Summary
Vi præsenterer en enkel protokol til at visualisere regioner af programmeret celledød (PCD) i museembryoer og skelne embryostamceller (ES) cellekulturer under anvendelse af en meget opløseligt farvestof kaldet LysoTracker.
Abstract
Programmeret celledød (PCD) forekommer hos voksne til at opretholde normale væv homøostase og under embryologiske udvikling til at forme væv og organer 1,2,6,7. Under udvikling, kan giftige kemikalier eller genetiske forandringer forårsage en stigning i PCD eller ændre PCD mønstre resulterer i udviklingsmæssige abnormaliteter og fosterskader 3-5. For at forstå etiologien af disse defekter, kan undersøgelsen af embryoner suppleres med in vitro-assays, der bruger differentiere embryostamceller (ES)-celler.
Apoptose er en velundersøgte form af PCD, der involverer både interne og eksterne signaler at aktivere caspase enzym kaskade. Karakteristiske celleforandringer omfatter membran blæredannelse, nuklear skrumpning, og DNA-fragmentering. Andre former for PCD ikke indebærer caspaseaktivering og kan være den endelige resultat af langvarig autophagy. Uanset PCD pathway, døende celler skal fjernes. Hos voksne, perf de immuncellerOrm denne funktion, mens der i embryoer, hvor immunsystemet er endnu ikke udviklet, fjernelse sker ved en alternativ mekanisme. Denne ordning omfatter naboceller (kaldet "ikke-professionelle fagocytter") påtager sig en fagocytisk rolle-de anerkender den "æde mig" signal på overfladen af den døende celle og opsluge det 8-10. Efter omslutning, er resterne bragt til lysosomet for nedbrydning. Således uanset PCD mekanisme, kan en stigning i lysosomal aktivitet korreleres med øget celledød.
At studere PCD, et simpelt assay til at visualisere lysosomer i tykke væv og flerlags differentierede kulturer kan være nyttigt. LysoTracker farvestof er en højt opløselig lille molekyle, der er fastholdt i sure subcellulære rum såsom lysosomet 11-13. Farvestoffet optages af diffusion og gennem kredsløbet. Da penetration ikke er en hindring, visualisering af PCD i tykke væv og multi-lag kulturer er mulig 12,13 14, begrænset til små prøver, histologiske sektioner og monolagskulturer, idet proceduren kræver indtastning / permeabiliteten af en terminal transferase.
I modsætning til Anilin blå, som diffunderer og opløses af opløsningsmidler, er LysoTracker Red DND-99 fixable, lyse og stabil. Farvning kan visualiseres med standard fluorescerende eller konfokal mikroskopi i hel-monteret eller afsnit ved hjælp af vandige eller opløsningsmiddelbaserede monteringsmedie 12,13. Her beskriver vi protokoller ved hjælp af dette farvestof at se på PCD i normale og Sonic hedgehog null musefostre. Desuden udviser vi analyse af PCD i differentiere ES-cellekulturer og præsentere en enkel kvantificering fremgangsmåde. Sammenfattende kan LysoTracker farvning være en stor supplement til andre fremgangsmåder til detektion af PCD.
Protocol
1. LysoTracker farvning af musefostre
- Generer musefostre ved at placere unge (5-6 uger gamle) kvinder i mandlige stud bure. Overvåge den følgende morgen til forekomsten af en vaginal prop indikerer, at parring har fundet sted. Hvis kvinden er gravid, er middag på denne dag kaldet 0,5 DPC (dage efter samlejet). Den procedure, der præsenteres her er ideel til embryoner 7-13 DPC.
- På den embryonal dag af interesse, aflive den kvindelige ifølge godkendte protokoller og fjerne livmoderen. Flytte embryoner fra decidua i en 10 cm petriskål med Hanks BSS (uden phenolrødt). Fjern de ekstra-embryonale membraner og har mindst én skylning med Hanks BSS for at fjerne uvedkommende væv og blod.
- Forbered LysoTracker Embryo farvningsopløsning (5 mM LysoTracker i Hanks BSS). Et passende volumen til 1-2 kuld er 5 ml. Bland forsigtigt at udbetale farvestoffet jævnt.
- Læg embryoner til LysoTracker Embryo Farvning solution i et mikrofugerør eller hætteglas og inkuber ved 37 ° C i 45 minutter.
- Skyl meget forsigtigt i Hanks BSS fire gange, 5 min hver vask.
- Fix i 4% paraformaldehyd natten over.
- Skyl en gang i Hanks BSS, 10 min, for at fjerne fix.
- Dehydrere gennem en methanol serie (50%, 75%, 80%, 100%, 5 minutter hver trin) for at fjerne baggrundsfarvning. Dette er vigtigt for at opnå god signal til støj under billedbehandling.
- På dette punkt kan du gemme embryo prøver på ubestemt tid i methanol ved -20 ° C, beskyttet mod lys.
Bemærk: En vævsprøve kan tages på ethvert trin til DNA-genotypebestemmelse, men det kan være mest bekvemt at udtage en prøve umiddelbart før opbevaring, således at op til dette trin alle prøverne kan batch-forarbejdes. Indsaml en prøve af væv fra halen, lemmer eller hoved fra hver foster og sætte alle i separate rør. Rehydrere vævsprøven og forberede genotyPing.
2. LysoTracker Farvning af Differentiering ES Cultures
- Forbered embryoide legemer via den hængende dråbe Method 15 med udgangspunkt densitet på 500 celler per 20 pi drop.
- Efter 3 dage, overføre embryoid organer til suspension kultur på 10 cm ikke-adhærente petriskåle (dvs. dem, der anvendes til bakteriologisk arbejde). Kultur for 5 dage, skiftende medier hver 2 dage.
- På dag 7 embryoid organer overføre til gelatinerede 8-godt kammer slides (tilsæt 0,1% Gelatine til kamrene, vente 5 min, fjerne og tilføje medier). Overfør 1-2 embryoid organer pr kammer.
- Kultur i 10 dage, skiftende medier hver anden dag. Være omhyggelig med at placere pipetten ved hjørnet af kammeret glider så der ikke forstyrrer embryoid organ knyttet til glasoverfladen. Også når der tilføjes frisk medium også placere pipetten på hjørnet af kammeret og frigiver mediet langsomt.
- Efter 10 dages kulture, til at inducere apoptose som en positiv kontrol, behandle nogle af brøndene med 0,1 mM og 1,0 mM H 2 O 2 (tilføje H 2 O 2 til friske medier, mix, hvorefter der tilsættes til cellerne) i 60 minutter. Skyl to gange med D-PBS og kultur natten over i almindelige medie.
- Aspirer forsigtigt eksisterende medier og tilsæt LysoTracker Cell farvningsopløsning (500 nM LysoTracker (slutkoncentration) i medier, 300 pi per kammer).
- Inkuber ved 37 ° C i 15 minutter.
- Skylles to gange med D-PBS 2 gange, 5 minutter hver.
- Fix i 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Skylles to gange med D-PBS, 5 min.
3. Visning LysoTracker Stained Embryoner eller ES kulturer
- Forberede celleprøver til mikroskopi ved at aspirere den D-PBS; fjerne kammeret fra objektglasset, lufttørring i omkring 5 min, og derefter tilsætte en vandig monteringsmedium (Vectashield med DAPI eller lignende). Placer en folie barriere mens drying at reducere blegning af fluoroforen. Monter embryoner i en dyb-depression glasfad eller lille petriskål i Vectashield eller lignende.
- Visualiser med en dissekering eller sammensat mikroskop udstyret med en rhodamin eller Texas Red filter (LysoTracker RED DND-99, Excitation / Emission: 577/590 nm). Farvningen er typisk helt lyse så lange eksponeringer er normalt ikke nødvendig.
4. Kvantificering af resultater ved hjælp af Imaging Techniques
- Tag digitale billeder af dine prøver under samme eksponeringsbetingelser i manuel drift.
- Åbn billederne i Adobe Photoshop eller et lignende billedbehandling program. At bestemme mængden af LysoTracker farvning, vælge den røde kanal, og tærsklen billedet (konverteres billedet til sort-hvid), således at rødfarvning nu er repræsenteret ved hvide pixler. Vælg de hvide pixels og bruge histogramfunktion at opnå den totale tælling.
- Anvende den blå kanal at tælleantallet af kerner i marken. Det kan være nyttigt at holde styr på optællingen ved udfyldelse af billedet.
- Notér de værdier og derefter beregne den gennemsnitlige farvning niveau per celle. Gentag denne analyse med det samme tærskel indstilling for alle billeder, du ønsker at prøve.
5. Repræsentative resultater
Der er et normalt mønster af PCD under embryonisk udvikling, som kan ændres, når en vækstfaktor gen, såsom Sonic hedgehog (Shh), fjernes 16,17. Da LysoTracker er et lille molekyle farvestof, der er meget diffunderbart kan hele embryo visualiseres for at bedømme områder af PCD selv dybt inde i mesenkymet 12,13 Figur 1 viser LysoTracker farvningsmønster for normale og Shh -. / - Mutante museembryoner ved 10.5dpc. På dette stadium er PCD stærkt forøget i Shh - / - mutante embryoer, især i ben og somit regions. Dele af embryo kan afbildes helt-mount ved højere forstørrelse (1B) at vurdere den samlede mønster. Dissekerede dele kan også være i snit med en vibrerende microtome (1C) eller en kryostat (DF) for at afsløre PCD regioner mere detaljeret.
TUNEL analyse sker bedst på tynde strækninger, hvor penetration af terminal transferase er mindre problematisk. LysoTracker farvning og en TUNEL assay kan udføres i det samme væv (figur 1D-G). Disse resultater viser, at selv om der ikke er en streng 01:01 korrelation mellem LysoTracker og TUNEL-farvning, de generelle områder af PCD overlapning betydeligt. Ved en større forstørrelse er det muligt at se puncta, at farvet positive med TUNEL-assayet, men ikke med LysoTracker farvestof, puncta, at pletten kun med LysoTracker farvestof, og puncta, som har overlappende farvning.
Når en EB udplades på et gelatine-coatede overflade, vil differentierende celler migrate udad. Efter 10 dages dyrkning, vil celler er differentieret i en række celletyper, herunder neuroner, muskelceller, og kardiomyocytter. Kulturerne vist i figur 2 indeholde blandede populationer af disse celletyper, men man kunne tilpasse vor protokol til at undersøge PCD af en bestemt celletype af interesse. For eksempel kunne EB behandles med retinsyre at forøge differentieringen af neuroner 19, og derefter LysoTracker assayet kan anvendes til at vurdere neuronal celledød under forskellige betingelser. I den normale kultur af differentierede ES-celler, er der nogle få celler, der undergår PCD og disse kan detekteres med LysoTracker og / eller TUNEL assays (figur 2A). PCD kan induceres ved en række forskellige cytotoksiske midler, såsom hydrogenperoxid (H 2 O 2), som inducerer oxidative skader og initierer den apoptotiske vej 20,21. En lav dosis H 2 O 2 forøger bådeLysoTracker og TUNEL farvning sammenlignet med ingen behandling, mens en høj dosis resulterer i celle svind og udbredt LysoTracker og TUNEL positivitet. Svarende til resultaterne i embryonet, er det muligt at se puncta, at farvet positive med TUNEL-assayet, men ikke med LysoTracker farvestof, puncta, at pletten kun med LysoTracker farvestof, og puncta, som har overlappende farvning. Konsekvensen af anvendelse af et cytotoksisk middel, der inducerer apopotosis sammenlignes med serumudsultning betingelser, som inducerer autophagy (figur 2D). Celler, der har gennemgået en periode med serumudsultning (1 time) udviser et andet mønster, hvor LysoTracker og TUNEL farvning ikke meget korrelerer. LysoTracker farvning er meget forøget sammenlignet med ubehandlede kulturer, men TUNEL positivitet er på et normalt niveau.
Anvender standard værktøjer er tilgængelige i Adobe Photoshop, kan LysoTracker farvning kvantificeres med en simpel tærskelværdiansættelse metodeder tillader en at beregne den gennemsnitlige farvning niveau for en population af celler. Figur 3A-B viser, hvordan en prøve billede ser under kvantificering processen. Begyndende med en baseline billede med LysoTracker farvning i den røde kanal, og den DAPI-farvede kerner i den blå kanal (panel 3A) blev den røde kanal af dette billede tærskelværdisammenlignet at konvertere billedet til sort-hvid, og de hvide pixels var derefter udvalgt og talt (figur 3A). En tærskelværdibehandlingsproces niveau blev valgt som repræsenterer den LysoTracker farvningsmønster. Som med enhver kvantificering metode, der bruger billeder, er det vigtigt at undgå overeksponering dine billeder som dette kunne potentielt resultere i lægge for stor vægt forskelle. Antallet af kernerne på området kan derefter tælles ved at se på kun den blå kanal (figur 3B) og mærkning af kerner under anvendelse af en tegning redskab, såsom en pensel mens tælle (figur 3B). Man kan derefter udtrykke the niveau af farvning ved at beregne det gennemsnitlige niveau for farvning per celle (antal pixels / kerner count). Hvis man ønsker at anvende denne algoritme til høj gennemgang put screening, kan de fleste screening pakker måling af lysstyrken i en bestemt kanal, og har også et objekt-id funktion, der tæller kerner i et felt, men for de fleste typiske anvendelser af den manuelle metode er hurtig og enkel. Som eksempel blev en prøve region fra figur 2A-C kvantificeret, og resultaterne bekræfter, at stigende koncentrationer af H 2 O 2 resulterer i et højere LysoTracker farvning (figur 3C).
Figur 1. LysoTracker farvning i normale og Shh - / - embryoer. A, en "normal og Shh -. / - Musefostre på 10,5 DPC, farvet med LysoTracker Red, monteret i Vectashield og fotograferet underen epiflourescence dissektionsmikroskop. Parenteser angiver placeringen af forlemmerne B, B 'forlem af normale og Shh -.. / - Embryoer afbildet i kraftigere forstørrelse. Bemærk de normale domæner af celledød, herunder "Posterior Nekrotisk zone '(markeret med en stjerne) og et område på den proximale mesenkym af lem-knop (markeret med en pil). Shh null lemmer udviser stærkere farvning i den mediale og distale del . C, C '. Mediale snit gennem forlem knop af både normale og null lemmer knopper. Se tilstedeværelsen af farvning i den proximale mesenkym (pil) og AER (pilespids) af den normale lem-knop og den kraftige farvning i den dorsale og ventrale og distale mesenkym i den null lem-knop. DF. Den samme sektion (12 um, frosset afsnit) blev underkastet billeddannelse til LysoTracker og TUNEL-farvning (Roche 1684795). Afsnittet passerer gennem den distale del af Shh null mesenchyme. Pilespidsen peger på AER. Bemærk, hvordan det samlede mønster er meget lig med begge metoder, men farvningen ikke overlapper helt. G, G '. Ved en større forstørrelse af AER og mesenkymet, kan man se både tilstedeværelsen af puncta, der er LysoTracker eller TUNEL-positive Kun samt puncta, der har overlappende farvning.
Figur 2. LysoTracker farvning i differentierede ES-celler. Differentierende celler blev udpladet på 8-kammer glider i fravær af LIF. At vise, hvordan LysoTracker og TUNEL-farvning sammenligne blev apoptosis pathway induceret med 2 forskellige doser af H 2 O 2, mens autophagy pathway blev induceret ved anvendelse af 1 times serumudsultning. Disse billeder blev taget med et Zeiss LSM5 konfokalt mikroskop A-A'':. Ubehandlede kulturer viser nogle normale apoptose som angivet ved LysoTracker og TUNEL-farvning. Mønstret med begge teknikker meste overlap (hvide pile), dog kan man se et par puncta der er LysoTracker positive only (røde pile) B-B'', CC ":. Behandling med stigende mængder af H 2 O 2 stimulerer apoptose . Den lavere dosis viser mere LysoTracker og TUNEL positive puncta sammenligning med ubehandlede celler. Den højere dosis inducerer endnu mere LysoTracker og TUNEL positive puncta. hvide pile peger på overlappende farvning, medens røde pile peger på puncta, der er positive for LysoTracker alene. Det er også muligt at se puncta, som kun er positive for TUNEL-farvning (grønne pile) DD ":. serumudsultning kan inducere autophagy, der kan stimulere en akkumulering af materiale i lysosomer og autophagolysosomes. Bemærk hvor mange flere LysoTracker puncta er synlige i forhold til ubehandlede kulturer. TUNEL positiv puncta er til stede (hvoraf de fleste har overlappende LysoTracker pletning, hvide pile), men antallet er ikke kraftigt forøget sammenlignet med ubehandlede betingelser. Endvidere, under serumudsultning betingelser LysoTracker kun positive puncta er meget udbredte (røde pile).
Figur 3. Kvantificering metode til at vurdere niveauet af farvning i en population af celler ved hjælp af Adobe Photoshop. A: En del af figur 2A blev valgt og LysoTracker (røde kanal) og DAPI-farvning (kerner, blå kanal) er vist i panel A ':. Den røde kanal figur 3A blev tærskelværdisammenlignet at konvertere den til et sort- -hvidt billede. De hvide pixel kan derefter vælges og tælles under anvendelse af histogramfunktion B-B ':. Den blå kanal viser kerner og mens tælle dem, kan billedet være mærket med en tegning funktion, såsom en pensel C:. Dette er en exrigelig kvantificering af en prøve fra paneler 2a-c. Dataene er repræsenteret som pixels pr kerner. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vigtige kendetegn for apoptose omfatter påvisning af DNA-skader med TUNEL assay, sammen med påvisningen af caspaseaktivitet (detekteret med mAb'er eller et bindende molekyle, såsom zVAD-fmk), observation af cellulære ændringer, og præsentationen af phosphatidylserin (PS ) på membranoverfladen (detekteret ved Annexin V binding). Der er nogle ulemper ved hver af disse assays. For eksempel giver den terminale transferase anvendes i TUNEL-assayet ikke trænge igennem nogle få cellelag. Også Annexin V kan markere celler, der ikke undergår apoptose, såsom dem, der har membranskade (Annexin V bliver inde i cellen og markerer PS på det indre blad). Desuden caspase assays kan detektere caspaseaktivitet, som ikke er associeret med apoptose. LysoTracker er ikke en erstatning for disse assays, men det kan være et nyttigt supplement assay afhængigt af konteksten.
LysoTracker farvning har flere fordelefrem for andre metoder. Fordi det er et lille molekyle farvestof i modsætning til et protein, såsom terminal transferase (anvendt i TUNEL-assayet) og Annexin V, er det let diffunderer gennem tykke væv. Dette betyder, at LysoTracker farvningen er særlig anvendelig til at lede efter ændringer i den overordnede mønster af apoptose. Således er en særlig nyttig anvendelse af LysoTracker farvningen er som et first-pass assay for at bestemme mønstre for PCD i embryoner eller celler af forskellige genotyper eller til at se på den samlede virkning af anvendelsen af visse toksiner eller medicinske behandling. Endvidere er højt signal-støjforhold af farvestoffet dets brugervenlighed (kan celler eller væv simpelthen nedsænkes), evne til at blive fast, og udholdenhed af fluoroforen gøre brugen af LysoTracker ideelt til højvolumen screening af celler eller væv, der kan udvise PCD.
Som med enhver assay for PCD imidlertid forbindelse med forsøget er vigtigt at overveje. I de tidlige muse embryonaleudvikling, i fravær af et immunsystem, kan døende celler blive fagocyteret af naboceller 22. Det er ikke kendt, hvor hurtigt det sker. Da det er muligt at finde TUNEL positive puncta, der ikke LysoTracker positive (figur 1G) kan celler undergår de senere faser af apoptose (DNA-fragmentering) før de fjernes ved fagocytose. Når TUNEL og LysoTracker farvning overlap, kan dette betyde, at en celle eller fragment indeholdende fragmenteret DNA bliver fagocyteret. Endelig kunne LysoTracker-positive kun puncta indikerer celleaffald, der ikke indeholder DNA, men er ved at blive ryddet af naboceller. Således i den tidlige mus udvikling, uanset assayet (TUNEL eller LysoTracker), kan farvningsmønster viser begge celler, der dør og tilstødende celler indeholdende snavs.
Vores resultater (figur 2A-C) viser, at LysoTracker kan være meget nyttige til vurderingPCD i dyrkede differentierende ES-celler og derfor sandsynligvis vil være nyttige til en lang række dyrkede celletyper. Interessant, at når celler stimuleres med H2O 2 til at undergå apoptose, mest TUNEL positive puncta er også LysoTracker positive (figur 2B ", 2C"). Dette antyder, at i monolagskultur, kan naboceller stadig være i stand til at fagocytere nærliggende døende celler. Faktisk med en væsentligt højere dosis af H 2 O 2 (10 mM), indeholder størstedelen af celler TUNEL positive puncta, og der er relativt lidt LysoTracker farvning, hvilket antyder, at når så mange celler dør, ikke er rask nok til at virke som ikke- professionelle fagocytter (data ikke vist). Et vigtigt punkt, der ikke er godt værdsat er, at uanset assay, kan det være vanskeligt at afgøre, om man ser på en døende celle, som har høj lysosomal aktivitet eller liget af en døende celle blive opslugt af en nabo-celle, især nårceller er i tæt nærhed.
LysoTracker har også været et nyttigt redskab til at vurdere autophagy 23-26 og som reaktion på serum sult, vise differentierede ES-celler en markant stigning i antallet af LysoTracker farvning puncta (sammenlign figur 2D med 2A). Dette sandsynligvis indikerer en stigning i dannelsen af autophagolysosomes og lysosomer som reaktion på nedsat tilgængeligheden af næringsstoffer (som er blevet vist i andre sammenhænge hjælp LysoTracker 24,25). I modsætning hertil er TUNEL-farvning, mens det stadig stort set svarer til LysoTracker farvning, ikke øges betydeligt, hvilket indikerer, at selv om cellerne oplevede stress fra tab af serum, efter 24 timer, denne stress var ikke tilstrækkeligt til at fremkalde apoptose.
Således en advarsel til at overveje (eller potentiel fordel, afhængigt af hvad man ønsker at assay) er, at mens LysoTracker kan markere områder af apoptose (døende celler samt naboING ikke-professionelle fagocytter), kan det også markere celler, der undergår autophagy. For at bestemme den præcise mekanisme for PCD, er det bedst at gøre flere assays og hvis det er muligt, bruge høj forstørrelse optiske eller elektronmikroskopi teknikker til at skelne mellem de forskellige muligheder. Sammenfattende viser disse eksempler, at LysoTracker er et fantastisk værktøj til at vurdere PCD men at rammerne for analysen bør overvejes nøje, da LysoTracker positiv puncta kunne repræsentere en stigning i lysosom aktivitet på grund af ikke-professionelle fagocytose eller på grund af autophagy 27,28 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer af Mariani lab for at få hjælp redigere protokollen. Dette arbejde blev finansieret af en CIRM Postdoc Training Grant (JLF), en CIRM BRIDGES praktik (TZTT), Robert E. og maj R. Wright Foundation (FVM) og University of Southern California (FVM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | #L-7528 | |||||||||||||||
| Hanks BSS | Invitrogen | 14025-076 | |||||||||||||||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |||||||||||||||
| Vectashield | VECTOR | H-1200 | |||||||||||||||
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |||||||||||||||
| Non-essential amino acids | Cellgro | 25-025-CI | |||||||||||||||
| Sodium pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |||||||||||||||
| FBS | Hyclone | SH30071.02 | |||||||||||||||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140-122 | |||||||||||||||
| b-Mercapt–thanol, 50 mM | Invitrogen | 21985-023 | |||||||||||||||
| LabTek-II Chamber slides (8-well) |
Nalge Nunc International | 154534 | |||||||||||||||
| 0.1% Gelatin | Millipore | ES-006-B | |||||||||||||||
| Dulbecco's PBS (D-PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |||||||||||||||
Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml:
WARNING: Paraformaldehyde in 'frill' form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media:
|
|||||||||||||||||
References
- Baehrecke, E. H. How death shapes life during development. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).
- Meier, P., Finch, A., Evan, G. Apoptosis in development. Nature. 407, 796-801 (2000).
- Ikonomidou, C. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science. 287, 1056-1060 (2000).
- Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder. Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).
- Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker. Cytometry A. 53, 9-21 (2003).
- Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
- Qu, X. Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development. Cell. 128, 931-946 (2007).
- Grimsley, C., Ravichandran, K. S. Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals. Trends Cell Biol. 13, 648-656 (2003).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
- Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Cytometry. 33, 348-354 (1998).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S. 3rd, Rogers, J. M. Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy. Methods. 18, 473-480 (1999).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Chiang, C. Manifestation of the limb prepattern: limb development in the absence of sonic hedgehog function. Dev. Biol. 236, 421-435 (2001).
- Ishibashi, M., McMahon, A. P. A sonic hedgehog-dependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo. Development. 129, 4807-4819 (2002).
- Schuldiner, M. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Brain Res. 913, 201-205 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Dumont, A. Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappaB. Oncogene. 18, 747-757 (1999).
- Hampton, M. B., Orrenius, S. Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis. FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).
- Wood, W. Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos. Development. 127, 5245-5252 (2000).
- Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death. Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).
- Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes. Autophagy. 2, 39-46 (2006).
- Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes. Autophagy. 1, 23-36 (2005).
- Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system. Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
- Klionsky, D. J. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes. Autophagy. 4, 151-175 (2008).
