine collagen VII are available from the corresponding author. | ||
| immune rabbit serum | www.eurogentec.com | We had New Zealand White rabbits immunized with 200 μg of antigen, 3 times at 2 week intervals. For this purpose we have used the services of Eurogentec S.A., Belgium. | |
| Protein G agarose | Roche Applied Science | 11243233001 | |
| Balb/c mice | Charles River Laboratories | ||
| OCT compound, Tissue-Tek | Sakura Finetek | 4583 | OCT, optimal cutting temperature |
| Cryomold standard | Sakura Finetek | 4557 | 25 mm × 20 mm × 5 mm |
| Cryomold intermediate | Sakura Finetek | 4566 | 15 mm × 15 mm × 5 mm |
| Uni-Link-Einbettkassette | R. Langenbrinck | 09-0503 | Histology processing and embedding cassettes |
| Spezial-Tatowierfarbe Schwarz | H. Hauptnerund Richard Herberholz GmbH Co. KG | 71492000 | tattooing paste |
| Tatowierzange TZ1 | EBECO E. Becker Co GmbH | tattooing device | |
| Heparin | Carl Roth GmbH Co. | 7692.1 | |
| Formaldehyde 37% | Carl Roth GmbH Co. | 7386 | |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | K2753-1G | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | X1251-1G | |
| sterile PBS | Biochrom | L182-50 | |
| digital camera | Nikon | Coolpix 5400 | |
| Syringe driven filter unit 0.45 μm | Millipore | ||
| Caliper | Mitutoyo 7309 | 1667338 | Farnell (distributor) |
| disease scoring sheet | example enclosed |
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