Summary
Vi presenterar ett enkelt protokoll för att visualisera områden programmerad celldöd (PCD) i musembryon och differentiera embryonala stamceller (ES) cellodlingar med en lättlöslig färg kallas LysoTracker.
Abstract
Programmerad celldöd (PCD) förekommer hos vuxna för att upprätthålla normal vävnad homeostas och under embryologiska utveckling att forma vävnader och organ 1,2,6,7. Under utvecklingen kan giftiga kemikalier eller genetiska förändringar orsaka en ökning av PCD eller ändra PCD mönster resulterar i utvecklingsstörningar och fosterskador 3-5. För att förstå etiologin av dessa defekter kan studiet av embryon kompletteras med in vitro-analyser som använder differentierande embryonala stamceller (ES-celler).
Apoptos är en väl studerad formen av PCD som involverar både inre och yttre signalering att aktivera kaspas enzymet kaskaden. Karakteristiska cellförändringar inkluderar membran blåsbildning, kärnkraft krympning och DNA-fragmentering. Andra former av PCD inte innebär kaspasaktivering och kan vara slutresultatet av långvarig autophagy. Oavsett PCD vägen, döende celler måste avlägsnas. Hos vuxna immuncellerna perfOrm denna funktion, medan embryon, där immunförsvaret ännu inte har utvecklat sker avlägsnandet av en alternativ mekanism. Denna mekanism innebär angränsande celler (kallas "icke-professionella fagocyter") tar på en fagocytisk roll-de känner igen den "äter mig"-signal på ytan av den döende cellen och uppsluka den 8-10. Efter omvälvning är skräp förs till lysosom för nedbrytning. Sålunda oberoende av PCD mekanism, kan en ökning i lysosomal aktivitet korreleras med ökad celldöd.
För att studera PCD, en enkel analys för att visualisera lysosomer i tjocka vävnader och flerskiktade differentierande kulturer kan vara användbara. LysoTracker färgämnet är en lättlöslig liten molekyl som kvarhålles i sura subcellulära fack såsom lysosomen 11-13. Färgämnet tas upp genom diffusion och genom cirkulationen. Eftersom penetrationen är inte ett hinder, visualisering av PCD i tjocka vävnader och flera lager kulturer är möjligt 12,13 14, begränsad till små prover, histologiska sektioner och kulturer monolager eftersom förfarandet kräver inträde / permeabiliteten av en terminal transferas.
I motsats till Anilin blå, som diffunderar och löses av lösningsmedel, är LysoTracker Röd DND-99 fixerbar, ljusa och stabil. Färgning kan visualiseras med standard lysrör eller konfokalmikroskopi i hel-fäste eller avsnitt med vattenbaserade eller lösningsmedelsbaserade monteringsmedia 12,13. Här beskriver vi protokoll som använder denna färg att titta på konsekvent politik för utveckling i normal och Sonic hedgehog null embryon mus. Dessutom visar vi analys av PCD att skilja kulturer ES cell och presentera en enkel kvantifiering metod. Sammanfattningsvis kan LysoTracker färgning vara ett bra komplement till andra metoder för att upptäcka PCD.
Protocol
1. LysoTracker Färgning av musembryon
- Generera musembryon genom att placera unga (5-6 veckor gamla) kvinnor i manliga stud burar. Övervaka följande morgon för uppkomsten av en vaginal plugg som indikerar att parning har skett. Om honan är gravid, är middagstid på dagen kallas 0,5 DPC (dagar efter samlag). Förfarandet som presenteras här är perfekt för embryon 7-13 DPC.
- Den embryonala dagen av intresse, avliva honan enligt godkända protokoll och ta bort livmodern. Ta bort embryon från decidua i en 10 cm Petri-skål med Hanks BSS (utan fenolrött). Ta bort extra embryonala membran och gör minst en sköljning med Hanks BSS för att avlägsna främmande vävnad och blod.
- Förbered LysoTracker Solution Embryo Färgning (5 mM LysoTracker i Hanks BSS). En lämplig volym för 1-2 kullar är 5 ml. Blanda försiktigt att betala färgen jämnt.
- Lägg embryon till LysoTracker Embryo Färgning solutjonen i ett mikrofugrör eller ampull och inkubera vid 37 ° C under 45 minuter.
- Skölj mycket försiktigt i Hanks BSS fyra gånger, 5 min varje tvätt.
- Fix i 4% paraformaldehyd över natten.
- Skölj en gång i Hanks BSS, 10 minuter, för att ta bort korrigeringen.
- Dehydratisera genom en serie metanol (50%, 75%, 80%, 100%, 5 min varje steg) för att eliminera bakgrundsfärgning. Detta är viktigt för att uppnå bra signal-till-brus under avbildning.
- På denna punkt kan du lagra embryot proverna obestämd tid i metanol vid -20 ° C, skyddat från ljus.
Obs: Ett vävnadsprov kan tas vid varje steg för DNA-genotypning, emellertid, kan det vara mest lämpligt att ta ett prov strax före lagring, så att upp till detta steg alla prover kan vara satsframställda. Samla ett vävnadsprov från svansen, lem eller huvud från varje embryo och sätta alla i separata rör. Rehydrera vävnadsprov och förbereda för genotyping.
2. LysoTracker Färgning av Skilja ES kulturer
- Förbered embryoidkroppar via hängande droppe Metod 15 med en start täthet av 500 celler per 20 ^ droppe.
- Efter 3 dagar överföra embryoidkroppar till suspensionsodling på 10 cm icke vidhäftande Petriskålar (dvs. de som används för bakteriologisk arbete). Kultur för 5 dagar, ändra media varje 2 dagar.
- På dag 7, överföra embryoidkroppar till gelatinerade 8-väl kammaren bilder (lägg 0,1% gelatin till kamrarna, vänta 5 minuter, ta bort och lägga till media). Överför 1-2 embryoidkroppar per kammare.
- Kultur för 10 dagar, byta media varannan dag. Var noga med att placera pipetten i hörnet av kammaren bilden för att inte störa embryoidkroppar kroppen fästa vid glasytan. Även när du lägger färskt medium också placera pipetten i hörnet av kammaren och släpp media långsamt.
- Efter 10 dagar av kulture, att inducera apoptos som positiv kontroll, behandla några av brunnarna med 0,1 mM och 1,0 mM H 2 O 2 (lägg till H 2 O 2 till färskt medium, blanda, tillsätt sedan till cellerna) under 60 minuter. Skölj två gånger med D-PBS och kultur natten i vanliga medier.
- Försiktigt aspirera befintliga media och lägga LysoTracker lösning cellfärgning (500 nM LysoTracker (slutlig koncentration) i media, 300 pl per kammare).
- Inkubera vid 37 ° C under 15 minuter.
- Skölj två gånger med D-PBS 2 gånger, 5 min vardera.
- Fix i 4% paraformaldehyd under 15 min vid RT.
- Skölj två gånger med D-PBS, 5 minuter.
3. Tittar Embryon LysoTracker färgade eller kulturer ES
- Förbered cellprover för mikroskopi genom att aspirera D-PBS; avlägsna kammaren utanför bilden, lufttorkning i ca 5 minuter, och därefter tillsats av ett vattenhaltigt monteringsmedium (Vectashield med DAPI eller liknande). Placera en folie barriär när drying för att minska blekning av fluoroforen. Montera embryon i en djup-depression glasskål eller liten petriskål i Vectashield eller liknande.
- Visualisera med en dissekera eller förening mikroskop utrustat med en rodamin eller Texas Red-filter (LysoTracker RED DND-99, Excitation / Emission: 577/590 nm). Färgningen är typiskt ganska ljus så långa exponeringar är vanligtvis inte nödvändigt.
4. Kvantifiering av resultat med hjälp av avbildningstekniker
- Ta digitala bilder av dina prover under samma exponeringsförhållanden i manuellt läge.
- Öppna bilderna i Adobe Photoshop eller liknande bildbehandlingsprogram. För att bestämma mängden LysoTracker färgning markerar den röda kanalen och tröskeln bilden (konverterar bilden till svart-vit) så att den röda färgningen nu representeras av vita pixlar. Välj vita pixlar och använda histogrammet funktionen att få den totala räkningen.
- Använd den blå kanalen att räknaantalet kärnor i det fältet. Det kan vara bra att föra ett register över räkningen genom att fylla i bilden.
- Anteckna värdena och sedan beräkna den genomsnittliga färgning nivå per cell. Upprepa denna analys med samma tröskel inställning för alla bilder som du vill prova.
5. Representativa resultat
Det är ett normalt mönster av PCD under embryonal utveckling som kan förändras när en tillväxtfaktor gen, såsom Sonic hedgehog (Shh), avlägsnas 16,17. Eftersom LysoTracker är en liten molekyl färgämne som är mycket diffunderbart, kan hela embryot visualiseras att bedöma områden med PCD även djupt inom mesenkymet 12,13 Figur 1 visar mönstret LysoTracker färgning för normala och Shh -. / - Mutant musembryon vid 10.5dpc. I detta skede, är PCD ökat kraftigt i Shh - / - mutant embryon, särskilt i extremiteten och somit regions. Delar av embryot kan avbildas i sin helhet-mount vid högre förstoring (1B) att bedöma den övergripande mönstret. Dissekerade delarna kan också vara sektioneras med en vibrerande mikrotom (1C) eller en kryostat (DF) för att avslöja PCD regioner i detalj.
TUNEL analys görs bäst på tunna sektioner där penetrationen av terminalen transferas är mindre problematiskt. LysoTracker färgning och en TUNEL-analys kan göras i samma vävnad (figur 1D-G). Dessa resultat visar att även om det inte är en strikt 01:01 korrelation mellan LysoTracker och TUNEL färgning allmänna områden PCD överlappning avsevärt. Vid en högre förstoring, är det möjligt att se puncta som färgas positivt med TUNEL-analysen men inte med LysoTracker färgämnet, puncta som färgas endast med LysoTracker färgämnet, och puncta som har överlappande färgning.
När en EB stryks ut på en gelatin-belagd yta, kommer differentierande cellerna migrate utåt. Efter 10 dagars odling, kommer cellerna har differentierats till en mängd olika celltyper inbegripet neuroner, muskelceller, och kardiomyocyter. Kulturerna som visas i figur 2 innehåller blandade populationer av dessa celltyper, men man kunde anpassa vår protokoll att studera PCD av en speciell celltyp av intresse. Till exempel, kan EB behandlas med retinsyra att öka differentieringen av neuroner 19, och därefter LysoTracker analys kan användas för att bedöma neuronal celldöd under olika förhållanden. I det normala odling av differentierade ES-celler, finns det några celler som genomgår PCD och dessa kan detekteras med LysoTracker och / eller TUNEL-analyser (Figur 2A). PCD kan induceras genom ett antal olika cytotoxiska medel såsom väteperoxid (H 2 O 2) som inducerar oxidativ skada och initierar den apoptotiska vägen 20,21. En låg dos av H 2 O 2 ökar bådeLysoTracker och TUNEL färgning jämfört med ingen behandling, medan en hög dos leder cellkrympning och utbredd LysoTracker och TUNEL positivitet. I likhet med resultaten i embryot, är det möjligt att se puncta som färgas positivt med TUNEL-analysen men inte med LysoTracker färgämnet, puncta som färgas endast med LysoTracker färgämnet, och puncta som har överlappande färgning. Konsekvensen av tillämpningen av ett cytotoxiskt medel som inducerar apopotosis jämförs med serumsvält betingelser som inducerar autophagy (figur 2D). Celler som har genomgått en period av serumsvält (1 timme) uppvisar ett annat mönster där LysoTracker och TUNEL färgning inte mycket korrelerar. LysoTracker färgning mycket ökar jämfört med obehandlade kulturer, men TUNEL positivitet är på en normal nivå.
Använda vanliga verktyg i Adobe Photoshop kan LysoTracker färgning kvantifieras med en enkel tröskling metodsom gör att man kan beräkna den genomsnittliga färgning nivån för en population av celler. Fig. 3A-B visar hur en provbild ser under kvantifieringen processen. Börjar med en baslinje bild med LysoTracker färgning i den röda kanalen och DAPI-färgade kärnor i den blå kanalen (panel 3A), den röda kanalen av denna bild tröskel för att konvertera bilden till svart-vitt och de vita pixlarna var därefter väljs och räknades (figur 3A). En trösklingsbaserad nivå valdes som representerar mönstret LysoTracker färgning. Som med alla kvantifiering metod som använder bilder, är det viktigt att undvika överexponeras dina bilder eftersom det skulle kunna leda till över-betonar skillnader. Antalet kärnorna i fältet kan sedan räknas genom att titta på endast den blå kanalen (figur 3B) och som markerar kärnorna med användning av en ritning verktyg, såsom en pensel medan räkna (Figur 3B). Man kan då uttrycka the nivån av färgning genom beräkning av genomsnittliga färgning per cell (antal pixlar / kärnor räkna). Om man vill använda denna algoritm för hög genomströmning screening kan de flesta screening paket mäter ljusstyrkan i en viss kanal och har också en funktion objektidentifierare som räknas kärnor i ett fält, men för de flesta typiska användningsområden den manuella metoden är snabb och enkelt. För att ge ett exempel, ett prov region från figurerna 2A-C kvantifieras och resultaten bekräftar att ökande koncentrationer av H 2 O 2 resulterar i en högre LysoTracker färgning (figur 3C).
Figur 1. LysoTracker färgning i normala och Shh - / - embryon. A, A 'Normal och Shh -. / - Musembryon på 10,5 DPC, färgas med LysoTracker röd, monterade i Vectashield och fotograferades underen epiflourescence dissekera mikroskop. Parentes anger placeringen av frambenen B, B 'forelimb av normala och Shh -.. / - Embryona avbildas vid högre förstoring. Observera de normala domäner celldöd inklusive "Posterior Nekrotisk Zone" (markerade med en asterisk) och en region i den proximala mesenkym av lemmen knopp (markerad med en pil). Shh null lemmar uppvisar starkare färgning i den mediala och distala delen . C, C ". Medial sektioner genom forelimb knopp av både normala och noll lem knoppar. Notera närvaron av färgning i proximala mesenkymet (pil) och AER (pilhuvud) av den normala delen knopp och den starka färgning inuti dorsala och ventrala och distala mesenkym inom null extremiteten knopp. DF. Samma sektionen (12 mikron, frysta avsnitt) avbildades för LysoTracker och TUNEL-färgning (Roche 1.684.795). Avsnittet passerar genom den distala delen av Shh null mesenchyme. Pilspetsen pekar på AER. Notera hur den totala mönstret är mycket likartad med båda metoderna, men färgningen inte överlappar helt. G, G '. Vid högre förstoring av AER och mesenkym, kan man se både närvaron av puncta som är LysoTracker eller TUNEL-positiva endast liksom puncta som har överlappande färgning.
Figur 2. LysoTracker färgning i differentierade ES-celler. Differentierande cellerna ströks ut på 8-kammare glider i frånvaro av LIF. För att visa hur LysoTracker och TUNEL färgning jämföra var apoptos väg inducerad med 2 olika doser av H 2 O 2, medan autophagy vägen inducerades med 1 timmes serumsvält. Dessa bilder togs med en Zeiss LSM5 konfokalmikroskop A-A'':. Obehandlade kulturer visar några vanliga apoptos vilket framgår av LysoTRacker och TUNEL färgning. Mönstret med båda teknikerna mestadels överlappar (vita pilar), men kan man se några puncta som är LysoTracker positiva endast (röda pilar) B-B'', CC ":. Behandling med ökande mängder av H 2 O 2 stimulerar apoptos . Den lägre dosen visar mer LysoTracker och TUNEL positiva puncta jämfört med obehandlade celler. Den högre dosen inducerar i ännu mer LysoTracker och TUNEL positiv puncta. Vita pilar pekar på överlappande färgning, medan röda pilarna pekar på puncta som är positiva för LysoTracker endast. Det är också möjligt att se puncta som endast positivt för TUNEL färgning (gröna pilar) DD ":. serumsvält kan inducera autophagy, vilket kan stimulera en ansamling av material i lysosomer och autophagolysosomes. Notera hur många fler LysoTracker puncta är synliga jämfört med obehandlade kulturer. TUNEL positiv puncta är närvarande (av vilka de flesta har överlappande LysoTracker fläckning, vita pilar), emellertid, är antalet inte kraftigt ökade jämfört med obehandlade förhållanden. Dessutom, under serumsvält förhållanden, LysoTracker endast positiva puncta är mycket vanliga (röda pilar).
Figur 3. Kvantifiering metod för att bedöma nivån på färgning i en population av celler med hjälp av Adobe Photoshop. A: En del av fig 2A valdes och LysoTracker (röd kanal) och DAPI-färgning (kärnor, blå kanal) visas i denna panel A ':. Den röda kanalen i figur 3A trösklas för att omvandla den till en svart-och -vit bild. De vita pixlar kan sedan väljas och räknas med histogrammet funktionen B-B ':. Den blå kanalen visar kärnorna och medan räkna dem, kan bilden förses med en ritning funktion som en pensel C:. Detta är ett exriklig kvantifiering av ett prov från panelerna 2A-C. Uppgifterna visas som bildpunkter per kärnor. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viktiga kännetecken för apoptos inkluderar detektion av DNA-skada med TUNEL-analysen, tillsammans med detekteringen av kaspas-aktivitet (detekterad med mAb eller en bindningsmolekyl såsom zVAD-fmk), observation av cellulära förändringar, och presentationen av fosfatidylserin (PS ) på membranytan (detekteras av Annexin V-bindning). Det finns vissa nackdelar med var och en av dessa analyser. Till exempel tränger terminalen transferas används i TUNEL-analysen inte utöver några cellager. Även Annexin V kan markera celler som inte genomgår apoptos som de som har membran skada (Annexin V får inuti cellen och markerar PS på den inre bipacksedeln). Dessutom kaspas analyser kan upptäcka kaspas verksamhet som inte är förknippad med apoptos. LysoTracker är inte en ersättning för dessa analyser, men det kan vara ett bra komplement analys beroende på sammanhanget.
LysoTracker färgning har flera fördelarjämfört med andra metoder. Eftersom det är en liten molekyl färgämne i motsats till ett protein såsom terminalt transferas (används i TUNEL analys) eller annexin V diffunderar det lätt genom tjocka vävnader. Detta innebär att LysoTracker färgningen är särskilt användbar för att söka efter förändringar i det totala mönstret av apoptos. Sålunda är en särskilt användbar tillämpning av LysoTracker färgning som en first-pass-analys för att bestämma mönster av PCD i embryon eller celler av olika genotyper eller att titta på den totala effekten av tillämpningen av vissa toxiner eller läkemedelsbehandlingar. Dessutom, den höga signal-till-brus-förhållande av färgämnet, dess användarvänlighet (kan celler eller vävnader enkelt sänkas ned), dess förmåga att fixeras och uthållighet av fluoroforen göra användningen av LysoTracker idealisk för stora volymer screening av celler eller vävnader som kan uppvisa PCD.
Som med någon analys för PCD, är dock inom ramen för experimentet viktigt att beakta. Under tidiga embryonala musutveckling, i avsaknad av ett immunsystem, kan döende celler kan fagocyteras av närliggande celler 22. Det är inte känt hur snabbt detta sker. Men eftersom det är möjligt att hitta TUNEL positiv puncta som inte LysoTracker positiva (figur 1G), kan celler genomgå de senare stadierna av apoptos (DNA-fragmentering) innan de tas bort av fagocytos. När TUNEL och LysoTracker överlappar färgning, kan detta tyda på att en cell eller fragment innehållande fragmenterat DNA som fagocyteras. Slutligen kan LysoTracker-positiva endast puncta visar cellulära skräp som inte innehåller DNA utan rensas av angränsande celler. Sålunda, under den tidiga utvecklingen mus, oavsett analysen (TUNEL eller LysoTracker), kan färgningsmönster tyder båda cellerna som är döende och angränsande celler innehållande skräp.
Våra resultat (figur 2A-C) visar att LysoTracker kan vara mycket användbar för att bedömaPCD i odlade differentierande ES-celler och är därför sannolikt att vara användbara för en mångfald odlade celltyper. Intressant, när cellerna stimuleras med H 2 O 2 att genomgå apoptos, mest TUNEL positiva puncta är också LysoTracker positiva (Figur 2B ", 2C"). Detta tyder på att i monolagerkultur kan grannceller fortfarande kunna fagocytera närliggande döende celler. I själva verket med en betydligt högre dos av H 2 O 2 (10 mM), den stora majoriteten av celler innehåller TUNEL positiv puncta och det finns relativt lite LysoTracker färgning, vilket tyder på att när så många celler dör, ingen är frisk nog att fungera som icke- professionella fagocyter (data ej visade). En viktig punkt som inte är väl uppskattat är att oavsett analys, kan det vara svårt att avgöra om man tittar på en döende cell som har hög lysosomala aktivitet eller liket av en döende cell som uppslukas av en granne cell, speciellt närceller är i närheten.
LysoTracker har också varit ett användbart verktyg för att bedöma autophagy 23-26 och som svar på serumsvält, differentierade ES-celler uppvisar en markant ökning av antalet LysoTracker färgning puncta (jämför figur 2D med 2A). Denna sannolika indikerar en ökning i bildningen av autophagolysosomes och lysosomer som svar på minskad tillgänglighet näringsämnen (såsom har visats i andra sammanhang med LysoTracker 24,25). I motsats därtill är TUNEL-färgning, medan fortfarande till stor del överlappar LysoTracker färgning, inte kraftigt ökat, vilket indikerar att även om cellerna upplevde stress från förlust av serum, efter 24 timmar, var denna stress inte tillräcklig för att inducera apoptos.
Således en varning att överväga (eller potentiell fördel, beroende på vad man vill analys) är att medan LysoTracker kan markera regioner av apoptos (döende celler liksom grannening icke-professionella fagocyter), kan det markerar också celler som genomgår autophagy. För att bestämma den exakta mekanismen av PCD, är det bäst att göra flera analyser och om möjligt använda hög förstoring optiska eller elektronmikroskopi tekniker för att skilja mellan de olika möjligheterna. Sammanfattningsvis Dessa exempel visar att LysoTracker är ett bra verktyg för att bedöma PCD men att det gäller analysen bör övervägas noga eftersom LysoTracker positiv puncta kan utgöra en ökad lysosomaktivitet på grund av icke-professionella fagocytos eller på grund av autophagy 27,28 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar i Mariani labbet för att få hjälp att redigera protokollet. Detta arbete har finansierats av en CIRM postdoktoral utbildning Grant (JLF), en CIRM BRIDGES praktik (TZTT), Robert E. och maj R. Wright Foundation (FVM) och University of Southern California (FVM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | #L-7528 | |||||||||||||||
| Hanks BSS | Invitrogen | 14025-076 | |||||||||||||||
| Paraformaldehyde | EMD | EM-PX0055-3 | |||||||||||||||
| Vectashield | VECTOR | H-1200 | |||||||||||||||
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |||||||||||||||
| Non-essential amino acids | Cellgro | 25-025-CI | |||||||||||||||
| Sodium pyruvate | Cellgro | 25-000-CI | |||||||||||||||
| FBS | Hyclone | SH30071.02 | |||||||||||||||
| Pen-Strep | Invitrogen | 15140-122 | |||||||||||||||
| b-Mercapt–thanol, 50 mM | Invitrogen | 21985-023 | |||||||||||||||
| LabTek-II Chamber slides (8-well) |
Nalge Nunc International | 154534 | |||||||||||||||
| 0.1% Gelatin | Millipore | ES-006-B | |||||||||||||||
| Dulbecco's PBS (D-PBS) | Cellgro | 21-031-CV | |||||||||||||||
Solution Recipes 4% Paraformaldehyde For 100 ml:
WARNING: Paraformaldehyde in 'frill' form (compressed small pellets) is less powdery and can therefore be measured outside of a hood. However you should still wear a protective dust mask (N95 at least) during handling. EB Culture Media For 500 ml EB Media:
|
|||||||||||||||||
References
- Baehrecke, E. H. How death shapes life during development. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).
- Meier, P., Finch, A., Evan, G. Apoptosis in development. Nature. 407, 796-801 (2000).
- Ikonomidou, C. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science. 287, 1056-1060 (2000).
- Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder. Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).
- Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker. Cytometry A. 53, 9-21 (2003).
- Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
- Qu, X. Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development. Cell. 128, 931-946 (2007).
- Grimsley, C., Ravichandran, K. S. Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals. Trends Cell Biol. 13, 648-656 (2003).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
- Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Cytometry. 33, 348-354 (1998).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S. 3rd, Rogers, J. M. Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy. Methods. 18, 473-480 (1999).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Chiang, C. Manifestation of the limb prepattern: limb development in the absence of sonic hedgehog function. Dev. Biol. 236, 421-435 (2001).
- Ishibashi, M., McMahon, A. P. A sonic hedgehog-dependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo. Development. 129, 4807-4819 (2002).
- Schuldiner, M. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Brain Res. 913, 201-205 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Dumont, A. Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappaB. Oncogene. 18, 747-757 (1999).
- Hampton, M. B., Orrenius, S. Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis. FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).
- Wood, W. Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos. Development. 127, 5245-5252 (2000).
- Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death. Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).
- Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes. Autophagy. 2, 39-46 (2006).
- Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes. Autophagy. 1, 23-36 (2005).
- Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system. Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
- Klionsky, D. J. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes. Autophagy. 4, 151-175 (2008).
