Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

Published: October 11, 2012 doi: 10.3791/4254
Automatic Translation
1, 1, 1
1Eli and Edythe Broad Center for Regenerative Medicine and Stem Cell Research, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

אנו מציגים פרוטוקול פשוט לדמיין אזורים של מות תאים מתוכן (PCD) בעוברי עכברים ומבדילים (ES) תרבויות תאי גזע עובריות באמצעות צבע מסיס מאוד בשם LysoTracker.

Abstract

מות תאים מתוכן (PCD) מתרחש אצל מבוגרים כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמה נורמלית ובמהלך ההתפתחות עוברית לעצב רקמות ואיברים 1,2,6,7. במהלך פיתוח, כימיקלים רעילים או שינויים גנטיים יכולים לגרום לעלייה בPCD או לשנות דפוסי PCD כתוצאה מפרעות התפתחותיות ומומים מולדים 3-5. כדי להבין את האטיולוגיה של ליקויים אלה, המחקר של עוברים ניתן כהשלמה עם במבחני חוץ גופייה המשתמשים במיון תאי גזע עובריים (ES).

אפופטוזיס הוא צורה נחקרה היטב של PCD שכרוך הוא פנימי וחיצוני כדי להפעיל איתות מפל האנזים caspase. שינויים בתא אופייני כוללים blebbing קרום, התכווצות גרעינית, ופיצול ה-DNA. צורות אחרות של PCD אינן כרוכות בהפעלת caspase ועלולה להיות סוף התוצאה של autophagy הממושך. ללא קשר למסלול PCD, תאים מתים שיהיה צורך להסירו. אצל מבוגרים, התאים החיסוניים ביצועיםORM פונקציה זו, ואילו בעוברים, שבו המערכת החיסונית אינה מפותחת עדיין, ההסרה מתרחשת על ידי מנגנון חלופי. מנגנון זה כרוך תאים שכנים (נקרא "phagocytes לא מקצועי") לוקחים על phagocytic תפקידים שהם מכירים "לאכול אותי" אות על פני השטח של התא ולבלוע אותו 8-10 הגוססים. לאחר בליעה, הפסולת מובאת לlysosome לשפלה. לכן, ללא קשר למנגנון PCD, גידול בפעילות lysosomal יכול להיות מתואם עם מות תא מוגבר.

ללמוד PCD, assay פשוט לדמיין lysosomes ברקמות עבות ותרבויות מבדילות multilayer יכול להיות שימושי. צבע LysoTracker הוא מולקולה קטנה מסיסה מאוד שנשמרה בתאי subcellular חומציים כגון 11-13 lysosome. הצבע הוא נלקח על ידי דיפוזיה ודרך מחזור הדם. מאז חדירה היא לא מכשול, ויזואליזציה של ללמוד במכללת פרינסטון ברקמות עבות ותרבויות רבות שכבתיות הוא אפשרי 12,13 14 Tunel (תיוג סוף transferase dUTP כינוי המסוף deoxynucleotidyl), מוגבל לדגימות קטנות, חתכים ההיסטולוגיים ותרבויות monolayer כי ההליך דורש כניסה / החדירות של מסוף transferase.

בניגוד לאנילין כחול, שמפזר ונמס בממסים, LysoTracker האדום DND-99 ניתן לתקן, בהיר ויציב. כתמים יכולים להיות דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal הסטנדרטי בכל הר-או סעיף באמצעות תקשורת מימית או ממס המבוסס על הרכבת 12,13. כאן אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות צבע זה להסתכל על ללמוד במכללת פרינסטון בעוברי עכברי null קיפוד קולי הרגיל ו. בנוסף, אנו מדגימים ניתוח של PCD במבדל תרבויות תאי גזע עוברי, ולהציג שיטת כימות פשוט. לסיכום, כתמי LysoTracker יכולים להיות רב כדי להשלים שיטות אחרות לאיתור PCD.

Protocol

1. כתמי LysoTracker של עוברי עכברים

  1. צור עוברי עכברים ידי צבת (5-6 שבוע ישן) נקבות צעירות לתוך כלובי הרבעת זכרים. לפקח בבקרים הבאים להופעתו של תקע נרתיק המציין הזדווגות שהתרחשה. אם הנקבה בהריון, בצהריים באותו היום נקראים 0.5 DPC (ימי משגל הודעה). ההליך שהוצג כאן הוא אידיאלי לעוברי 7-13 DPC.
  2. ביום העוברי של ריבית, להרדים את הנקבה על פי פרוטוקולים שאושרו ולהוציא את הרחם. הסר את העוברים מdecidua בצלחת פטרי 10 סנטימטרים עם הנקס BSS (בלי אדום פנול). הסר את קרומי חוץ העובריים ואל אחד לפחות לשטוף עם הנקס BSS להסיר רקמות ודם זרים.
  3. הכן את פתרון כתמי עובר LysoTracker (5 LysoTracker מ"מ הנקס BSS). נפח נוח ל1-2 המלטות הוא 5 מ"ל. לערבב בעדינות כדי להוציא את הצבע באופן שווה.
  4. הוסף לעוברי solut כתמי עובר LysoTrackerיון בצינור microfuge או בקבוקון ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  5. יש לשטוף בעדינות בנקס BSS ארבע פעמים, 5 דקות כל שטיפה.
  6. תקן בParaformaldehyde 4% בין הלילה.
  7. יש לשטוף פעם בנקס BSS, 10 דקות, כדי להסיר את התיקון.
  8. לייבש באמצעות סדרת מתנול (50%, 75%, 80%, 100%, 5 דקות כל שלב) כדי לחסל את צביעת רקע. זה חשוב להשגת אות לרעש טוב במהלך ההדמיה.
  9. בשלב זה אתה יכול לאחסן את דגימות העובר ללא הגבלה זמן במתנול ב -20 ° C, מוגן מפני אור.

הערה: דגימת רקמה ניתן לקחת בכל צעד לgenotyping DNA, לעומת זאת, זה יכול להיות נוח ביותר לקחת דגימה בדיוק לפני האחסון, כך שעד שלב זה את כל הדגימות יכולות להיות תצווה מעובד. איסוף דגימת הרקמה מהזנב, האיברים, או הראש מכל עובר והכניס את כולם לצינורות נפרדים. Rehydrate דגימת הרקמה ולהתכונן לgenotyפינג.

2. כתמי LysoTracker של התמיינות תרבויות ES

  1. הכן את גוף embryoid באמצעות שיטת 15 Drop Hanging עם צפיפות החל מ 500 תאים לכל טיפת μl 20.
  2. לאחר 3 ימים, להעביר את הגופות לתרבות embryoid השעיה על 10 סנטימטר צלחות הפטר שאינן חסידות (כלומר אלו המשמשים לעבודה בקטריולוגית). תרבות במשך 5 ימים, שינוי בתקשורת כל 2 ימים.
  3. ביום 7, להעביר את הגופות לembryoid שקופיות קאמריות 8-גם gelatinized (להוסיף 0.1% לטין לתאים, חכה 5 דקות, להסיר ולהוסיף מדיה). להעביר 1-2 גופי embryoid לקאמרי.
  4. תרבות למשך 10 ימים, שינוי תקשורת בכל יום אחר. היזהר להציב פיפטה בפינת שקופית התא כדי לא יפריע גוף embryoid מצרף למשטח הזכוכית. גם בעת הוספת מדיה טריה גם למקם את פיפטה בפינה של החדר ולשחרר את התקשורת באיטיות.
  5. אחרי 10 ימים של פולחןיור, כדי לגרום לאפופטוזיס כביקורת חיובית, טיפול בחלק מהבארות עם 0.1 מ"מ ו1.0 המ"מ H 2 O 2 (להוסיף H 2 O 2 לתקשורת, תמהיל טרי, ולאחר מכן להוסיף לתאים) עבור 60 דקות. שטוף פעמים עם D-PBS ותרבות בלילה בתקשורת הרגילה.
  6. בעדינות לשאוב תקשורת הקיימת ולהוסיף פתרון מכתים סלולרי LysoTracker (500 LysoTracker nM (ריכוז סופי) בתקשורת, 300 μl לחדר).
  7. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  8. שטוף פעמים עם 2 פעמים D-PBS, 5 דקות כל אחד.
  9. התקן בparaformaldehyde 4% למשך 15 דקות בRT.
  10. שטוף פעמים עם D-PBS, 5 דקות.

3. צופים בעוברים מוכתבים LysoTracker או תרבויות ES

  1. הכן את דגימות התאים למיקרוסקופיה ידי aspirating D-PBS; הסרה קאמרית את השקופית; ייבוש באוויר במשך כ 5 דקות, ולאחר מכן הוספה בינונית גובר מימית (Vectashield עם DAPI או דומה). הנח מכשול רדיד תוך מתייבשגרמתי לירידה של הלבנת fluorophore. הר עוברים בצלחת זכוכית עמוק דיכאון או צלחת פטרי קטנה בVectashield או דומה.
  2. דמיינו עם מיקרוסקופ לנתח או מתחם לבוש עם rhodamine או טקסס אדומה מסנן (LysoTracker אדום DND-99, עירור / פליטה: 577/590 ננומטר). הצביעה היא בדרך כלל די בהירה כל כך חשיפות ארוכות הן בדרך כלל לא הכרחיות.

4. כימות תוצאות באמצעות טכניקות הדמיה

  1. קח תמונות דיגיטליות של הדגימות שלך באותם תנאי חשיפה במצב ידני.
  2. פתח את התמונות בפוטושופ או תוכנת הדמיה דומה. כדי לקבוע את הסכום מכתים LysoTracker, בחר את הערוץ והסף האדום תמונה (ממיר את התמונה וללבנה שחורים) כך שהכתמים האדומים כעת מיוצגים על ידי פיקסלים לבנים. בחר את הפיקסלים הלבנים ולהשתמש בפונקצית ההיסטוגרמה להשיג מניין הכולל.
  3. השתמש בערוץ הכחול לספורמספר הגרעינים בתחום. זה יכול להיות שימושי כדי לשמור תיעוד של הספירה על ידי הוספת הערות לתמונה.
  4. הקלט את הערכים ולאחר מכן לחשב את הרמה המכתימה הממוצעת לכל תא. חזור על ניתוח זה באותה הגדרת סף לכל התמונות שברצונך לטעום.

5. נציג תוצאות

יש דפוס נורמלי של PCD במהלך התפתחות עוברית שיכול להשתנות כאשר גן גורם גדילה, כגון סוניק קיפוד (שש), יוסר 16,17. מאז LysoTracker הוא צבע מולקולה קטן שהוא diffusible מאוד, כל העובר יכול להיות דמיינו להעריך תחומים ללמוד במכללת פרינסטון אפילו עמוקה בתוך mesenchyme 12,13 איור 1 מציג את הדפוס המכתים LysoTracker לנורמלים וששישה -. / - עוברי עכברים מוטנטים ב 10.5dpc. בשלב זה, PCD הוא גדל מאוד שבשש - / - עובר מוטציה, בעיקר בגפיים וsomite Regions. חלקים של העובר ניתן הדמיה בכל הר-בהגדלה גבוהה יותר (1B) כדי להעריך את הדפוס הכללי. חלקים גזורים יכולים להיות גם מחולקים עם microtome רוטט (1C) או cryostat (DF) כדי לחשוף אזורי PCD ביתר פירוט.

ניתוח Tunel הוא עשה כמיטב בסעיפים דקים שם חדירה של מסוף transferase היא פחות בעייתית. מכתים LysoTracker וassay Tunel ניתן לעשות באותה הרקמה (איור 1D-G). תוצאות אלו מראות כי למרות שאין קורלציה של 1:1 בין LysoTracker קפדנית ומכתים Tunel, האזורים הכלליים של חפיפת PCD במידה ניכרת. בהגדלה גבוהה יותר, ניתן לראות שכתם puncta חיובי עם assay Tunel אבל לא עם צבע LysoTracker, puncta שכתם רק עם צבע LysoTracker, וpuncta שהחפיפה מכתימה.

כאשר EB היא מצופה על משטח מצופה ג'לטין, תאים מבדילים יהיו migratדואר החוצה. אחרי 10 ימים של התרבות, תאים יהיו מובחנים למגוון של סוגי תאים כוללים תאי עצב, תאי שריר, ושריר לב. התרבויות שמוצגות באיור 2 מכילות אוכלוסייה מעורבת של תאים מסוגים אלה, עם זאת אפשר להתאים פרוטוקולנו ללמוד ללמוד במכללת פרינסטון של תאים מסוג מסוים של ריבית. לדוגמה, EB יכולה להיות מטופלים עם חומצה רטינואית כדי לשפר את ההתמיינות של תאי עצב 19, ולאחר מכן את assay LysoTracker יכול לשמש להערכת מוות של תאים עצבי בתנאים שונים. בתרבות הנורמלית של תאי גזע עוברי בדיל, יש כמה תאים שעוברים PCD ואלה יכולים להיות מזוהים עם LysoTracker ו / או מבחני Tunel (2A איור). PCD יכול להיגרם על ידי מספר הסוכנים ציטוטוקסיות שונים כגון מי חמצן (H 2 O 2) שגורם לניזק חמצונים ויוזם את מסלול אפופטוטיים 20,21. מינון נמוך של H 2 O 2 מגביר שניהםLysoTracker ומכתים Tunel השוואה לשום טיפול, בעוד שתוצאות במינון גבוהה בהתכווצות תא וLysoTracker הנרחב וחיובי Tunel. בדומה לתוצאות בעובר, ניתן לראות שכתם puncta חיובי עם assay Tunel אבל לא עם צבע LysoTracker, puncta שכתם רק עם צבע LysoTracker, וpuncta שהחפיפה מכתימה. התוצאה של היישום של סוכן ציטוטוקסיות שגורם apopotosis בהשוואה לתנאים הגורמים להרעבת סרום autophagy (האיור 2D). תאים שעברו תקופה של רעב סרום (שעה 1) מפגינים דפוס שונה בי LysoTracker ומכתים Tunel לא מאוד לתאם. מכתים LysoTracker הוא גדל בהרבה בהשוואה לתרבויות שלא טופלו, אולם חיוביות Tunel היא ברמות נורמליות.

העסקת כלים סטנדרטיים זמינים ב Adobe Photoshop, כתמי LysoTracker ניתן לכמת בשיטה פשוטה thresholdingשמאפשר לחשב את הרמה המכתימה הממוצעת עבור אוכלוסייה של תאים. איור 3A-B מראה כיצד תמונה לדוגמה נראית במהלך תהליך הכימות. החל עם תמונה בסיסית עם כתמי LysoTracker במסלול האדום והגרעינים DAPI המוכתמים בערוץ הכחול (הפנל 3A), המסלול האדום של תמונה זו היה thresholded להמיר את התמונה וללבנה שחורים ואת הפיקסלים הלבנים היו לאחר מכן נבחר ונספר (איור 3 א '). רמת thresholding נבחרה שמייצגת את הדפוס המכתים LysoTracker. כמו בכל שיטת כימות המשתמשת תמונות, חשוב להימנע מoverexposing התמונות שלך כמו זה עלול לגרום יתר מדגישים הבדלים. מספר הגרעינים בשדה אז ניתן לספור על ידי הסתכלות רק הערוץ הכחול (איור 3 ב ') וסימון הגרעינים באמצעות כלי ציור, כגון מכחול וסופרות (האיור 3B'). אחר כך אפשר להביע את הרמת דואר של הכתמה על ידי חישוב הרמה הממוצעת של כתמים לתא (מספר פיקסלים / ספירת גרעינים). אם רוצה להשתמש באלגוריתם זה לסינון גבוה דרך-put, חבילות הקרנה רוב יכולות למדוד בהירות בערוץ מסוים וגם יש פונקציה מזהה עצם שתספורנה גרעינים בשדה, אולם עבור יישומים אופייניים ביותר השיטה הידנית היא מהירה ו פשוט. כדי לתת דוגמה, אזור דגימה מדמויות 2A-C היה לכמת את התוצאות ולאשר כי הגדלת ריכוז של 2 2 תוצאות H O ברמה גבוהה יותר של כתמי LysoTracker (האיור 3C).

איור 1
איור 1. מכתים LysoTracker ברגיל וששישה - עוברים - /. , א 'רגילים וששישה -. / - עוברי עכברים ב10.5 DPC, מוכתם בLysoTracker אדום, רכובים בVectashield וצלמו מתחתepiflourescence ביתור מיקרוסקופ. סוגריים מציינים את המיקום של forelimbs B, B 'Forelimb של רגילים וששישה -.. / - עוברים צלם בהגדלה גבוהה יותר. שימו לב לתחומים הנורמלים של מוות של תאים, כולל 'האזור האחורי נקרוטי' (מסומן בכוכבית) ואזור בmesenchyme הפרוקסימלי של ניצן הגפה (מסומן בחץ). גפי null שישה להפגין מכתים חזק בחלק המדיאלי ודיסטלי . C, C '. מדורים המדיאלי דרך ניצן forelimb של ניצני גפיים נורמלים ובאפס. שים לב לנוכחותם של כתמים בmesenchyme הפרוקסימלית (חץ) וAER (ראש החץ) של הניצן הנורמלי האיבר והכתמים החזקים בתוך mesenchyme הגב וגחון ודיסטלי בתוך ניצן איבר האפס. DF. אותו הסעיף (12 מיקרון, קפוא סעיף) היה צלם לLysoTracker ומכתים Tunel (רוש 1684795). הסעיף עובר דרך חלקו האחורי של השישה null mesenchyme. נקודות לראש החץ AER. שימו לב איך את הדפוס הכללי הוא דומה מאוד בשתי השיטות, אולם המכתים אינו חופף לחלוטין. G, G ". בהגדלה גבוהה יותר של AER וmesenchyme, אפשר לראות גם את נוכחותו של puncta שהן LysoTracker או Tunel חיובי רק כמו גם puncta שחפיפה מכתימה.

איור 2
איור 2. מכתים LysoTracker בתאי גזע עוברי מובחנים. התמיינות תאים מצופים בשקופיות 8-קאמריות בהעדר LIF. כדי להראות עד כמה LysoTracker ומכתים Tunel להשוות, מסלול אפופטוזיס היה מושרה עם 2 מינונים שונים של H 2 O 2, ואילו מסלול autophagy היה מושרה באמצעות שעה 1 ברעב בסרום. תמונות אלו צולמו עם confocal מיקרוסקופ Zeiss LSM5-'':. תרבויות לא טופלו להראות קצת אפופטוזיס הרגיל כפי שצוין על ידי LysoTracker ומכתים Tunel. דפוס שימוש בשתי הטכניקות בעיקר החפיפה (חצים לבנים), לעומת זאת, אפשר לראות כמה שהם puncta LysoTracker (חצים אדומים) חיוביים רק ב-B'', CC ":. טיפול בכמויות הולכות וגדלות של H 2 O 2 ממריץ אפופטוזיס . המינון הנמוך מראה יותר LysoTracker וpuncta החיובי Tunel בהשוואה לתאים שלא טופלו. המינון הגבוה יותר גורם בLysoTracker עוד יותר וpuncta החיובי Tunel. חיצים לבנים לצביעה חופפת, ואילו חצים אדומים צבע על puncta שהם חיוביים לLysoTracker בלבד. כמו כן ניתן לראות שpuncta הם חיוביים רק להכתמת Tunel (חצים ירוקים) DD ":. רעב סרום יכול לגרום autophagy, שיכול לעורר הצטברות של חומר בlysosomes וautophagolysosomes. שים לב כמה יותר puncta LysoTracker גלויים בהשוואה לתרבויות שלא טופלו. Tunel puncta החיובי קיים (שרובם חופף LysoTracker הכתםing, חצים לבנים), לעומת זאת, המספר לא גדל מאוד בהשוואה לתנאים שלא טופלו. בנוסף, בתנאים רעבים סרום, LysoTracker בלבד puncta החיובי הוא תופעה שכיחה מאוד (חצים אדומים).

איור 3
איור 3. שיטת כימות כדי להעריך את הרמה של הכתמה באוכלוסייה של תאים באמצעות Adobe Photoshop. : חלק מאיור 2A נבחר וLysoTracker (מסלול אדום) והמכתים DAPI (גרעינים, כחול ערוץ) מוצגים בלוח זה ":. המסלול האדום של 3A הדמות היה thresholded כדי להמיר אותו ושחור לבן תמונה. הפיקסלים הלבנים אז ניתן לבחור וספרו באמצעות פונקצית ההיסטוגרמה B-B ":. הערוץ הכחול מראה את הגרעינים ותוך לספור אותם, התמונה יכולה להיות מוערת עם פונקצית ציור כגון מכחול C:. זוהי לשעברכימות שפע של מדגם מפנלי 2A-C. הנתונים מוצגים כפיקסלים לגרעינים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

סימני היכר חשובים של אפופטוזיס כוללים זיהוי של ניזק לדנ"א עם assay Tunel, יחד עם זיהוי של פעילות caspase (מזוהה עם בז או מולקולה מחייבת כגון ZVAD-fmk), תצפית של שינויים תאיים, ומצגת של phosphatidylserine (PS ) על פני הקרום (זוהה על ידי Annexin V מחייב). יש כמה חסרונות בכל אחד מהמבחנים האלה. לדוגמה, בשימוש במסוף transferase assay Tunel לא לחדור מעבר לכמה שכבות תאים. גם Annexin V יכול לסמן תאים שאינם עוברים אפופטוזיס כמו אלה שיש להם ניזק קרום (Annexin V מקבל בתוך התא ומסמן נ.ב. בעלון הפנימי). בנוסף מבחני caspase יכולים לזהות פעילות caspase שאינו קשור לאפופטוזיס. LysoTracker אינו מהווה תחליף למבחנים אלו, אבל זה יכול להיות שימושי assay משלים תלוי בהקשר.

מכתים LysoTracker יש מספר יתרונותעל פני שיטות אחרות. בגלל זה הוא לצבוע מולקולה קטנה, בניגוד לחלבון כגון מסוף transferase (ששמש לבדיקת Tunel) או Annexin V, אותו בקלות דרך רקמות מפזרות עבות. משמעות הדבר הוא כי מכתים LysoTracker שימושי במיוחד כדי לחפש שינויים בתבנית הכללית של אפופטוזיס. לפיכך, יישום שימושי במיוחד להכתמת LysoTracker הוא כבדיקה ראשונה לעבור כדי לקבוע דפוסי PCD בעוברים או תאים של גנוטיפים שונים או להסתכל על ההשפעה הכוללת של היישום של רעלים מסוימים או טיפולים תרופתיים. בנוסף, יחס אות לרעש הגבוה של הצבע, הוא קל לשימוש (תאים או רקמות יכול פשוט להיות שקוע), יכולתו להיות קבועים והסיבולת של fluorophore להפוך את השימוש באידיאלי LysoTracker עבור נפח גבוה הקרנה של תאים או רקמות שעשויות להפגין PCD.

כמו בכל בדיקה לPCD, עם זאת, בהקשר של הניסוי חשוב לשקול. במהלך עוברי של עכברים מוקדמיםפיתוח, בהעדר מערכת חיסונית, תאים מתים ניתן phagocytosed ידי תאים סמוכים 22. לא ידוע כמה מהר זה קורה. עם זאת, מאחר שניתן למצוא puncta החיובי Tunel שאינם LysoTracker חיובי (האיור 1G), תאים עשויים להיות עוברים שלבים המאוחרים יותר של אפופטוזיס (פיצול ה-DNA), בטרם הוסר על ידי phagocytosis. כאשר Tunel וחפיפת צביעת LysoTracker, זה עשוי להצביע על כך שבר תא או תאים המכיל DNA המקוטע הוא להיות phagocytosed. לבסוף, puncta LysoTracker חיובי בלבד יכול להצביע פסולת תאית שאינו מכיל דנ"א אלא שזוכה על ידי תאים סמוכים. לפיכך, בפיתוח עכבר המוקדם, ללא קשר לבדיקה (או Tunel LysoTracker), הדפוס המכתים יכול להצביע שני התאים שמתים ושכנים תאים המכילים פסולת.

התוצאות שלנו (איור 2A-C) מראות כי LysoTracker יכול להיות שימושי מאוד להערכהללמוד במכללת פרינסטון בתאי גזע עוברי בתרבית ולכן מבדילים עשוי להיות שימושי עבור מגוון רחב של סוגי תאים בתרבית. מעניין, כאשר תאי מגורה עם H 2 O 2 לעבור אפופטוזיס, puncta החיובי Tunel ביותר הם גם LysoTracker החיובי (האיור 2B ", 2C"). הדבר מצביע על כך בתרבות monolayer, תאים שכנים עשויים עדיין להיות מסוגלים phagocytose תאים מתים סמוכים. ואכן עם מינון גבוה הרבה יותר של H 2 O 2 (10 מ"מימ), הרוב המכריע של תאים מכיל puncta החיובי Tunel ויש כתמי LysoTracker מועטים יחסית, מה שמראה שכאשר תאים כל כך הרבה מתים, הם אינם בריאים מספיק כדי לשמש כהלא phagocytes המקצועי (נתונים לא מוצגים). נקודה חשובה שלא זוכים להערכה גם היא שללא קשר לבדיקה, זה יכול להיות קשה לקבוע אם האדם מסתכל בתא שמת שיש פעילות lysosomal גבוהה או גופתו של תא שמת שנבלע על ידי תא שכן, במיוחד כאשרתאים נמצאים בסמיכות.

LysoTracker כבר גם כלי שימושי להערכת autophagy 23-26 ובתגובה להרעבת סרום, תאי גזע עוברי בדיל להציג גידול ניכר במספר LysoTracker המכתים puncta (השווה עם האיור 2D 2A). זה כנראה מעיד על עלייה בהיווצרות autophagolysosomes וlysosomes בתגובה לירידה בזמינות חומרי מזון (כפי שהוכח בהקשרים אחרים באמצעות LysoTracker 24,25). לעומת זאת, מכתים Tunel, ועדיין במידה רבה חופף עם כתמי LysoTracker, לא גדל באופן משמעותי, מצביע על כך שלמרות שהתאים חוו לחץ מההפסד של סרום, לאחר 24 שעות, מתח זה לא היה די כדי לגרום לאפופטוזיס.

כך אזהרה אחת לשקול (או יתרון פוטנציאלי, תלוי במה שרוצה assay) היא שבעוד LysoTracker יכול לסמן אזורים של אפופטוזיס (מות תאים, כמו גם השכןphagocytes ing הלא מקצועי), זה גם יכול לסמן תאים שעוברים autophagy. כדי לקבוע את המנגנון המדויק של PCD, עדיף לעשות כמה מבחנים ואם אפשר, השתמש בשיטות אופטיות ואלקטרונים או הגדלה גבוהות מיקרוסקופיה להבחין בין האפשרויות השונות. לסיכום, דוגמאות אלו מראות שLysoTracker הוא כלי נהדר להערכת PCD אבל זה בהקשר של הבדיקה יש לשקול בזהירות מאז LysoTracker puncta החיובי יכול לייצג גידול בפעילות lysosome בשל phagocytosis לא מקצועי או עקב autophagy 27,28 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

אנו מודים לחברי מריאני המעבדה לעזרת עריכת הפרוטוקול. עבודה זו מומנה על ידי מענק הדרכה CIRM דוקטורים (JLF), התמחות גשרי CIRM (TZTT), רוברט ומאי ר רייט קרן (FVM), ובאוניברסיטת הדרום קליפורניה (FVM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen #L-7528
Hanks BSS Invitrogen 14025-076
Paraformaldehyde EMD EM-PX0055-3
Vectashield VECTOR H-1200
DMEM Cellgro 10-013-CV
Non-essential amino acids Cellgro 25-025-CI
Sodium pyruvate Cellgro 25-000-CI
FBS Hyclone SH30071.02
Pen-Strep Invitrogen 15140-122
b-Mercapt–thanol, 50 mM Invitrogen 21985-023
LabTek-II Chamber slides
(8-well)		 Nalge Nunc International 154534
0.1% Gelatin Millipore ES-006-B
Dulbecco's PBS (D-PBS) Cellgro 21-031-CV

Solution Recipes

4% Paraformaldehyde

For 100 ml:

  1. Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH.
  2. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat.
  3. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml.
  4. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots.

WARNING: Paraformaldehyde in 'frill' form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling.

EB Culture Media

For 500 ml EB Media:

DMEM: 404.5 ml
FBS: 75.0 ml
L-Glutamine: 5.0 ml
Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml
Non-essential amino acids: 5.0 ml
Sodium pyruvate: 5.0 ml
β-Mercapt–thanol: 500 μl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baehrecke, E. H. How death shapes life during development. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).
  2. Meier, P., Finch, A., Evan, G. Apoptosis in development. Nature. 407, 796-801 (2000).
  3. Ikonomidou, C. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science. 287, 1056-1060 (2000).
  4. Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder. Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).
  5. Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker. Cytometry A. 53, 9-21 (2003).
  6. Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
  7. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
  8. Qu, X. Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development. Cell. 128, 931-946 (2007).
  9. Grimsley, C., Ravichandran, K. S. Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals. Trends Cell Biol. 13, 648-656 (2003).
  10. Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
  11. Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
  12. Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Cytometry. 33, 348-354 (1998).
  13. Zucker, R. M., Hunter, E. S. 3rd, Rogers, J. M. Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy. Methods. 18, 473-480 (1999).
  14. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).
  15. Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
  16. Chiang, C. Manifestation of the limb prepattern: limb development in the absence of sonic hedgehog function. Dev. Biol. 236, 421-435 (2001).
  17. Ishibashi, M., McMahon, A. P. A sonic hedgehog-dependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo. Development. 129, 4807-4819 (2002).
  18. Schuldiner, M. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Brain Res. 913, 201-205 (2001).
  19. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
  20. Dumont, A. Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappaB. Oncogene. 18, 747-757 (1999).
  21. Hampton, M. B., Orrenius, S. Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis. FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).
  22. Wood, W. Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos. Development. 127, 5245-5252 (2000).
  23. Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death. Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).
  24. Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes. Autophagy. 2, 39-46 (2006).
  25. Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes. Autophagy. 1, 23-36 (2005).
  26. Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system. Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).
  27. Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  28. Klionsky, D. J. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes. Autophagy. 4, 151-175 (2008).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 68 ביולוגיה מולקולרית ביולוגיה של תאי גזע ביולוגיה תאית עובר עכבר תאי גזע עובריים מוות של תאים lysosome מתוכנת הדמיה קולי קיפוד
שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fogel, J. L., Thein, T. Z. T.,… More

Fogel, J. L., Thein, T. Z. T., Mariani, F. V. Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (68), e4254, doi:10.3791/4254 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter