Einer mikrofluidischen Vorrichtung für ein Studium mehrere verschiedene Stämme

Summary

Wir stellen eine einfache Methode zur mikrofluidischen Vorrichtungen, die nach vergleichbaren dynamischen Bedingungen, um mehrere verschiedene Stämme zu produzieren, ohne die Notwendigkeit für einen Reinraum oder weiche Lithographie.

Abstract

Die Untersuchung von Zell-Antworten auf Veränderungen der Umwelt darstellt vielen experimentellen Prüfungen: Zellen müssen unter wechselnden Bedingungen bebildert werden, oft in einer vergleichenden Weise. Multiwell Platten werden routinemäßig verwendet, um viele verschiedene Stämme oder Zelllinien zu vergleichen, aber eine beschränkte Kontrolle über die Umwelt Dynamik. Mikrofluidikvorrichtungen, auf der anderen Seite erlauben exquisite dynamische Kontrolle über den äußeren Bedingungen, aber es wird ein Bild anspruchsvoll und unterscheiden mehr als einige Stämme in ihnen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von leicht und schnell eine Mikrofluidik-Vorrichtung in der Lage ist Aufbringen dynamisch ändernden Bedingungen an mehreren verschiedenen Hefestämmen in einem Kanal. Das Gerät ist so konstruiert und hergestellt mit einfachen Mitteln, ohne die Notwendigkeit für weiche Lithographie. Es besteht aus einem Y-förmigen Strömungskanal an einer zweiten Schicht zusammengesetzt beherbergen Mikrowells. Die Stämme werden in separate Vertiefungen platziert und abgebildet unter den exakt gleichen dynamischen Bedingungen. Wir demonstrate die Verwendung der Vorrichtung zur Messung Proteinlokalisierung Antworten auf Impulse des Nährstoffs Veränderungen in verschiedenen Hefestämmen.

Introduction

Die Zellen werden ständig reagieren zu einer sich dynamisch verändernden Umwelt, indem sie ihren Stoffwechsel, Transkriptions-Profil und zellulärer Funktionen. Um diese Phänomene zu studieren, sind Methoden, die solche Veränderungen quantifizieren können benötigt. Eine Art von Anzeige für solche Reaktionen ist die Änderung in der Lokalisierung von stressbedingten Transkriptionsfaktoren in Reaktion auf ernährungsphysiologischen Stress.

Mikrofluidikvorrichtungen ¹ verwendet wurden, um dynamisch manipulieren Umgebungsbedingungen zu Zellen ^2-4. Sie stellen mehrere Vorteile für lebender Zellen: die Umgebung der Zellen genau gesteuert werden kann und dynamisch verändert; Zellen können Live-abgebildete jederzeit, einschließlich während der Manipulation von äußeren Bedingungen und minimalen Volumina Reagenz benötigt. Eine sehr einfache Konstruktion für eine Mikrofluidik-Vorrichtung, so dass Wechsel zwischen zwei Bedingungen ist eine Y-förmige Vorrichtung ^2. Wir verwenden routinemäßig Y-förmigen mikrofluidischen Systemen, mit denenAnwendung der dynamischen Änderungen in den Zellen in dem Kanal. Wir verwenden dieses Gerät zur Lokalisierung Veränderungen der fluoreszenzmarkierten stressbedingte Transkriptionsfaktoren in Hefezellen zu folgen. Wir folgen diese Veränderungen unter wechselnden Ernährungsbedingungen. Zum Beispiel können wir ein Impuls (oder eine Reihe von Impulsen) Glucose-haltigem Medium in einem Zeitraum von nicht-Glucose-Medium, bei einer sehr feinen Zeitauflösung. Oft in solchen Experimenten ist ein interessiert Vergleichen der Antworten von verschiedenen Zell-Stämme (z. B. verschiedene Mutanten oder Wildtyp verschiedene Isolate). Der Y-förmige Kanal wird an einem Stamm in jedem Kanal begrenzt - falls mehr als ein Stamm verwendet wird, gibt es keinen einfachen Weg, um zwischen den Stämmen zu unterscheiden. Um dies zu überwinden, kann unterschiedliche Kanäle verwendet werden. Wenn wir die gleiche Dynamik Bedingungen mehrere Stämme gelten wollen, würden wir gerne die Y-Channel-Konzept mit mehreren Kanälen zu verbinden. Es gibt zwei Herausforderungen bei der Umsetzung dieser Lösung: Es kann schwierig sein, t geltener gleichen Bedingungen zur gleichen Zeit, um alle Kanäle, und es ist eine geometrische Einschränkung auf die Anzahl der Y-Kanäle, die in einem Gerät montiert werden kann. Wir waren daher auf der Suche nach einem Weg für die Anzeige mehrere Stämme in einem Kanal unter dynamischen Bedingungen.

Hier beschreiben wir ein zweischichtiger Mikrofluidikvorrichtung zum Abbilden mehrerer Stämme in einem Kanal unter den gleichen dynamischen Verhältnissen bestimmt. Die untere Schicht besteht aus dünnen PDMS mit einer Lochreihe. Diese Schicht wird auf das Deckglas Schaffung Vertiefungen, in welche man die verschiedenen Stämmen platzieren, anhaftendem sie mit Concanavalin A auf dem Glas wird angebracht. Die zweite Schicht ist eine Y-förmige Mikrofluidikvorrichtung erstellt unter Verwendung der Tesafilm Methode ^5. Nach dem Platzieren der Stämme in den Wells die zweite Schicht schnell ausgerichtet und an dem ersten und schafft einen Kanal mit mehreren Vertiefungen, die die verschiedenen Stämme enthalten. Dieser letzte Gerät ermöglicht nach mehreren Stämmen in einem Kanal, wo alleStämme sind mit den gleichen Bedingungen an der exakt gleichen Zeit unterworfen. Das gesamte Design-und Produktionsprozess kann auf dem Tisch gemacht werden, mit einfachen Mitteln, ohne weiche Lithographie.

Protocol

Ein. Erstellen eines Scotch-Tape Master ⁵

1. Zeichnen oder ausdrucken gewünschten Mikrokanal Layout, zu skalieren, auf dem Papier. In unserem Fall ist das Design besteht aus zwei Y-förmige Kanäle, die jeweils 3 mm breit (Abbildung 2).
2. Decken einen Glasobjektträger mit Schichten von Klebeband. Die Anzahl der Schichten bestimmt die Höhe des Kanals (etwa 60 um pro Schicht). Wir haben 3 Tesafilm Schichten.
3. Legen Sie die Layout-Gestaltung auf einer ebenen Fläche. Richten Sie den Schlitten über die Design-Pattern. Schneiden Sie vorsichtig das Klebeband auf dem Objektträger mit einem Skalpell nach dem Layout.
4. Entfernen Sie die Scotch-Klebeband aus allen Regionen der Glasträger mit Ausnahme der in der Anlage des Mikrokanals.
5. Legen Sie die Folie in einem Heizofen bei 65 ° C für 2-3 min. Reinigen Sie vorsichtig mit Ethanol.

2. Herstellen eines PDMS Mikrofluidikvorrichtung

1. Mischen Sie die Basis und Härter Komponenten PDMS, wie vom Hersteller empfohlen. Wir verwenden ein 10:1Verhältnis von Base zu Härtungsmittel. Gießen Sie etwa 30 ml PDMS-Gemisch in eine Petrischale bis zu einer Höhe von ~ 0,5 cm. Degas das PDMS im Vakuum, wenn nötig. Tauchen Sie den Objektträger aus Glas in der PDMS mit der strukturierten Klebeband nach oben. Platzieren Sie das Muster nach dem PDMS verhindert die Bildung von Luftblasen zwischen Folie und Schalenboden. Heilung für 48 Stunden bei 65 ° C, so dass das Gericht ist horizontal mit einer Wasserwaage.
2. In einer neuen 90 mm Petrischale pour 3 ml PDMS Mischung, was zu einer Schicht von etwa 0,5 mm tief. (Wenn eine Lackschleuder verfügbar ist, was an diesem Punkt verwendet werden).
3. Degas und wie in 2,1 heilen.
4. Sanft Ausschneiden der Mikrofluidikvorrichtung in die gewünschte Größe mit einem Skalpell. Diese Schicht wird die "flow Schicht" bezeichnet werden.
5. Schneiden Sie ein ähnlich großes Stück dünne Schicht PDMS aus der zweiten Petrischale. Dadurch wird die "Brunnen Schicht" bezeichnet werden.
6. Sie einen ausreichend dimensionierten Biopsie Stanzer (Wir nutzen 1,2 mm ID), um Stanzlöcher für die Einlässe und Auslässe in der Strömung Schicht. Platzieren Sie die Vertiefungen, die auf einer dicken Glasträger auf die Gestaltung und Aufteilung Ausstanzung Vertiefungen, unter Verwendung von 2 mm ID Biopsie Puncher, in Ausrichtung mit den Mikrokanälen auf dem Layout.
7. Reinigen Sie beide PDMS Schichten sowie ein 24 mm x 60 mm Deckglas mit Ethanol. Luft trocknen und sauber zu halten.
8. Plasma behandelt sowohl die Deckglas und den Brunnen Schicht PDMS Benutzung von Standard-Plasmaätzer (für nicht-reversible Bindung) oder eine Hand-held corona treater ⁶ für reversible Bindung. Legen Sie das Brunnen Schicht auf der Oberseite des Deckglases, um die Haftung führen (Abbildung 3). Reiben Sie alle Luftblasen (falls erforderlich).

3. Cell Imaging Experiment

1. Vergewissern Sie sich die gewünschten Medien bereit in geeigneten Spritzen verbunden flexible Kunststoffrohre mit einem Innendurchmesser von 0,02 "(Tygon) in der Spritzenpumpe.
2. Wachsen S. cerevisiae-Stämme auf die gewünschte Phase in flüssigem YPD. Vortex gründlich und Platz 300 μl jedes Stammes in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Sanft legen 1 ul Concanavalin A (Sigma) 2 mg / ml in jede Vertiefung. Waschen überschüssiges Concanavalin A aus jeder Vertiefung durch zweimaliges Pipettieren Wasser.
4. Während die Concanavalin A trocknet, waschen Stämme zweimal mit 300 ul SC Medium ohne Glucose. Waschen Restglucose aus den Zellwänden hilft ordnungsgemäße Einhaltung des Concanavalin A.
5. Vortex Zellen gründlich. Pipette 0,75 ul oder weniger jeder Zellsuspension in einen eigenen Brunnen (Abbildung 3). Vorsichtig waschen verbleibenden Zellen mit Vollmedium. Die folgenden zwei Schritte müssen schnell durchgeführt werden, um Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern.
6. Plasma behandelt den Chip und die Vertiefungen gründlich mit der Hand-held corona treater, man aufpassen, nicht die Brunnen direkt getroffen. Legen Sie das Chip auf dem Brunnen, aufmerksam auf die Ausrichtung zwischen den beiden (dieser Schritt kann unter einem Stereoskop durchgeführt werden). Drücken Sie vorsichtig die beiden Schichten von PD haltenMS. Langsam füllen Sie das Gerät komplett mit etwa 50 ul Vollmedium, so dass keine Luftblasen im Inneren des Kanals verbleiben.
7. Schließen Sie das Gerät, Einsetzen der Röhrchen in den entsprechenden Eingängen und starten Medienstrom. Darauf achten, dass keine Luftblasen in das Gerät eingeführt werden, da diese schwierig zu entfernen, dies kann durch Trennen eines Ein-oder Auslass erreicht werden und leichtes Klopfen auf das Gerät, wo die Blasen sind, darauf achten, daß die Deckglas brechen.
8. Zeigen unter dem Mikroskop und finden geeignete bildgebende Punkte in jedem gut.
9. Halten Sie die Zellen unter Vollmedium Flow für 1 Stunde oder länger, um Erholung zu ermöglichen, wenn nötig.
10. Starten des Experiments: wir verwenden konstanten Fluss von jeder der zwei Spritzenpumpen, um den Rückfluss des Mediums zu verhindern, wechselnden relativen Flussraten, wie gewünscht. Einstellen Pumpe A bis 0,8 ml / h und Pumpe B bis 0,2 ml / h ergibt sich strömenden Medium A über 80% der Breite des Kanals (4). Dies kann dynamisch cgehängt, indem Sie die beiden Durchsätze. Die neuen Bedingungen stabilisieren innerhalb von Sekunden über die volle Länge des Kanals ^2.

Representative Results

Um die Trennung zwischen verschiedenen Stämmen zeigen wir abgebildet zwei unterscheidbare Hefestämme in abwechselnden Vertiefungen. Imaging die volle Brunnen zeigt keine Zelle Leckage zwischen Brunnen (5a, b). Beide Stämme haben den Transkriptionsfaktor MSN2 mit YFP markiert. Um die gleichzeitige Wirkung von sich dynamisch ändernden Bedingungen zu testen, wechselten wir die Strömungsgeschwindigkeiten in den zwei Eingangskanäle, wodurch ein Schritt der nicht-Glucose-Medium, das in Lokalisation MSN2-YFP zum Kern (5c, d) geführt. Das Ansprechverhalten bei allen Wells gemessen aufgetreten gleichzeitig und zeigt die Vorrichtung zur Anwendung des gleichzeitigen dynamischen Bedingungen, um mehrere Vertiefungen verwendet werden.

Abbildung 1. Geräte-Design. Das Gerät besteht aus einem Deckglas eine dünne "Wells"-Schicht und einer "Flow" Schicht auf dem Schlauch ist conne zusammenCTED.

Abbildung 2. Flow Layer-Design. Ein Scotch-Tape Form für diese Schicht. Hier haben wir zwei Y-förmige Kanäle von gegenüberliegenden Richtungen.

Abbildung 3. Wells Schicht. Die dünne Schicht aus PDMS mit ausgestanzten Vertiefungen mit einem Deckglas haften. Dann ConA in jede Vertiefung gegeben und trocknen gelassen. Die Zellen werden dann mit den 10 Vertiefungen geladen.

Abbildung 4. Kontrollierte Kanalbereiche. Durch Steuern der relativen Durchflußmengen der beiden Eingänge einer Y-Kanal, einen bestimmten Teil der Breite wird mit Medium A Medium B vs (a) Linker chann abgedeckt el: Fließende am 0.8ml/hr (rot) und 0,2 ml / hr (clear) Ergebnisse in 80% / 20% Deckung. Rechter Kanal: Fließende beide Medien mit 0,5 ml / hr Ergebnisse in 50% / 50% Deckung. (B) Fotografie der Vorrichtung mit 10% / 90%, 50% / 50% und 90% / 10% Flussraten.

Abbildung 5. Dynamische Experiment mit mehreren Hefestämme. (A, b) insgesamt Vertiefungen Bilder von Vertiefungen, die Hefe-Zellen mit (b) oder ohne (a) HTB2-mCherry Tagging, die keine Zelle Leckage zwischen Vertiefungen. (C, d) Reaktion der Zellen in zwei Vertiefungen einer nicht-Glucose Schritt bei t = 0 ist. MSN2-YFP lokalisiert in den Zellkern zur gleichen Zeit nach dem Schritt, demonstriert gleichzeitige Medienwechsel in den beiden Vertiefungen. (E) Zeit-Titeln der nuklearen MSN2-YFP Stufen in ganzen Zellen, die aus einem der Behälter in (c, d) analysiert./ Ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

Discussion

In diesem Papier stellen wir ein einfaches Tischgerät Verfahren zum Erstellen eines mikrofluidischen Vorrichtung, die folgenden mehrere Hefestämme ermöglicht gleichzeitig unter dynamischen Bedingungen. Nach mehreren Stämmen in einem Kanal bietet ein zuverlässiges Werkzeug für den Vergleich Dynamik der einzelnen Zell-Antworten in mehrere Stämme. Ein Vorteil des Ansatzes ist, die Fähigkeit, die Vorrichtung mit einfachen Mitteln herzustellen, ohne die Notwendigkeit für einen Reinraum. Tatsächlich haben wir auch das Protokoll durchgeführt Überspringens der Plasmabehandlung Operationen (in den Schritten 2.9 und 3.6) und erhielt gute Ergebnisse, so Labors ohne Plasmaanlage können immer noch das Protokoll.

Durch Impfen jeder der verschiedenen Stämme in eigenen Brunnen vermeiden wir Zelle Mischen während der Montage der Vorrichtung, trotzdem erlauben Mediumströmung, die Zellen während des Experiments zu erreichen. Ein kritischer Punkt in diesem Protokoll wird nicht lassen die Zellen austrocknen, bevor Reflow Medium über ihnen (Steps 3,4 bis 3,6). Drying von stark beeinflusst die Lebensfähigkeit der Zellen, während er versuchte, das Gerät mit zu viel Medium schließen bei jedem gut Ergebnisse in Haftungsprobleme zwischen den beiden PDMS Schichten. Diese Einschränkungen zwingen uns, die Brunnen Schicht in das Gerät zu verlassen, dann eher abziehen, nachdem die Zellen in ihrem Ort niedergelassen haben. Die Vertiefungen Schicht muss daher tief genug sein, um die anfängliche Tropfen beimpften Zellen enthalten, aber so dünn wie möglich, so dass das Seitenverhältnis der Vertiefungen ermöglicht Mediumstrom ihrer Unterseite erreichen und die Zellen erhalten externen Signale durch direkte Strömung.

Die Vorrichtung wie hier beschreiben wird auf etwa 5 Stämme pro Kanal begrenzt. Wir erzeugen routinemäßig Geräte mit zwei benachbarten Y Kanäle bei gegenüberliegenden Ausrichtungen (Abbildung 2). Während dies auf wenige weitere Kanäle oder einige mehr Wells pro Kanal erweitert werden kann, ist es immer noch nicht so hohen Durchsatz, da einige der VLSI Design Einrichtungen ^7, die bisher nicht in lebenden Zellen angewendet wurden.Wir stellen jedoch fest, dass seit der Hauptzweck dieses Gerätes ist es, verschiedene Stämme zu den exakt gleichen Bedingungen zu unterwerfen, während imaging ihre Antworten gibt es Einschränkungen, um gleichzeitige Bildgebung, dass Stammzellen aus der Anzahl der Stämme abgebildet, unabhängig vom Gerät Umsetzung: bei starker Vergrößerung haben Stämme um sequentiell abgebildet werden, damit die mehreren Stämmen abgebildet ist, desto größer sind die Zeitdifferenzen der Bildgebung zwischen dem ersten und letzten Stamm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS- SYLGARD 184	Dow Corning USA
Vacuum desiccator	Nalgene	5310-0250
Biopsy punchers	Ted Pella Inc.	Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm)
Syringe pumps	Chemyx	Fusion 200
Corona treater	Electro-technic products	BD-20
Tygon tubing	Tygon	S-54-HL
Concanavalin-A	Sigma	C7275
Scotch tape	3M Scotch	Transparent Tape 1/2"