Summary
Fremgangsmåde til sporing synaptisk forbundne neuroner er beskrevet. Vi anvender TVA specificitet af en opstrøms celle til at probe, om en cellepopulation af interesse modtager synaptisk input fra genetisk definerede celletyper.
Abstract
Klassiske metoder til at studere neuronale kredsløb er forholdsvis lille produktion. Transsynaptisk vira, især pseudorabiesvira (PRV) og rabiesvirus (RABV), og for nylig vesikulær stomatitis virus (VSV), til undersøgelse af kredsløb, bliver stadig mere populære. Disse højere throughput metoder bruger virus, der sender mellem neuroner i enten anterograd eller retrograd retning.
For nylig blev en modificeret RABV for monosynaptiske retrograde tracing udviklet. (Figur 1A). I denne fremgangsmåde er glycoprotein (G)-gen er fjernet fra det virale genom, og resupplied kun i målrettede neuroner. Infektion specificitet opnås ved at substituere et kimært G, der består af det ekstracellulære domæne af ASLV-A glycoprotein, og det cytoplasmatiske domæne af RABV-G (A / RG), til den normale RABV-G 1. Dette kimære G specifikt inficerer celler, der udtrykker TVA receptor 1. Genet, der koder TVA kan blevet delivered ved forskellige fremgangsmåder 2-8. Efter RABV-G infektion af en TVA-udtrykkende neuron kan RABV sender til andre, synaptisk forbundne neuroner i en retrograd retning af natur af sin egen G, som var co-leveres med TVA-receptoren. Denne teknik mærker et relativt stort antal indgange (5-10%) 2 på en defineret celletype, der giver et udsnit af alle de input ned på en defineret starter celletype.
Vi har for nylig ændret denne teknik til at bruge VSV som en transsynaptisk sporstof 9. VSV har flere fordele, herunder den hurtige genekspression. Her har vi detaljeret et nyt viralt sporingssystem hjælp VSV nyttige til probning microcircuitry med forøget opløsning. De oprindelige offentliggjorte strategier Wickersham et al. 4 og Beier et al. Ni tillader mærkningen af neuroner, der projicerer inficeret oprindeligt-TVA-udtrykkende-celler, her VSV blev manipuleret til kun at transmittere til tvA-udtrykkende celler (Figur 1B). Viruset først pseudotype med RABV-G for at tillade infektion af neuroner nedstrøms for TVA-udtrykkende neuroner. Efter infektion af denne første population af celler, frigivet virus kan kun inficere TVA-udtrykkende celler. Fordi transsynaptisk viral spredning er begrænset til TVA-udtrykkende celler, tilstedeværelsen eller fraværet af forbindelse fra definerede celletyper kan undersøges med høj opløsning. En eksperimentel rutediagram af disse eksperimenter er vist i figur 2. Her viser vi en model kredsløb, at retningsændring-selektivitet i muse retina. Vi undersøger forbinde starburst amacrine celler (SAC) til retinale ganglieceller (rGCS).
Protocol
1. Making Virus fra cDNA: Inddrivelse af VSV fra cDNA ved hjælp Vaccinia-T7 System 10
- En dag før forsøget opdele BsrT7 celler i 60 mm skål indeholdende DMEM + 10% FBS. Seed 2E6 celler pr skål. BsrT7 celler stammer fra BHK21, eller babyhamsternyre, celler.
- Varmt PBS med 1 mM magnesium og 1 mM calcium til 37 ° C.
- Opnåelse af en lille prøve vTF7-3, en vacciniavirus, som udtrykker T7-polymerase, og optøning til stuetemperatur. vTF7-3 er et infektiøst vacciniavirus, der udtrykker T7-polymerase 11 og bør kun anvendes i biosikkerhedsniveau 2 indeslutning. Dette ekspressionssystem anvendes til at generere maksimale niveauer af de ønskede transkripter fra plasmider transficeret i trin 1.9. Vortex virus i 30 sek ved maks. hastighed. Sonikeres i en bordplade sonikator i 2 minutter i vandbad ved stuetemperatur. Vortex igen for 30 sec at bryde op virale klumper.
- Fjern medier fra BSRT7 celler.
- Tilsættes 11,7 pi vTF7-3til 600 pi PBS med magnesium og calcium og tilsæt blandingen på cellerne.
- Bevæge pladerne i en 34 ° C inkubator med 5% CO2. Rock plader forsigtigt en gang hver 10 min.
- Efter 45 minutter er gået, begynder transfektion. Tilsæt 20 gl lipofectamin 2.000 til 1 ml DMEM og blandes. Vent 5 min.
- Tilsættes 5,25 ug pN, 2.3 ug pP, 1,2 ug pl, 1 ug pCAG RABV-G, og 6 ug VSV-genomisk cDNA med 500 pi DMEM. PN, PP og pl, er plasmider driver ekspression af VSV-virale gener under T7-promotoren 10 med mængder fastsat empirisk for optimal redning af virus.
- Kombiner begge rør og bland. Vent 15 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern PBS og vaskes pladerne én gang med 1,5 ml DMEM.
- Sug skylles mediet. Tilføj transfektion mix til tallerken. Flytte pladerne til 34 ° C inkubator.
- Vent 5 timer, derefter fjerne mediet.
- Skifte medie til 4 ml DMEM + 2% FBS + 1x penicillin-streptomycin + 10 mM HEPES pH 7,4. Tilsætningen af Penicillin-streptomycin, for at undgå kontaminering, og HEPES, til opretholdelse af pH af mediet, er meget vigtige. The FBS indhold kan faldet til 2%, da cellerne vil blive ødelagt i løbet af få dage af virusset, og derfor ikke behøver 10% FBS.
- Sted pladerne i 34 ° C inkubator i 48-72 timer.
- Samle alle ved 3 og 6 dage efter transfektion og straks sprøjte filtreres gennem et 0,20 um filter. Denne størrelse filter fjerner det vacciniavirus, men ikke VSV.
- Da vi ønsker at levere RABV-G til den virale kappe, og genomet ikke koder for RABV-G-gen, skal det kontinuerligt tilføres in trans. For at gøre dette, lave en særskilt plade af 293T TVA800 (TVA800) celler. Disse er celler, som konstitutivt udtrykker TVA-receptoren, tillader ENVA-medieret virusinfektion 12. Ved 80% konfluens, skifte medie til DMEM alene, derefter transficere cellerne med 5 ug plasmid, der koder G-protein (dvs. pCAG RABV-G) per plade. Vi bruger PEI transfektionsreagens, en polykationisk polymer, som er meget billigere end sammenlignelige lipid-baserede metoder. Imidlertid kan lipofectamin også anvendes effektivt til dette formål. Den optimale PEI: DNA-forhold skal bestemmes empirisk. Gør dette i et separat eksperiment med en fluorescerende reporter, dvs pCAG GFP. Vi bruger 10 pi PEI: 4 ug DNA.
- Anvende supernatanten fra trin 16 på den transficerede plade af TVA800 celler.
- Observere denne plade den følgende dag for tegn på fluorescensen af viralt udtrykt fluorofor. Viral fluorescens først observeret som en enkelt celle, og gradvist spreder sig over tid (dvs. figur 3). Virus skal spredes inden for få timer.
2. Passage og koncentration af VSV
- Split TVA800 celler ind medier indeholdende DMEM + 10% FBS sådan, at du vil have fire 10-cm plader på ~ 80% sammenflydning den næste dag. 293T-baserede celler fungerer godt på grund af deres høje transfectability, og anvendelsen af TVA-udtrykkende celler øger den hastighed, hvormed cellerne i skålen blive inficeret. Andre meget transfectable cellelinjer kan tjene det formål så godt.
- Ved 80% konfluens, skifte medie til DMEM alene, derefter transficere cellerne med 5 ug plasmid, der koder for G-protein, der skal bruges (f.eks pCAG RABV-G) per plade. Vi bruger PEI, men FUGENE / lipofectamin arbejde.
- Vent en dag efter transfektion for glycoprotein ekspression / overflade akkumulering. Ændre mediet (5 ml / plade) til DMEM + 10% FBS, derefter inficeres med rVSV (A / RG) virus ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 0,01 <x <0,1.
- Kontrollere mængden af infektionen 24 timer senere. Du bør se inficerede celler (identificeret af GFP-fluorescens), nogle med omgivende pletter af inficerede celler (dvs. figur 3). Typisk er det kun værd at indsamle supernatanten, hvis du ser> 50% af cellerne inficeret, ellers de virale titere obtained fra koncentration vil være suboptimal.
- Hvis> 50%, indsamle de 5 ml medium / plade, og erstat med 5 ml frisk medium. Hvis der er for få celler er smittet, vente endnu 12-24 timer, og tjek igen. Fryse de opsamlede supernatanter ved -80 ° C.
- Saml hver 24 timer derefter i 3 dage, i alt 4 dage.
- Alt i alt, hvis du startede med 4 plader, bør du have 20 ml af medier fra hver dag - så 80 ml total, eller 2 ultracentrifuge rør til en værdi af supernatant. Tø supernatanterne ved 37 ° C og filtreres end 0,45 um filtre på is. Portion 36 ml af virus til Beckman centrifugerør.
- Koncentrere supernatanten (21.000 K i en SW28 rotor (= 80000 x g) i 90 minutter) ved 4 ° C. Dekanteres i et bægerglas indeholdende 10% blegemiddel, og når røret er inverteret, anvendes en aspirator at fjerne så meget medier fra siden af røret som muligt.
- Mens dækket. ryste de virale rør ved 4 ° C i 1 time. En standard rysteapparat ved about 120 rpm er tilstrækkelig.
- Forsigtigt tritureres pellet i det resterende medie ved forsigtigt at pipettere op og ned 30 gange. Vær forsigtig med ikke at indføre luftbobler. De resterende medielydstyrken bør være omkring 30 ul. Alikvot denne mængde i flere rør for at forhindre flere fryse-tø cykler for en given bestand, da dette kan resultere i et fald i viral titer. Disse aliquoter kan fryses ved -80 ° C.
- Titrere virus. Titrering på omkring 2 dage efter infektion er optimal. Initial infektion kan observeres i løbet af få timer, men du får en underrepræsentation af titer hvis du venter kun 1 dag. For at opnå den virale titer, udføre en begrænsende fortynding eksperiment af koncentreret virus til den passende cellelinie (293T-celler fungerer godt) i en 24-brønds plade, fortynding af virus 10 gange 1-1: 1.000.000. Titerne vi får er typisk i området fra 10 8 -10 10 fokusdannende enheder (FFU) / ml.
3. Viros Injektion
- Vi anvender mus, typisk mellem 6-10 uger gamle, til disse eksperimenter. Enhver alder hvorefter kredsløb er etableret ville være tilstrækkeligt. Vi vil vælge den transmission fra retinale ganglieceller (rGCS) til starburst amacrine celler (SAC) som et eksempel. Dette eksperiment, som et diagram i figur 2, kræver en tredobbelt transgent dyr, og kun en enkelt injektion af virus. (Alle viste procedurer blev godkendt af IACUC ved Harvard Medical School, og var i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer).
- Dels de korrekte dyr skal genereres. Målet er at have TVA udtrykt i den celletype, som man ønsker at kortlægge til, ved hjælp af en virus (dvs. adeno-associeret virus, AAV), eller af en transgen allel. Celletypen specificitet opnås sædvanligvis ved Cre-ekspression. Her vi også krydses i en betinget ekspression TVA allel 7 til en cholinacetyltransferase (ChAT)-Cre-allelen 13, således at TVA udtrykkesi alle celler med en Cre udtryk historie (de særlige bevaringsområder). Vi krydsede også et betinget udtryk tdTomato allel (R26TdT) til visualisering af TVA-udtrykkende celler.
- Koordinaterne for injektionen placering skal identificeres. Disse koordinater af interesse kan findes i en hjerne atlas, dvs Franklin og Paxinos musehjerne atlas 14. Disse koordinater skal bemærkes forhold til en given lokalitet på musen kraniet. Vi bruger bregma, men enhver koordinatsystem er tilstrækkelig.
- Forbered stereotaktisk apparat. Tænd for microinjector controller, og bevæge stemplet og elektrode holder på plads. Derefter back-fill kanylen med mineralolie for at tilvejebringe en grænseflade med viruset. Før kanylen derefter på stemplet og sikre, at ingen luftbobler forbliver i nålen.
- Optø virus, og anbring på is for at forhindre et fald i viral titer. Sæt microinjector "trækker sig", og flyt tuben af virus, således at der er contacting kapillarrøret på microinjector. Træk den nødvendige mængde af rVSV (A / RG) pseudotype med RABV-G til eksperimentet.
- Dyrene får en præoperativ dosis af buprenorphin (0,05-0,1 mg / kg) før operationen begynder. For at bedøve dyret, enten isofluran inhalering eller en intraperitoneal injektion af en ketamin (40-80 mg / kg) og xylazin (5-10 mg / kg) blandingen er tilstrækkelig. Valget af anæstetikum er afhængig af brugeren. En tå knivspids udføres derefter for at sikre, at dyrene er fuldt bedøvet, hvis dyret ikke reagerer, kan du fortsætte med proceduren. Vær sikker på at få ordentlig licenser, før du bruger disse lægemidler.
- Dyrene anbringes på en opvarmet pude, som er stablet på et bevægeligt stativ til placering af musen. Dyret forbliver der under hele den kirurgiske procedure. Anvendelse øjensalve for at forhindre udtørring af hornhinden, mens dyret er bedøvet.
- Musen hoved så skal stabiliseres i stereotaksiske enpparater. Bruge øret søjler på stereotaktisk apparat til at sikre, at hovedet er grundigt fastgjort, således at hovedet er parallelt med jorden, og roterer ikke sideværts. Når dette er fuldført, skal du justere bid bar til at stabilisere hovedet.
- Dyrets pels er barberet i området af indsnit på toppen af hovedet. Dette område er derefter vasket tre gange med ethanol, efterfulgt af tre gange med iod. Et snit udføres derefter i huden med en skalpel, afslører kraniet.
- Når først musen og injektion setup fremstilles, bregma skal placeret. Dette er det område i midten af hovedet, at det sagittale og to coronal suturer mødes. Når dette område er beliggende, kan instrumenterne i det stereotaktisk apparat anvendes til at justere microinjector til de rigtige koordinater. Her vil vi indsprøjte den laterale geniculate nucleus (LGN), ved hjælp af koordinater A / P -2,46 fra bregma, L / M 2, D / V 2,75.
- Når koordinaterne er blevet ringet ind, skal boret samles.Placer boret ind i boret, og tænd derefter boret. Et lille hul skal bores i stedet identificeret som injektionsstedet. Vær meget blid med boret for ikke forårsage skader på hjernen parenkym. Når knoglen er meget tynd, blodkar på dura blevet klar. På dette tidspunkt, laves der forsigtigt kanterne af kraniotomi med en lille (30 gauge) nål og et fint (# 5) pincet til at fjerne den resterende knogle.
- Juster kapillarrøret til en position lige dorsal af hjernen overflade, hvor hullet er netop boret. Nålen skal være skarp nok til at trænge ind i dura mater med lethed. Derefter sænke nålen til den ønskede dybde, og begynde injektion. Vi injicere virus med en hastighed på 100 nl / min.
- Injektionsproceduren til dette punkt tager omkring ti minutter. Efter injektion, er nålen i hjernen i omkring syv minutter. Dette er vigtigt, da det tillader diffusion af virus fra injektionsstedet. Hurtigt fjernes nålen danner injeIndsatsen sted resulterer i et reduceret infektionseffektivitet på injektionsstedet, og infektion langs nålen tarmkanalen.
- Nålen er meget langsomt hæves fra injektionsstedet, over en levetid på omkring to minutter. Dette er igen bestemt til at reducere infektion langs nålen tarmkanalen.
- Når fjernet, huden sutureres. Dyrene overvåges løbende, indtil de komme sig fra anæstesien. Buprenorphin (0,05-0,1 mg / kg) indgives hver 12 timer i 2 dage.
4. Høst Tissue / vævspræparat
- For at høste væv af interesse, afhænger det optimale tidspunkt på målene for eksperimentet. Generelt kan VSV transsynaptisk spread først bemærkes med mindre end 24 timer efter injektion. Dog vil vente længere tider resultere i mere spredt.
- At høste nethinden, bliver dyrene første gang aflives med kuldioxid indånding og cervikal dislokation udføres. Øjeæblet fjernes derefter, og anbringes i et rør conopretholdelse af 4% formaldehyd i PBS i 1 time ved stuetemperatur.
- Øjeæblet anbringes derefter i en petriskål med PBS. Nethinden derefter dissekeres væk fra andre væv.
- For hele mount analyse, er det retinae skåret således at ligge fladt, placeret på en glasplade og derefter monteret med forlænge guld montering medier og dækket med et nul-tykkelse dækglas. Silicone afstandsstykker er placeret mellem glideren og dækglasset for at minimere trykkræfter på nethinden. For afsnit analyse, nethinden placeret i 30% sucrose i PBS indtil nethinden dykker. Det anbringes derpå i en blanding af 50% oktober og 50% 30% saccharoseopløsning i 3 timer. Det derefter lynfrosset og holdt ved -80 ° C indtil parat til at skære.
5. Repræsentative resultater
Den virus, der er reddet fra cDNA bør være i stand til at inficere TVA800 celler, men ikke 293T-celler (figur 3). Forsyning af RABV-G tillader infektion af multiple celle types, herunder 293T. Eftersom A / RG genomet kodes i genomet, spredes blandt celler forekommer ved en meget højere i TVA-udtrykkende celler.
Når først virussen er koncentreret, typisk titre i området mellem 10 8 ffu / ml og 10 10 ffu / ml. Disse titre er egnede til anvendelse in vivo.
Under LGN injektion i mus, kan vi ikke skelne mellem dorsal LGN (dLGN) fra ventral LGN (vLGN), som begge smittet bliver typisk. Derfor bliver flere RGC typer mærket (Figur 4), herunder dem, projekt til vLGN, såsom melanopsin rGCS (figur 4D) og ON-DSGCs (figur 4E), og dem, der projekt til dLGN, såsom små- arbor rGCS (figur 4C) og ON-OFF-DSGCs (Figur 4F). Selv om mere end én type RGC overført virus til habitatområderne, som rapporteret andetsteds (Beier et al., I revision), her er vi kun fokusererpå de velundersøgte forbindelser af on-off-DSGCs til habitatområderne.
Når vi injicere mus af genotypen cTVA (+) / ChAT-Cre (-), hvor der ikke TVA skal udtrykkes, er det kun rGCS mærket (dvs. figur 4). Dette skyldes indledende optagelse af RABV-G pseudotype virus fra rGCS, og ingen spredning sker. Ingen rGCS inficeres fra en LGN infektion af rVSV (A / RG) virus ikke pseudotype med RABV-G, på grund af en manglende evne af disse virioner i tværgående de lange axoner af disse rGCS. Men når injektionen cTVA (+) / ChATCre (+) (og R26TdT (+)) mus i LGN, er viral spredning forekommer, kun røde celler, som udtrykker Cre-reporter (dvs. figur 5). Disse celler også co-etiket med anti-ChAT-antistof, og stratificere kun i de to ChAT lag, der bekræfter deres identitet som habitatområder (Figur 5B ', C'). Antallet af viralt mærkede SAC pr DSGC varierede 1-9.
Figur 1. Vores retrograd transsynaptisk sporingssystem i forhold til den oprindeligt udviklede metode. (A) (i) i fremgangsmåden udviklet af Wickersham og kolleger, "starter celler" transficeres med tre gener: Den TVA-receptor, der anvendes til at muliggøre infektion specifikt af transficerede celler, den RABV-G, anvendes til at supplere RABV, som selv havde G-gen er fjernet, og et rødt fluorescerende protein til at identificere transficerede celler. (Ii) En RABV pseudotype med A / RG-protein inficerer TVA-udtrykkende celler, så de bliver gul. (Iii) Retrograd transsynaptisk transmission sker til opstrøms neuroner. (B) (i) I vores fremgangsmåde, er TVA-udtrykkende celler er defineret genetisk, og er mærket med en betinget rødt fluorescerende protei. (ii) "starter celler" er dem, inficeret med en VSV koder for A / RG-gen i det virale genom. Disse starter celler udtrykker ikke TVA-receptoren. (Iii) Retrograd transsynaptisk transmission sker til TVA-udtrykkende neuroner, hvis disse celler giver synaptisk input på de starter neuroner. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Skematisk af den eksperimentelle procedure. (A) For det første er den virus reddet fra cDNA. Det er derefter passeret og pseudotype med RABV-G og koncentreret og titreret. Dette virus er derefter sprøjtet ind i hjernen, hvor det tillades at inkubere i det ønskede tidsrum. Efter dettetid, er øjet høstes, og nethinden dissekeret og analyseret. (B) Skematisk af pseudotyping virus med RABV-G. Dette er nødvendigt for infektion af retina-ganglieceller fra en hjerne injektion. The RABV-G-genet først transficeret ind i vævskulturceller, der udtrykker TVA-receptoren. Disse celler inficeres derefter med rVSV (A / RG) virus. De frigivne virioner vil have RABV-G i viruskappen, men ikke har genet for RABV-G i det virale genom. (C) En skematisk af musen krydser nødvendig for tredobbelte transgene dyr. Betingede TVA og tdTomato alleler er krydset med en Cre driver af valg, således at både TVA og tdTomato udtrykkes kun i celler med et Cre ekspression historie. I dette eksempel anvendte vi ChAT-Cre. (D) En skematisering af retinal infektion for at spore DSGC-SAC kredsløb. Chatten celler er lavet til at udtrykke TVA og tdTomato, som vist i (C). RGCS smittes fra en LGN iinfektion af virus produceret i (B). Da virus udtrykker GFP, vil disse rGCS være grøn. Virus vil derefter sprede kun TVA-udtrykkende ChAT amacrine celler, hvis de er forbundet med det mærkede RGC. Disse celler vil være både rød og grøn eller gul. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Behavior af rVSV (A / RG) virus på 293T og TVA800 celler. Disse celler blev inficeret med en lav titer rVSV (A / RG) pseudotype med RABV-G. The virus spredes mellem TVA-udtrykkende celler i løbet af få timer, som vist ved 6 timer efter infektion (HPI), 1 og 2 dage efter infektion (DPI). Men spredningen på 293T celler, som ikke udtrykker TVA-receptoren, selvom jegt sker, sker meget langsommere. Scale bar = 100 | jm.
Fig. 4. Repræsentative infektioner af rGCS af ikke-TVA udtrykkende mus. Dyr blev injiceret i LGN med rVSV (A / RG) virus pseudotype med RABV-G, og væv høstet 2 dpi. (A) Sparse (rGCS angivet med gule pile) eller (B) tætte infektioner kan opnås, afhængigt af virustiteren og kvaliteten af injektion. Mange forskellige typer af rGCS kan identificeres baseret på morfologi, herunder (C) lille lysthus rGCS, (D) type 1 melanopsin rGCS, (e)-DSGCs, og (F) ON-OFF-DSGCs, blandt andre. Scale bar = 50 | jm.
Figur 5. RVSV (A / RG) transmission fra on-off-DSGCs til SBVO følger det forventede mønster. (A) ON-OFF-DSGCs (hvid pilespids med grønne fyld) fremsende virus til flere habitatområder (gule pilespidser). (A '). Alle grønne celler, der ikke den DSGC co-etiket med Cre reporter, hvilket indikerer, at de er TVA-udtrykkende sække. (BC) Den DSGC (hvid pilespids med grønne fyld) og habitatområder (gule pilespidser) stratificere i de relevante ChAT lag af retinale indre netformige lag (IPL). De celler, som virus overfører omfatter både ON og OFF-habitatområderne. Tal i paneler B 'og C' angiver IPL laminae. Placeringen af DSGC soma er kun angivet med pilespidsen, men ikke vist i panel C at fremhæve habitatområderne. Scale bar = 50 | jm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelse af vira til at studere neurale kredsløb er et relativt højt gennemløb metode til at analysere forbundne neuroner. Men genererer både VSV og RABV virioner er ikke trivielt. Selv om protokollen er anført ovenfor til redning virus fra cDNA er tilvejebragt, er det stadig en lav sandsynlighed begivenhed. Niveauerne af hver af de N-, P-og L-plasmider skal finjusteres, og mange forsøg og replikater skal gøres for at sikre viral redning. Dannelsen af ribonukleotid partikel inkorporerer en komplet VSV-genomet RNA er en lav sandsynlighed tilfælde, og derfor kan tage flere forsøg. Denne teknik kan kræve tid til optimering, men når det er optimeret, redning virus er meget lettere.
Analyse af viral transmission fra individuelle rGCS er bedst, når RGC dendritiske dorne ikke overlapper (dvs. figur 4A). Mængden af virus indsprøjtet og injektion koordinater kan justeres for optimal infektion. Også, than placering af injektion vil påvirke antallet og typen af mærkede rGCS (dvs. overlegen colliculus eller superchiasmatic kerne vil mærke forskellige antal og typer af rGCS end en LGN injektion).
VSV har et antal fordele i forhold til PRV og RABV. Ekspressionsniveauet af VSV er meget hurtig, er synlige i løbet af timer 9,15. Dette muliggør kortere inkuberingstider. I dette forsøg blev A / RG glycoprotein kodet i det virale genom, hvilket gør virusset replikationskompetent. Samtidig med at replikationskompetent rabiesvirus gør en BL3 indeslutningsniveau nødvendig, for VSV, er det kun BL2. Glycoproteinet kunne være tilvejebragt i trans i rGCS, dvs ved forudgående infektion af en AAV koder for A / RG fusionsprotein. Men denne strategi er baseret på dobbelt infektion, og niveauerne af glycoprotein ekspression måske ikke optimale. Når udtrykt fra det virale genom, er glycoprotein niveauer fintunet som iFor vildtype-VSV. Uden behov for co-infektion, har alle mærkede rGCS potentialet for viral transmission. Den største ulempe ved VSV er dets forholdsvis hurtige celletoksicitet. Vi har undersøgt VSV-inficerede celler ved fysiologi, og bemærkede, at de var fysiologisk normal ved 18 timer efter infektion, men var for syg til at opnå fysiologiske målinger ved 48 timer efter infektion. Generelt neuroner ser morfologisk normale i 2-3 dage efter infektion, men begynder at vise tegn på sygdom (blæredannelse) kort efter. Det er efter det tidspunkt, hvor transsynaptisk transmission kan observeres (24 timer). Men alle transsynaptisk virus, herunder RABV og PRV, er toksisk for cellerne. Derfor VSV på nuværende tidspunkt bedst anvendes til en anatomisk mærkning værktøj, om vi er ved at gøre det bedre egnet til fysiologiske manipulationer.
VSV er en særlig kraftig transsynaptisk neuronal sporstof. I kraft af dens evne til at acceptere forskellige g.lycoproteins, kan det spore neuroner i de anterograd eller retrograd retninger 9. Her viser vi, at det også kan bruges til at sondere et andet spørgsmål - hvorvidt et genetisk definerede celletype indgange over på en forret cellepopulation. Her har vi demonstrere sin anvendelighed i nethinden, men vi har også brugt det til at mærke genetisk definerede nye indbyrdes befolkninger hjernen, med lige stor succes. Den kan også modificeres til at indeholde et andet glycoprotein, til at tillade transsynaptisk anterograd transmission til TVA-udtrykkende celler. Muligheden for yderligere manipulationer giver potentiale til yderligere hjælpe med at analysere mikrokredsløb og afkode de komplekse beregninger af neurale forbindelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende Sean Whelan for at få hjælp med at redde rekombinante VSV-varianter, og Didem Goz og Ryan Chrenek for teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af HHMI (CLC) og # NS068012-01 (KTB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
| vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
| pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
| Media : DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
| Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
| Viral Centrifugation | |||
| Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
| Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Mouse Injection | |||
| Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
| Stereotax | Narishige | SR-5M | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
| Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| Micr–lectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
| Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| Ethanol | Sigma | 493511 | |
| Iodine | Sigma | PVP1 | |
| Surgery and Dissection tools | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Dissection and antibody staining | |||
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Antibodies | |||
| Antibodies | millipore | AB144P | |
| Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
| Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Tissue mounting | |||
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
| Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
|
|||
References
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
- Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
- Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
- Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
- Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
- Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
- Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).
- van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).
