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Biology

LysoTracker का प्रयोग करने के लिए भ्रूण में क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का पता लगाने और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का फर्क

Published: October 11, 2012 doi: 10.3791/4254
Automatic Translation
1, 1, 1
1Eli and Edythe Broad Center for Regenerative Medicine and Stem Cell Research, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

हम एक साधारण प्रोटोकॉल मौजूद क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का माउस भ्रूण में (PCD) क्षेत्रों और भ्रूण स्टेम सेल (ते) एक उच्च घुलनशील LysoTracker बुलाया डाई का उपयोग संस्कृतियों फर्क कल्पना.

Protocol

1. माउस भ्रूण की LysoTracker धुंधला

  1. पुरुष संवर्धन पिंजरों में युवा महिलाओं (5-6 सप्ताह पुराने) रखने के द्वारा उत्पन्न माउस भ्रूण. एक योनि है कि संभोग का संकेत प्लग की उपस्थिति के लिए निम्नलिखित सुबह पर निगरानी हुई है. यदि महिला गर्भवती है, उस दिन दोपहर 0.5 डीपीसी (दिनों के बाद सहवास) कहा जाता है. यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया 7-13 भ्रूण डीपीसी के लिए आदर्श है.
  2. ब्याज की भ्रूण दिन, अनुमोदित करने के लिए प्रोटोकॉल के अनुसार महिला euthanize और गर्भाशय निकालना. हैंक्स बीएसएस (phenol लाल के बिना) के साथ एक 10 सेमी पेट्री डिश में पत्या से भ्रूण निकालें. अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली निकालें करते हैं और कम से कम एक हैंक्स बीएसएस से कुल्ला करने के लिए बाहरी ऊतकों और रक्त को दूर.
  3. में LysoTracker भ्रूण धुंधला समाधान (हैंक्स बीएसएस में 5 मिमी LysoTracker) तैयार करें. 1-2 litters के लिए एक सुविधाजनक मात्रा 5 मिलीग्राम है. धीरे डाई समान रूप से चुकाना मिश्रण.
  4. LysoTracker भ्रूण धुंधला Solut भ्रूण जोड़ेंएक microfuge या 45 मिनट के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर शीशी सेते ट्यूब में आयन.
  5. हैंक्स बीएसएस में बहुत धीरे से चार बार, 5 मिनट प्रत्येक धोने कुल्ला.
  6. रातोंरात 4% Paraformaldehyde में फिक्स.
  7. हैंक्स बीएसएस, 10 मिनट में एक बार कुल्ला, तय करने के लिए दूर.
  8. मेथनॉल (50%, 75%, 80%, 100%, 5 मिनट प्रत्येक कदम) श्रृंखला के लिए पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना खत्म के माध्यम से निर्जलीकरण. यह इमेजिंग के दौरान अच्छा संकेत करने के लिए शोर को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  9. इस बिंदु पर आप भ्रूण के नमूने अनिश्चित काल के मिथेनॉल में -20 डिग्री सेल्सियस पर, स्टोर प्रकाश से संरक्षित है.

नोट: एक ऊतक का नमूना डीएनए जीनोटाइपिंग लिए किसी भी कदम पर लिया जा सकता है, तथापि, यह सबसे सुविधाजनक भंडारण से पहले सिर्फ एक नमूना लेने के इतना है कि इस कदम को सभी नमूनों हो सकता है बैच संसाधित कर सकते हैं. पूंछ, अंग, प्रत्येक भ्रूण से या सिर से ऊतक का एक नमूना ले लीजिए और सभी अलग ट्यूब में डाल दिया. ऊतक नमूना rehydrate और genoty के लिए तैयारपिंग.

2. ES संस्कृति का फर्क LysoTracker धुंधला

  1. Embryoid निकायों तैयार हैंगिंग ड्रॉप विधि 15 के माध्यम से 20 μl ड्रॉप प्रति 500 कोशिकाओं के एक प्रारंभिक घनत्व के साथ.
  2. 3 दिनों के बाद 10 सेमी गैर पक्षपाती पेट्री डिश (जीवाणु काम के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों यानी) पर निलंबन संस्कृति embryoid निकायों हस्तांतरण. 5 दिन, मीडिया हर 2 दिन को बदलने के लिए संस्कृति.
  3. 7 दिन, gelatinized 8 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स embryoid निकायों हस्तांतरण (0.1% कक्षों जिलेटिन जोड़ने, 5 मिनट रुको, हटाने, और मीडिया जोड़). चैम्बर प्रति 1-2 embryoid निकायों स्थानांतरण.
  4. 10 दिन, मीडिया हर दूसरे दिन बदलने के लिए संस्कृति. चैम्बर स्लाइड के कोने पर विंदुक इतनी जगह embryoid शरीर के रूप में कांच की सतह के लिए संलग्न नहीं उपद्रव करने के लिए सावधान रहो. इसके अलावा जब जोड़ने के ताजा मीडिया भी कक्ष के कोने में विंदुक जगह और मीडिया धीरे रिलीज.
  5. पंथ के 10 दिनों के बादure, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में apoptosis प्रेरित, 0.1 मिमी और 1.0 मिमी एच 2 2 हे के साथ कुछ कुओं के इलाज (एच 2 2 हे ताजा मीडिया मिश्रण, 60 मिनट के लिए, तो कोशिकाओं को जोड़ने के लिए). डी PBS और नियमित रूप से मीडिया में रातोंरात संस्कृति के साथ दो बार कुल्ला.
  6. धीरे मौजूदा मीडिया aspirate और LysoTracker सेल धुंधला हो समाधान (मीडिया में 500 एनएम (अंतिम एकाग्रता) LysoTracker, चैम्बर प्रति 300 μl) जोड़ने.
  7. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  8. D-पीबीएस 2 बार, 5 मिनट प्रत्येक के साथ दो बार कुल्ला.
  9. आरटी पर 15 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde में ठीक.
  10. D-PBS, 5 मिनट के साथ दो बार कुल्ला.

3. LysoTracker सना हुआ भ्रूण या ES संस्कृतियों देखना

  1. माइक्रोस्कोपी के लिए सेल के नमूने D-पीबीएस aspirating द्वारा तैयार स्लाइड बंद कक्ष को हटाने के बारे में 5 मिनट के लिए, हवा सुखाने, और फिर एक जलीय बढ़ते मध्यम (DAPI या इसी तरह के साथ Vectashield) जोड़ने. एक पन्नी बाधा रखें जबकि dryinछ की fluorophore विरंजन को कम करने के लिए. एक गिलास गहरे अवसाद या Vectashield या इसी तरह के पकवान छोटे पेट्री डिश में भ्रूण माउंट.
  2. एक विदारक या यौगिक एक rhodamine या टेक्सास रेड फिल्टर के साथ outfitted माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना (LysoTracker DND-99 लाल, / उत्तेजना उत्सर्जन: 577 / ५९० एनएम). धुंधला हो जाना आम तौर पर काफी उज्ज्वल है तो लंबे निवेश आम तौर पर आवश्यक नहीं कर रहे हैं.

4. परिणाम की मात्रा इमेजिंग तकनीक का उपयोग

  1. मैनुअल मोड में ही प्रदर्शन की शर्तों के तहत अपने नमूनों की डिजिटल तस्वीरें ले लो.
  2. एडोब फोटोशॉप या एक समान इमेजिंग प्रोग्राम में छवियों को खोलें. LysoTracker धुंधला हो की राशि का निर्धारण करने के लिए, लाल चैनल और सीमा (श्वेत - श्याम छवि धर्मान्तरित) छवि ऐसी है कि लाल धुंधला हो जाना अब सफेद पिक्सल द्वारा प्रतिनिधित्व किया है का चयन करें. सफेद पिक्सल का चयन करें और हिस्टोग्राम समारोह का उपयोग करने के लिए कुल गिनती प्राप्त.
  3. नीले चैनल का उपयोग करने के लिए गिनतीक्षेत्र में नाभिक की संख्या. यह छवि annotating गिनती के एक रिकार्ड रखने के लिए उपयोगी हो सकता है.
  4. मूल्यों को रिकॉर्ड और फिर सेल प्रति औसत धुंधला हो जाना स्तर की गणना. सभी छवियों आप नमूना करना चाहते हैं के लिए एक ही सीमा की स्थापना के साथ इस विश्लेषण से दोहराएँ.

5. प्रतिनिधि परिणाम

भ्रूण के विकास के दौरान एक PCD के सामान्य पैटर्न है कि जब ध्वनि हाथी (श्श्श) के रूप में एक वृद्धि कारक जीन, 16,17 निकाल दिया जाता है बदल सकते हैं. चूंकि LysoTracker एक छोटे अणु डाई कि अत्यधिक diffusible है है, पूरे भ्रूण भी mesenchyme 12,13 के भीतर गहरे PCD के क्षेत्रों का आकलन visualized चित्रा 1 सामान्य और श्श्श के लिए LysoTracker धुंधला हो पैटर्न से पता चलता है - / - उत्परिवर्ती माउस भ्रूण. 10.5dpc. / - इस स्तर पर, PCD बहुत श्श्श में वृद्धि हुई है उत्परिवर्ती भ्रूण अंग और कायखंड regio में, विशेष रूप से,एनएस. भ्रूण के भाग उच्च वृद्धि (1 बी) में पूरे माउंट में imaged किया जा सकता समग्र पैटर्न का आकलन. Dissected भाग भी एक हिल (1C) सूक्ष्म या एक cryostat अधिक विस्तार में PCD क्षेत्रों प्रकट (लोमो) के साथ sectioned हो सकता है.

TUNEL विश्लेषण सबसे अच्छा पतली वर्गों पर किया जाता है, जहां transferase टर्मिनल की पहुंच कम समस्याग्रस्त है. LysoTracker धुंधला हो जाना और एक TUNEL परख ही ऊतक (चित्रा 1D - जी) में किया जा सकता है. ये परिणाम दिखाते हैं कि यद्यपि वहाँ एक सख्त 01:01 LysoTracker और TUNEL धुंधला हो जाना, PCD काफी ओवरलैप के सामान्य क्षेत्रों के बीच संबंध नहीं है. एक उच्च वृद्धि में, यह संभव है कि puncta देखना है कि TUNEL परख के साथ सकारात्मक दाग लेकिन नहीं डाई LysoTracker, puncta, कि LysoTracker डाई के साथ ही दाग ​​और puncta कि धुंधला हो जाना अतिव्यापी है.

जब एक EB एक जिलेटिन लिपटे सतह पर चढ़ाया हुआ है, फर्क कोशिकाओं migratई जावक. संस्कृति के 10 दिनों के बाद, कोशिकाओं न्यूरॉन्स, मांसपेशियों की कोशिकाओं, और cardiomyocytes सहित सेल प्रकार की एक किस्म में विभेदित किया जाएगा. चित्रा 2 में दिखाया संस्कृतियों इन सेल प्रकार के मिश्रित आबादी होते हैं, लेकिन एक हमारे प्रोटोकॉल अध्ययन करने के लिए ब्याज की एक विशेष सेल प्रकार के PCD अनुकूलित कर सकता है. उदाहरण के लिए, EB Retinoic 19 न्यूरॉन्स के भेदभाव को बढ़ाने एसिड के साथ इलाज किया जा सकता है, और तो LysoTracker परख करने के लिए अलग अलग परिस्थितियों में neuronal सेल, मृत्यु का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विभेदित ES कोशिकाओं के सामान्य संस्कृति में, वहाँ कुछ कोशिकाओं है कि और PCD गुजरना LysoTracker और / या TUNEL assays (चित्रा 2A) के साथ इन पता लगाया जा सकता है. PCD हाइड्रोजन पेरोक्साइड के रूप में विभिन्न साइटोटोक्सिक एजेंटों के एक नंबर (2 एच 2 हे) जो oxidative नुकसान लाती है और apoptotic मार्ग है 20,21 initiates द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. एच 2 2 हे के एक कम खुराक दोनों बढ़ जाती हैकोई उपचार LysoTracker और TUNEL धुंधला हो की तुलना में, जबकि सेल संकोचन और व्यापक LysoTracker और TUNEL धनात्मकता में एक उच्च खुराक परिणामों. भ्रूण में परिणाम के लिए भी इसी तरह, यह संभव है कि puncta देखना है कि TUNEL परख के साथ सकारात्मक दाग लेकिन नहीं डाई LysoTracker, puncta, कि LysoTracker डाई के साथ ही दाग ​​और puncta कि धुंधला हो जाना अतिव्यापी है. एक साइटोटोक्सिक एजेंट लाती है कि apopotosis के आवेदन के परिणाम जो भोजी (चित्रा 2 डी) प्रेरित सीरम भुखमरी की स्थिति की तुलना में है. कोशिकाओं है कि सीरम भुखमरी (1 घंटा) की एक अवधि आया है एक अलग पैटर्न जहां LysoTracker और TUNEL धुंधला हो जाना अत्यधिक सहसंबंधी नहीं दिखा रहे हैं. LysoTracker धुंधला हो जाना बहुत अनुपचारित संस्कृतियों की तुलना में वृद्धि हुई है, लेकिन TUNEL धनात्मकता सामान्य स्तर पर है.

मानक Adobe Photoshop में उपलब्ध उपकरणों को रोजगार, LysoTracker धुंधला हो जाना एक सरल thresholding विधि के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैकि एक कोशिकाओं की आबादी के लिए औसत धुंधला हो जाना स्तर की गणना करने के लिए अनुमति देता है चित्रा 3A-B से पता चलता है कि कैसे एक नमूना छवि मात्रा का ठहराव की प्रक्रिया के दौरान लग रहा है. लाल और नीले चैनल (पैनल 3 ए) में DAPI दाग नाभिक चैनल में LysoTracker धुंधला के साथ एक आधारभूत छवि के साथ शुरू, इस छवि के लाल चैनल काला और सफेद छवि बदलने और सफेद पिक्सेल थे thresholded तो चयनित और गिना (चित्रा 3 ए '). Thresholding स्तर में चुना गया था कि LysoTracker धुंधला हो जाना पैटर्न का प्रतिनिधित्व करता है. किसी भी मात्रा का ठहराव विधि है कि छवियों का उपयोग करता है के साथ के रूप में, यह महत्वपूर्ण है इस के रूप में अपनी तस्वीरों overexposing से बचने के संभावित बल मतभेद में परिणाम सकता है. क्षेत्र में नाभिक की संख्या तो सिर्फ नीले चैनल (3B चित्रा) में देख रहे हैं और एक तूलिका के रूप में इस तरह के एक ड्राइंग उपकरण का उपयोग करते हुए गिनती (चित्रा 3B ') नाभिक अंकन गिना जा सकता है. एक तो वें व्यक्त कर सकते हैंसेल प्रति धुंधला के औसत स्तर की गणना धुंधला के ई स्तर (पिक्सल / नाभिक गिनती की संख्या). यदि किसी की इच्छा उच्च माध्यम से रखा स्क्रीनिंग के लिए इस एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के लिए, सबसे स्क्रीनिंग संकुल एक खास चैनल में चमक को मापने के लिए और भी एक वस्तु पहचानकर्ता समारोह है कि एक क्षेत्र में नाभिक गिनती, लेकिन सबसे विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए मैनुअल विधि जल्दी है और कर सकते हैं सरल. एक उदाहरण देते हैं, 2A सी आंकड़े से एक नमूना क्षेत्र मात्रा निर्धारित किया गया था और परिणामों की पुष्टि है कि LysoTracker धुंधला हो जाना के एक उच्च स्तर (चित्रा 3C) में एच 2 हे 2 परिणाम की सांद्रता बढ़ रही है.

चित्रा 1
चित्रा 1. / - भ्रूण सामान्य और श्श्श में LysoTracker धुंधला हो जाना. ए, ए 'सामान्य और श्श्श - / - 10.5 डीपीसी, LysoTracker लाल के साथ दाग, माउस भ्रूण Vectashield में रखा और फोटो खिंचवाने के तहतएक epiflourescence खुर्दबीन विदारक. कोष्ठक forelimbs के स्थान संकेत मिलता है, 'बी बी - सामान्य और श्श्श forelimb. / - भ्रूण उच्च बढ़ाई imaged. नोट: 'पोस्टीरियर परिगलित जोन' (एक asterisk के साथ चिह्नित) और अंग कली (एक तीर के साथ चिह्नित) के समीपस्थ mesenchyme में एक क्षेत्र सहित कोशिका मृत्यु का सामान्य डोमेन श्श्श अशक्त अंग औसत दर्जे का है और बाहर भाग में प्रदर्शन मजबूत धुंधला हो जाना. सी, सी 'दोनों सामान्य और अशक्त अंग कलियों forelimb कली के माध्यम से औसत दर्जे वर्गों. समीपस्थ (तीर) mesenchyme और सामान्य अंग और अशक्त अंग कली के भीतर पृष्ठीय और उदर और डिस्टल mesenchyme भीतर मजबूत धुंधला हो कली AER (arrowhead) में धुंधला हो जाना की उपस्थिति नोट DF. एक ही अनुभाग (12 माइक्रोन, स्थिर ) अनुभाग LysoTracker और TUNEL धुंधला हो जाना (1684795 Roche) के लिए ली गई. अनुभाग श्श्श अशक्त mesenc के बाहर भाग के माध्यम से गुजरता हैhyme. AER arrowhead अंक. नोट कैसे समग्र पैटर्न बहुत समान है, दोनों तरीकों का उपयोग कर, लेकिन धुंधला हो जाना पूरी तरह से ओवरलैप नहीं करता है. जी, जी '. AER और mesenchyme की एक उच्च वृद्धि, एक दोनों puncta की उपस्थिति है कि LysoTracker या TUNEL पॉजिटिव हैं देख सकते हैं केवल के रूप में अच्छी तरह से puncta कि धुंधला हो जाना अतिव्यापी है.

चित्रा 2
चित्रा 2. विभेदित ES कोशिकाओं में LysoTracker धुंधला हो जाना कोशिकाओं फर्क. 8 चैम्बर स्लाइड पर LIF की अनुपस्थिति में चढ़ाया गया. Apoptosis मार्ग दिखाने के लिए कैसे LysoTracker और TUNEL धुंधला हो की तुलना करने के लिए, 2 एच 2 हे 2 अलग खुराक के साथ प्रेरित किया गया था, जबकि भोजी सीरम भुखमरी के 1 घंटे के मार्ग का उपयोग कर प्रेरित किया गया था. इन छवियों को एक Zeiss LSM5 confocal खुर्दबीन के साथ ले जाया गया'': इलाज संस्कृतियों कुछ सामान्य apoptosis दिखाने रूप में LysoT द्वारा संकेत दियाracker और TUNEL धुंधला हो जाना. दोनों ज्यादातर तकनीक overlaps (सफेद तीर) पैटर्न का उपयोग कर, तथापि, एक कुछ puncta कि LysoTracker केवल सकारात्मक (लाल तीर) कर रहे हैं देख सकते हैं बी बी'', "सीसी: 2 एच की बढ़ती मात्रा के साथ उपचार 2 हे apoptosis को उत्तेजित करता है कम खुराक अधिक LysoTracker और TUNEL सकारात्मक puncta जब अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना से पता चलता है. उच्च खुराक सफेद तीरों बिंदु भी अधिक LysoTracker और TUNEL सकारात्मक puncta में लाती है. अतिव्यापी धुंधला, लाल तीर puncta बिंदु जबकि कि केवल LysoTracker के लिए सकारात्मक हैं. यह भी संभव है puncta कि केवल TUNEL धुंधला हो जाना (हरी तीर) के लिए सकारात्मक रहे हैं देखने डीडी "सीरम भुखमरी भोजी प्रेरित जो lysosomes और autophagolysosomes में सामग्री का एक संचय को प्रोत्साहित कर सकते हैं कर सकते हैं. नोट कितने LysoTracker puncta अनुपचारित संस्कृतियों की तुलना में दिखाई दे रहे हैं. TUNEL सकारात्मक puncta मौजूद हैं (जिनमें से अधिकांश अतिव्यापी है LysoTracker दागआईएनजी, सफेद तीर), तथापि, संख्या बहुत बढ़ अनुपचारित शर्तों की तुलना में नहीं है. इसके अलावा, सीरम भुखमरी की शर्तों के तहत, LysoTracker केवल सकारात्मक puncta अत्यधिक प्रचलित हैं (लाल तीर).

चित्रा 3
चित्रा 3. मात्रा का ठहराव विधि Adobe Photoshop का उपयोग कोशिकाओं की आबादी में धुंधला के स्तर का आकलन. : चित्रा 2A के एक हिस्से को चुना गया था और (लाल चैनल) LysoTracker और DAPI धुंधला हो जाना (नाभिक, नीले चैनल) इस पैनल में दिखाया गया है ए ': चित्रा 3A का लाल चैनल के लिए यह एक काले और बदलने thresholded छवि सफेद. सफेद पिक्सल में और फिर चयनित किया जा सकता है हिस्टोग्राम समारोह गिनती का उपयोग बी बी ': नीले चैनल के नाभिक से पता चलता है और जबकि उन्हें गिनती, छवि एक तूलिका के रूप में इस तरह के एक ड्राइंग समारोह के साथ एनोटेट सी हो सकते हैं: यह एक पूर्व है2A-C पैनल से एक नमूना की पर्याप्त मात्रा का ठहराव. डेटा नाभिक पिक्सेल प्रति के रूप में प्रतिनिधित्व किया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

Apoptosis की महत्वपूर्ण पहचान TUNEL परख के साथ डीएनए की क्षति का पता लगाने, कस्पासे गतिविधि का पता लगाने के साथ (mAbs या ZVAD fmk के रूप में इस तरह के एक अणु बंधन के साथ पाया), सेलुलर परिवर्तन के अवलोकन, और phosphatidylserine की प्रस्तुति (पुनश्च झिल्ली सतह पर) (Annexin वी बाध्यकारी द्वारा पता लगाया). इन assays में से प्रत्येक के साथ कुछ नुकसान कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, टर्मिनल transferase TUNEL परख में इस्तेमाल किया कुछ सेल परतों से परे नहीं घुसना. इसके अलावा Annexin वी कोशिकाओं है कि apoptosis उन है कि झिल्ली क्षति (Annexin वी सेल के अंदर हो जाता है और भीतरी पत्रक पर पुनश्च निशान) के रूप में इस तरह के दौर से गुजर रहे हैं चिह्नित कर सकते हैं. इसके अलावा कस्पासे assays कस्पासे गतिविधि का पता लगा सकते हैं कि apoptosis के साथ जुड़ा नहीं है. LysoTracker इन assays के लिए एक विकल्प नहीं है, लेकिन यह एक उपयोगी पूरक संदर्भ के आधार पर परख हो सकता है.

LysoTracker धुंधला हो जाना कई फायदेअन्य तरीकों पर. क्योंकि यह एक छोटा सा अणु डाई के रूप में transferase (TUNEL परख में प्रयोग किया जाता है) या Annexin वी टर्मिनल के रूप में इस तरह के एक प्रोटीन का विरोध है, यह आसानी से मोटी ऊतकों के माध्यम से diffuses. इसका मतलब यह है कि LysoTracker धुंधला हो apoptosis के समग्र पैटर्न में परिवर्तन के लिए देखने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. इस प्रकार, LysoTracker धुंधला हो जाना का एक विशेष रूप से उपयोगी आवेदन के रूप में पहली पास परख PCD भ्रूण या अलग जीनोटाइप की कोशिकाओं में पैटर्न को निर्धारित करने के लिए या कुछ विषाक्त पदार्थों या दवा उपचार के आवेदन के समग्र प्रभाव को देखने के. इसके अलावा, डाई उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात, प्रयोग के अपने आसानी (कोशिकाओं या ऊतकों बस डूबे जा सकता है), इसके लिए तय किया जा करने की क्षमता और की fluorophore धीरज उच्च मात्रा के लिए LysoTracker आदर्श का उपयोग कर स्क्रीनिंग कोशिकाओं या ऊतकों कि PCD प्रदर्शन कर सकते हैं.

PCD के लिए किसी भी परख के साथ के रूप में, तथापि, प्रयोग के संदर्भ के लिए महत्वपूर्ण है पर विचार करने के लिए. माउस जल्दी भ्रूण के दौरानविकास, एक प्रतिरक्षा प्रणाली के अभाव में मर कोशिकाओं पड़ोसी 22 कोशिकाओं द्वारा phagocytosed किया जा सकता है. यह ज्ञात नहीं है कि कैसे जल्दी से यह होता है. हालांकि, क्योंकि यह संभव है TUNEL सकारात्मक puncta है कि सकारात्मक LysoTracker (चित्रा 1G) नहीं कर रहे हैं, कोशिकाओं phagocytosis द्वारा हटा दिया जा रहा है पहले apoptosis (डीएनए विखंडन) के बाद के चरणों के दौर से गुजर हो सकता है. TUNEL LysoTracker और धुंधला हो ओवरलैप, जब यह संकेत मिल सकता है कि एक सेल या सेल खंडित डीएनए युक्त टुकड़ा phagocytosed किया जा रहा है. अंत में, LysoTracker पॉजिटिव केवल puncta सेलुलर मलबे से संकेत मिलता है कि डीएनए शामिल नहीं करता है, लेकिन पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा मंजूरी दे दी जा सकता है. इस प्रकार, माउस जल्दी विकास के दौरान, परख TUNEL (या LysoTracker) की परवाह किए बिना, धुंधला पैटर्न दोनों कोशिकाओं है कि मर रहे हैं और पड़ोसी मलबे युक्त कोशिकाओं का संकेत कर सकते हैं.

हमारे परिणाम (चित्रा 2A-सी) दिखाने के लिए कि LysoTracker आकलन करने के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है किसुसंस्कृत फर्क ES कोशिकाओं में PCD और इसलिए सभ्य सेल प्रकार की एक किस्म के लिए उपयोगी होने की संभावना है. दिलचस्प है, जब कोशिकाओं 2 एच 2 हे के साथ प्रेरित कर रहे हैं, apoptosis सबसे TUNEL सकारात्मक puncta से गुजरना भी LysoTracker सकारात्मक (चित्रा 2B ", 2C"). यह पता चलता है कि monolayer संस्कृति में, पड़ोसी कोशिकाओं अभी भी के पास मर कोशिकाओं phagocytose करने में सक्षम हो सकता है. वास्तव में 2 एच के एक काफी उच्च खुराक हे 2 (10mM) के साथ कोशिकाओं के विशाल बहुमत TUNEL puncta सकारात्मक होते हैं और अपेक्षाकृत कम LysoTracker धुंधला हो जाना है, सुझाव है कि जब इतने सारे कोशिकाओं मर रहे हैं, कोई भी काफी स्वस्थ करने के लिए गैर के रूप में कार्य कर रहे हैं पेशेवर phagocytes (नहीं दिखाया डेटा). एक महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि अच्छी तरह से नहीं की सराहना की है कि परख की परवाह किए बिना, यह तय कर पाना मुश्किल हो सकता है अगर एक एक मरते हुए सेल है कि उच्च lysosomal गतिविधि या एक पड़ोसी सेल से घिरा हुआ जा रहा है एक मरते हुए सेल की लाश पर देख रहा है हो सकता है, खासकर जबकोशिकाओं करीब निकटता में हैं.

LysoTracker भी 23-26 भोजी का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, और सीरम भुखमरी के जवाब में, विभेदित ES कोशिकाओं LysoTracker धुंधला हो puncta (2A के साथ चित्रा 2D तुलना) की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि हुई प्रदर्शित. यह संभावना (24,25 LysoTracker का उपयोग करते हुए अन्य संदर्भों के रूप में दिखाया गया है) की कमी हुई पोषक तत्वों की उपलब्धता के लिए प्रतिक्रिया में autophagolysosomes और lysosomes के गठन में एक वृद्धि का संकेत है. इसके विपरीत, TUNEL धुंधला हो जाना है, जबकि अभी भी काफी हद तक LysoTracker धुंधला के साथ अतिव्यापी, काफी वृद्धि हुई है, नहीं है यह दर्शाता है कि हालांकि कोशिकाओं सीरम के नुकसान से 24 घंटे के बाद तनाव का अनुभव है, इस तनाव apoptosis प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं था.

इस प्रकार पर विचार करने के लिए (या संभावित लाभ, क्या एक परख के लिए करना चाहता है पर निर्भर करता है) के लिए एक चेतावनी है जबकि LysoTracker apoptosis के क्षेत्रों (के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पड़ोसी कोशिकाओं मर चिह्नित कर सकते हैं किआईएनजी गैर पेशेवर) phagocytes, यह भी कोशिकाओं है कि भोजी के दौर से गुजर रहे हैं चिह्नित कर सकते हैं. PCD की सटीक व्यवस्था निर्धारित करने के लिए, यह सबसे अच्छा है कई assays करने और यदि संभव हो तो, उच्च बढ़ाई ऑप्टिकल या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग करने के लिए विभिन्न संभावनाओं के बीच अंतर है. संक्षेप में, इन उदाहरणों से पता चलता है कि LysoTracker PCD का आकलन करने के लिए एक महान उपकरण है, लेकिन है कि परख के संदर्भ LysoTracker सकारात्मक puncta के बाद सावधानी से विचार किया जाना चाहिए lysosome गतिविधि में एक गैर पेशेवर phagocytosis की वजह से वृद्धि का प्रतिनिधित्व करते हैं या हो सकता है की वजह से 27,28 भोजी .

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम मदद के लिए प्रोटोकॉल संपादन मरिअनी प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. यह काम एक सीआईआरएम Postdoctoral प्रशिक्षण (JLF) अनुदान, एक सीआईआरएम पुलों इंटर्नशिप (TZTT), रॉबर्ट ई. और मई आर राइट फाउंडेशन (FVM), और दक्षिणी कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय (FVM) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen #L-7528
Hanks BSS Invitrogen 14025-076
Paraformaldehyde EMD EM-PX0055-3
Vectashield VECTOR H-1200
DMEM Cellgro 10-013-CV
Non-essential amino acids Cellgro 25-025-CI
Sodium pyruvate Cellgro 25-000-CI
FBS Hyclone SH30071.02
Pen-Strep Invitrogen 15140-122
b-Mercapt–thanol, 50 mM Invitrogen 21985-023
LabTek-II Chamber slides
(8-well)		 Nalge Nunc International 154534
0.1% Gelatin Millipore ES-006-B
Dulbecco's PBS (D-PBS) Cellgro 21-031-CV

Solution Recipes

4% Paraformaldehyde

For 100 ml:

  1. Mix 4 g paraformaldehyde, 90 ml H2O, and NaOH (a drop of 2N NaOH). The paraformaldehyde will not go into solution until you have added some NaOH to increase the pH.
  2. Stir and heat at 60 °C until all the powder is in solution (~10-20 min). Do not overheat.
  3. Add ~10 ml 10x PBS to achieve a final volume of 100 ml.
  4. Store at -20 °C in convenient (~10 ml or ~40 ml) aliquots.

WARNING: Paraformaldehyde in 'frill' form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling.

EB Culture Media

For 500 ml EB Media:

DMEM: 404.5 ml
FBS: 75.0 ml
L-Glutamine: 5.0 ml
Penicillin/Streptomycin: 5.0 ml
Non-essential amino acids: 5.0 ml
Sodium pyruvate: 5.0 ml
β-Mercapt–thanol: 500 μl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baehrecke, E. H. How death shapes life during development. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).
  2. Meier, P., Finch, A., Evan, G. Apoptosis in development. Nature. 407, 796-801 (2000).
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LysoTracker का प्रयोग करने के लिए भ्रूण में क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का पता लगाने और भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का फर्क
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Fogel, J. L., Thein, T. Z. T.,… More

Fogel, J. L., Thein, T. Z. T., Mariani, F. V. Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (68), e4254, doi:10.3791/4254 (2012).

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