Summary
Nous présentons une méthode simple pour produire des dispositifs microfluidiques capables d'appliquer les mêmes conditions dynamiques à plusieurs souches distinctes, sans avoir besoin d'une salle blanche ou lithographie douce.
Abstract
L'étude des réponses cellulaires aux changements environnementaux pose de nombreux défis expérimentaux: les cellules doivent être imagé dans des conditions changeantes, souvent de manière comparative. Plaques multipuits sont couramment utilisées pour comparer différentes souches ou des lignées cellulaires, mais de permettre un contrôle limité sur la dynamique de l'environnement. Dispositifs microfluidiques, d'autre part, de permettre exquise contrôle dynamique des conditions environnantes, mais il est difficile d'image et de distinguer plus de quelques souches en eux. Nous décrivons ici une méthode pour fabriquer facilement et rapidement un dispositif microfluidique capable d'appliquer les conditions changent dynamiquement à de multiples souches de levures différentes dans un même canal. L'appareil est conçu et fabriqué par des moyens simples, sans la nécessité d'une lithographie douce. Il se compose d'un canal d'écoulement en forme de Y attaché à une seconde couche hébergeant micropuits. Les souches sont placés dans des micropuits distincts, et imagée dans exactement les mêmes conditions dynamiques. Nous démonstrate l'utilisation du dispositif de mesure de la localisation des protéines réponses à des impulsions de changement de nutriments dans différentes souches de levure.
Introduction
Les cellules sont constamment réagir à un environnement changeant dynamiquement, en changeant leur métabolisme, profil transcriptionnel et fonctions cellulaires. Pour étudier ces phénomènes, les méthodes qui permettent de quantifier ces changements sont nécessaires. Un type de lecture de ces réponses est le changement dans la localisation des facteurs de stress liés à la transcription en réponse à un stress nutritionnel.
Dispositifs de microfluidique 1 ont été utilisés pour manipuler dynamiquement des conditions environnementales dans les cellules 2-4. Ils présentent plusieurs avantages pour l'imagerie de cellules vivantes: l'environnement des cellules peuvent être contrôlées avec précision et dynamique a changé, les cellules peuvent être imagée en direct à tout moment, y compris lors de la manipulation des conditions extérieures, et des volumes de réactifs minimales sont requises. Une conception très simple pour un dispositif microfluidique, permettant une alternance entre deux conditions, est un dispositif en forme de Y 2. Nous utilisons régulièrement en forme de Y dispositifs microfluidiques qui permettentapplication des changements dynamiques aux cellules dans le canal. Nous utilisons ce dispositif pour suivre les changements de localisation des facteurs de stress marquées par fluorescence de transcription liés à des cellules de levure. Nous suivons ces changements dans l'évolution des conditions nutritionnelles. Par exemple, nous pouvons fournir une impulsion (ou une série d'impulsions) de glucose milieu contenant dans un délai de plus de glucose et moyen terme, à une résolution temporelle très fine. Souvent, dans ces expériences, on est intéressé à comparer les réponses des souches cellulaires différentes (par exemple, différents mutants ou différents isolats sauvages). Le canal en forme de Y est limitée à une souche dans chaque canal - si plus d'une souche est utilisé, il n'existe pas de moyen simple de faire la distinction entre les souches. Pour remédier à cela, les différents canaux peuvent être utilisés. Si nous voulons appliquer les mêmes conditions dynamiques de plusieurs souches, nous tenons à associer le concept Y-canal avec de multiples canaux. Il ya deux défis dans la mise en œuvre de cette solution: Il peut être difficile d'appliquer til mêmes conditions en même temps à tous les canaux, et il existe une limitation géométrique au nombre de canaux en Y qui peuvent être montés dans un seul appareil. Nous avons donc cherché un moyen pour visualiser plusieurs souches dans un canal dans des conditions dynamiques.
Ici, nous décrivons un dispositif à deux couches microfluidique destiné aux souches d'imagerie multiples dans un canal dans les mêmes conditions dynamiques. La couche inférieure est constituée de couches minces PDMS avec une rangée de trous. Cette couche est attachée à la lamelle de verre créant des puits dans lequel nous allons placer les différentes souches, les faire adhérer à la concanavaline A sur le verre. La seconde couche est un dispositif en forme de Y microfluidique créé en utilisant la méthode du ruban adhésif 5. Après avoir placé les souches dans les puits de la seconde couche est rapidement alignée et fixée à la première, la création d'une chaîne de plusieurs puits qui contiennent les différentes souches. Ce dernier dispositif permet de suivre plusieurs souches dans un canal, où tous lessouches sont soumis aux mêmes conditions à la même heure. Toute la conception et de la production qui peut être fait sur la paillasse, avec des moyens simples, sans la lithographie douce.
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Protocol
1. Création d'un Master Scotch-ruban 5
- Dessiner ou imprimer souhaité mise à microcanaux, à l'échelle sur du papier. Dans notre cas, la conception se compose de deux canaux en Y, chacun 3 mm de large (figure 2).
- Couvrir d'un verre coulissant avec des couches de scotch. Le nombre de couches détermine la hauteur du canal (environ 60 um par couche). Nous avons utilisé 3 couches scotch.
- Placer le schéma de configuration sur une surface plane. Aligner la glissière sur le modèle de conception. Découpez soigneusement le ruban adhésif sur la lame de verre avec un scalpel en fonction de la mise en page.
- Enlever le scotch de toutes les régions de la lame de verre, sauf ceux de la mise en page du microcanal.
- Placer la lame dans un four de chauffage à 65 ° C pendant 2-3 min. Nettoyer délicatement avec de l'éthanol.
2. Fabrication d'un dispositif microfluidique PDMS
- Mélanger la base et composants durcisseurs de PDMS comme recommandé par le fabricant. Nous utilisons une 10:01rapport de la base à l'agent de durcissement. Verser environ 30 ml de mélange PDMS dans une boîte de Petri à une hauteur de ~ 0,5 cm. Dégazer le PDMS dans le vide si nécessaire. Plonger la lame de verre dans le PDMS avec du scotch à motifs vers le haut. Placer le motif après le PDMS empêche la formation de bulles d'air entre la lame et le fond plat. Cure de 48 h à 65 ° C, en s'assurant que le plat est à l'horizontale à l'aide d'un niveau à bulle.
- Dans un nouveau plat de Pétri de 90 mm verser 3 ml de mélange PDMS, résultant en une couche d'environ 0,5 mm de profondeur. (Si la tournette est disponible, il peut être utilisé pour cette étape).
- Degas et guérir qu'en 2.1.
- Découper délicatement le dispositif microfluidique à la taille désirée avec un scalpel. Cette couche sera appelée "couche d'écoulement".
- Découpez un morceau de taille similaire de couche mince PDMS à partir du second plat de Pétri. Ce sera dite "couche de puits".
- Utiliser un perforateur de taille appropriée biopsie (On utilise 1,2 mm de diamètre) à percer des trous pour les entrées et les sorties de la couche d'écoulement. Placer la couche de puits sur une lame de verre d'épaisseur sur la configuration d'poinçon et hors des puits, en utilisant 2 mm ID biopsie perforateur, en alignement avec les micro-canaux sur la mise en page.
- Nettoyer les deux couches de PDMS ainsi que de couvre un verre 24 mm x 60 mm avec de l'éthanol. Sécher à l'air et à garder propre.
- Plasma traiter à la fois la lamelle de verre et la couche de PDMS puits en utilisant soit graveur plasma standard (pour les non-réversible collage) ou un dispositif de traitement à main corona 6 pour collage réversible. Placer soigneusement la couche de puits au-dessus de la lamelle couvre-objet pour provoquer l'adhérence (figure 3). Frottez doucement les bulles d'air (si nécessaire).
3. Expérience d'imagerie cellulaire
- Assurez-vous que le support souhaité dans des seringues prêtes appropriés reliés à des tubes en plastique flexibles d'un diamètre intérieur de 0,02 "(Tygon) dans la pompe seringue.
- Cultivez S. cerevisiae à la phase désirée dans YPD liquide. Vortex fond et lieu à 300 μl de chaque souche dans un tube à centrifuger.
- Placez délicatement 1 pl de la concanavaline A (sigma) 2 mg / ml dans chaque puits. Laver la concanavaline A l'excès de chaque puits deux fois par pipetant doucement l'eau.
- Alors que la concanavaline A est le séchage, laver deux fois avec 300 souches ul de milieu SC dépourvu de glucose. Lavage du glucose résiduel à partir des parois cellulaires permet une bonne adhérence à la concanavaline A.
- Vortex cellules à fond. Pipeter 0,75 pi ou moins de chaque suspension cellulaire dans son propre puits (figure 3). Lavez délicatement les cellules résiduelles avec un milieu riche. Les deux étapes suivantes doivent être effectuées rapidement afin d'empêcher les cellules de se tarir.
- Plasma traiter la puce et les puits à fond en utilisant l'appareil de traitement corona à main, en faisant attention de ne pas frapper directement les puits. Placez délicatement la puce sur le puits, en accordant une attention particulière à l'alignement entre les deux (cette étape peut être effectuée sous un stéréoscope). Appuyez doucement sur pour faire adhérer les deux couches de PDMS. Remplir lentement l'appareil complètement avec environ 50 ul milieu riche en s'assurant qu'aucune bulle d'air ne reste dans le canal.
- Connectez l'appareil, insérer les tubes dans les entrées appropriées et commencer à flux média. Veillez à ce que les bulles d'air sont introduits dans l'appareil, car ils peuvent être difficiles à enlever, ce qui peut être accompli en débranchant une entrée ou de sortie et en tapotant doucement sur le périphérique où les bulles sont, en faisant attention de ne pas casser la lamelle de verre.
- Placez-le sous microscope et trouver des points d'imagerie appropriées dans chaque puits.
- Maintenir les cellules dans un milieu riche écoulement pendant 1 heure ou plus pour permettre la récupération en cas de besoin.
- Commencez l'expérience: nous utilisons flux constant de chacun des deux pompes à seringues pour empêcher le retour des médias, en changeant les débits relatifs au choix. A la mise en pompe à 0,8 ml / h et la pompe B et 0,2 ml / hr élément de support d'un écoulement au-dessus de 80% de la largeur de la chaîne (figure 4). Cela peut être dynamiquement cpendu en changeant les deux débits. Stabiliser les nouvelles conditions dans les secondes sur toute la longueur de la chaîne 2.
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Representative Results
Pour démontrer la séparation entre les différentes souches nous imagée deux souches de levures distinctes dans les puits de rechange. Imagerie la pleine puits montre aucune fuite cellulaire entre les puits (figure 5a, b). Les deux souches ont le même facteur de transcription MSN2 marqués avec la YFP. Pour tester l'effet simultané de manière dynamique l'évolution des conditions, nous avons changé les débits dans les deux canaux d'entrée, créant ainsi une étape de milieu sans glucose-, qui a abouti à la localisation de MSN2-YFP dans le noyau (figure 5c, d). La réponse mesurée à tous les puits produite en même temps, montrant le dispositif peut être utilisé pour l'application de conditions dynamiques simultanées à puits multiples.
Figure 1. La conception du dispositif. Le dispositif est composé d'une lamelle, une mince «Wells» et une couche «Flow» couche à laquelle le tube est connela Direction exécutive.
Figure 2. Conception de la couche de flux. Moule scotch est fait pour cette couche. Ici, nous avons utilisé deux canaux en Y de directions opposées.
Figure 3. Couche de puits. La fine couche de PDMS avec l'emporte-pièce puits est collée à une lamelle de verre. Puis ConA est placé dans chaque puits et laisser sécher. Les cellules sont ensuite chargées dans les 10 puits.
Figure 4. Couverture canal contrôlé. En contrôlant les débits relatifs des deux entrées d'un canal Y, une fraction déterminée de sa largeur est recouverte d'un milieu fluide par rapport à B. (a) à gauche chann el: Flowing à 0.8ml/hr (rouge) et 0,2 ml / h (clair) se traduit par 80% / 20% de couverture. Canal droit: Flowing les médias à 0,5 ml / h se traduit par 50% / 50% de couverture. (B) le dispositif de photographies avec 10% / 90%, 50% / 50% et 90% / 10% des débits.
Figure 5. Expérience dynamique avec plusieurs souches de levures. (A, b) entier et des images de puits contenant des cellules de levure avec (b) ou sans (a) HTB2-mCherry marquage, ne montrant aucune fuite de la cellule entre les puits. (C, d) Réponse des cellules dans deux puits à une étape de non-glucose à t = 0. MSN2-YFP se localise dans le noyau dans le même temps à la suite de l'étape, ce qui montre les changements simultanés de médias dans les deux puits. (E) le temps de pistes nucléaires-MSN2-YFP niveaux dans des cellules individuelles analysées à partir de l'un des puits à (c, d)./ Ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
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Discussion
Dans cet article, nous présentons une méthode de paillasse simple pour créer un dispositif microfluidique qui permet suivants souches de levures plusieurs simultanément dans des conditions dynamiques. Après plusieurs souches dans un canal fournit un outil fiable pour comparer la dynamique des réponses des cellules individuelles dans des souches multiples. Un avantage de notre approche est la capacité à fabriquer le dispositif avec des techniques simples, sans la nécessité d'une salle blanche. En fait, nous avons également procédé, le protocole en sautant les opérations de traitement par plasma (par pas de 2.9 et 3.6) et a obtenu de bons résultats, si les laboratoires sans aucun équipement de plasma peut toujours effectuer le protocole.
En ensemençant chacune des souches différentes dans son propre bien nous évitons cellule de mélange lors du montage de l'appareil, tout en permettant l'écoulement moyen d'atteindre les cellules pendant l'expérience. Un point critique dans ce protocole est de ne pas laisser les cellules se dessécher avant refusion moyen sur eux (étapes 3,4 à 3,6). Drying sur qui affecte gravement la viabilité des cellules, tout en essayant de fermer le dispositif de support trop à chacun des résultats et à des problèmes d'adhérence entre les couches de PDMS deux. Ces contraintes nous obligent à laisser la couche de puits dans l'appareil, plutôt que de le retirer après que les cellules se sont installés dans leur tache. La couche de puits, par conséquent, doit être suffisamment profonde pour contenir la gouttelette initiale de cellules ensemencées, mais aussi mince que possible, de sorte que le rapport d'aspect des puits permet un débit moyen d'atteindre leur fond et les cellules d'acquérir des signaux externes via débit direct.
Le dispositif tel que nous décrivons ici est limitée à environ 5 souches par canal. Nous avons l'habitude de créer des dispositifs à deux canaux adjacents à Y directionnalités opposées (figure 2). Même si cela peut être étendu à quelques canaux plus, ou un peu plus de puits par canal, il n'est pas encore aussi à haut débit que certains des dispositifs de type VLSI 7, qui jusqu'à présent n'ont pas été appliquées aux cellules vivantes.Nous notons, toutefois, que l'objet principal de ce dispositif est de soumettre différentes souches à des conditions exactement les mêmes en imagerie leurs réponses, il ya des limites à l'imagerie simultanée qui découlent du nombre de souches imagée, indépendamment de la mise en œuvre dispositif: au fort grossissement, les souches doivent être imagé de manière séquentielle, par conséquent, les souches plus imagée, plus les différences de temps d'imagerie entre la souche première et la dernière.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
YG est soutenu par une bourse de la BID. IN est un garçon Alon et membre du corps professoral du Edmond J. Safra Center for Bioinformatics Université de Tel Aviv . Cette recherche a été financée par l'ISF subvention 1499/10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ||
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 | |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) | |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 | |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 | |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2" |
References
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).
- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters. Chips & Tips. , (2010).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
