Summary
אנו מציגים שיטה פשוטה לייצר מכשירים המסוגלים החלת תנאים דינמיים דומים לזנים שונים מרובים microfluidic, ללא צורך בחדר נקי או ליתוגרפיה הרכה.
Abstract
המחקר של תגובות תא לשינויים סביבתיים מציב אתגרים ניסיוניים רבים: תאים צריכים להיות צלמו בתנאים משתנים, לעתים קרובות באופן השוואתי. צלחות Multiwell משמשות באופן שגרתי להשוואת זנים רבים ושונים או קווים סלולריים, אבל תאפשרנה שליטה מוגבלת על דינמיקת הסביבה. התקני microfluidic, לעומת זאת, מאפשרים שליטה דינמית מעולה על התנאים סביבו, אבל זה מאתגר לתמונה ולהבחין יותר מכמה זנים בם. כאן אנו מתארים שיטת קלות ובמהירות לייצור מכשיר מסוגל ליישם תנאים משתנים באופן דינאמי לזני שמרים שונים מרובים בערוץ 1 microfluidic. המכשיר תוכנן ויוצר באמצעים פשוטים, ללא צורך ביתוגרפיה הרכה. הוא מורכב מערוץ זרימה בצורת אות V מצורף לשכבה שנייה מחסה microwells. הזנים ממוקמים בmicrowells הנפרד, וצלמו תחת בדיוק מאותם תנאים דינאמיים. אנו הדגמהnstrate השימוש במכשיר למדידת תגובות לוקליזציה חלבון לפולסים של שינויים תזונתיים בזני שמרים שונים.
Introduction
תאים כל זמן מגיבים לסביבה דינמית, על ידי שינוי חילוף החומרים שלהם, פרופיל שעתוק והפונקציות סלולריות. כדי ללמוד על תופעות אלו, שיטות שניתן לכמת שינויים נדרשות. סוג אחד של readout לתגובות כאלה הוא השינוי בלוקליזציה של גורמי שעתוק קשורים לחץ בתגובה ללחץ תזונתי.
מכשירי microfluidic 1 היו בשימוש באופן דינמי לתפעל תנאים סביבתיים לתאי 2-4. הם מציגים מספר יתרונות להדמית תא חייה: הסביבה של התאים ניתן לשלוט במדויק ובאופן דינמי השתנתה; תאים יכולים להיות חי בהדמיית בכל העת, לרבות במניפולציה של תנאים חיצוניים, וכרכים מגיבים מינימאליים נדרשים. עיצוב פשוט מאוד למכשיר microfluidic, המאפשר להתחלפות בין שני תנאים, הוא מכשיר בצורת אות V 2. אנו משתמשים באופן שגרתי מכשירי Y בצורה המאפשרים microfluidicיישום של שינויים דינמיים בתאים בערוץ. אנו משתמשים במכשיר זה כדי לעקוב אחר שינויי לוקליזציה של גורמים מתויגים fluorescently לחץ הקשורים שעתוק בתאי שמרים. אנו עוקבים אחר שינויים אלה תחת תנאים משתנים תזונתיים. לדוגמה, אנו יכולים לספק לדופק (או סדרה של פולסים) של גלוקוז המכיל בינוני תוך תקופה של אי גלוקוז בינוני, ברזולוציה של זמן עדינה מאוד. לעתים קרובות בניסויים כאלה, אחד הוא מעוניין בהשוואת התשובות של זני תאים שונים (לדוגמה, מוטציות שונות, או מבודד בר שונה). ערוץ Y בצורה מוגבלת לזן אחד בכל ערוץ - אם זן אחד או יותר משמש, אין דרך פשוטה להבדיל בין הזנים. כדי להתגבר על זה, ערוצים שונים ניתן להשתמש. אם אנחנו רוצים להחיל את תנאי הדינמיקה זהות לזנים רבים, ברצוננו לשלב את מושג ה-Y ערוץ עם מספר רבים של ערוצים. ישנם שני אתגרים ביישום פתרון זה: זה יכול להיות קשה ליישם tהוא אותם תנאים באותו זמן לכל הערוצים, וקיים מגבלה גיאומטרית למספר ערוצי Y שיכול להיות מצויד במכשיר אחד. לפיכך, אנו מחפשים את הדרך לצפייה במספר זנים בערוץ אחד בתנאים דינאמיים.
כאן אנו מתארים מכשיר microfluidic 2 שכבתי המיועד לזנים מרובים הדמיה בערוץ 1 באותם תנאים דינמיים. השכבה התחתונה מורכבת הדק PDMS עם שורה של חורים. שכבה זו מחוברת לcoverslip זכוכית יצירת בארות שלתוכו אנו מניחים את הזנים השונים, דבקותם בConcanavalin לזכוכית. השכבה השנייה היא מכשיר microfluidic בצורת אות V שנוצר באמצעות שיטת נייר הדבק 5. לאחר שהניח את הזנים בבארות השכבה השנייה מיושרת במהירות ובמצורפת לראשון, יצירת ערוץ אחד עם כמה בארות המכילות את הזנים השונים. מכשיר זה מאפשר סופי לאחר מספר זנים בערוץ אחד, שבו כלזנים כפופים לאותם תנאים באותו הזמן בדיוק. כל תהליך התכנון וייצור יכולים להיעשות על benchtop, תוך שימוש באמצעים פשוטים, ללא יתוגרפיה הרכה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. יצירת מאסטר ויסקי קלטת 5
- לצייר או להדפיס את הפריסה רצויה microchannel, להתרחב, על נייר. במקרה שלנו העיצוב מורכב משני ערוצים בצורת אות V, כל 3 מ"מ רחב (איור 2).
- כיסוי זכוכית שקופית עם שכבות של נייר דבק. מספר השכבות יקבע את הגובה של הערוץ (כ 60 מיקרומטר לשכבה). אנחנו השתמשנו 3 שכבות נייר דבק.
- הנח את עיצוב הפריסה על משטח שטוח. יישר את השקופית על תבנית העיצוב. בזהירות לחתוך את הסרט בשקופית הזכוכית עם אזמל על פי הפריסה.
- הסר את הנייר הדבק מכל האזורים של שקופית הזכוכית, למעט אלו בפריסה של microchannel.
- הנח את השקופית בתנור חימום על 65 מעלות צלזיוס במשך 2-3 דקות. לנקות בעדינות עם אתנול.
2. בודת מכשיר microfluidic PDMS
- מערבב את מרכיבי הבסיס וריפוי של PDMS כפי שהומלץ על ידי היצרן. אנו משתמשים 10:01יחס בין הבסיס לסוכן ריפוי. יוצק על 30 מ"ל של תערובת PDMS לתוך צלחת פטרי לגובה של ~ 0.5 סנטימטר. הדגה PDMS בואקום במידת צורך. להטביע את שקופיות הזכוכית בPDMS עם נייר הדבק בדוגמת פונה כלפי מעלה. הצבת התבנית לאחר PDMS מונעת היווצרות בועות אוויר בין השקופיות ובתחתית צלחת. תרופה ל48 שעות על 65 מעלות צלזיוס, ולוודא את הצלחת היא אופקית באמצעות רמת בועה.
- בצלחת פטרי חדשה 90 מ"מ לשפוך 3 מ"ל של PDMS תערובת, וכתוצאה מכך שכבה על 0.5 מ"מ עמוק. (אם coater ספין זמין, ניתן להשתמש בו בשלב זה).
- דגה ולרפא כמו ב2.1.
- בעדינות לחתוך את מכשיר microfluidic לגודל רצוי עם אזמל. שכבה זו ניתן לכנות "שכבת הזרימה".
- גזור חתיכה בגודל דומה של השכבה הדקה PDMS מהמנה השנייה פטרי. זו ניתן לכנות "שכבת הבארות".
- השתמש אגרופן ביופסיה בגודל המתאים (אנו משתמשים מזהים מ"מ 1.2) כדי לנקב חורים לפתחי הכניסה והשקעים בשכבת הזרימה. הנח את שכבת הבארות בשקופית זכוכית עבה על פריסת העיצוב ואגרוף את הבארות, באמצעות 2 מ"מ אגרופן ביופסית זהות, בתיאום עם את microchannels על הפריסה.
- נקה שתי שכבות PDMS כמו גם 24 מ"מ coverslip זכוכית x 60 מ"מ עם אתנול. להתייבש באוויר ולשמור על ניקיון.
- פלזמה לטפל גם coverslip הזכוכית ובארות השכבה PDMS או באמצעות חרט סטנדרטי הפלזמה (עבור מליטה שאינה הפיכה) או מוחזק ביד 6 treater עטרה למליטה הפיכה. זהירות למקם את שכבת הבארות על גבי coverslip לגרום להידבקות (איור 3). לשפשף בעדינות את כל בועות אוויר (במידת צורך).
3. ניסוי הדמיה ניידת
- ודא שיש לך את המדיה הרצויה מוכן במזרקים המתאימים מחוברים לצינורות פלסטיק גמישים בקוטר הפנימי של 0.02 "(Tygon) במשאבת המזרק.
- לגדול ס זני cerevisiae לשלב הרצוי בYPD הנוזלי. מערבולת ביסודיות והמקום 300 μl של כל זן לתוך צינור microcentrifuge.
- מניח בעדינות μl 1 מתוך Concanavalin (סיגמא) 2 מ"ג / מ"ל לכל באר. לשטוף את Concanavalin עודף מכל באר מים פעמים על ידי pipetting בעדינות.
- בעוד Concanavalin מתייבש, לשטוף פעמים עם 300 זנים של μl בינוני SC חסר גלוקוז. כביסת גלוקוז השיורי מקירות התא מסייעת דבקות ראויה לConcanavalin א
- תאי ורטקס ביסודיות. פיפטה μl 0.75 או פחות מכל השעית תא לתוך היטב משלו (איור 3). לשטוף בעדינות את תאי שייר עם מדיום עשיר. את שני השלבים הבאים צריכים להתבצע במהירות כדי למנוע מתאים מתייבשים.
- פלזמה לטפל בשבב ואת הבארות באופן יסודי באמצעות treater עטרת כף יד, נזהר שלא לפגוע בבארות באופן ישיר. זהירות למקם את השבב על הבארות, הקדשת תשומת לב לתיאום בין השניים (צעד זה יכול להיעשות תחת סטריאוסקופ). לחץ בעדינות על לדבוק בשתי השכבות של פ"דטרשת נפוצה. לאט לאט למלא את המכשיר לחלוטין עם כ 50 מדיום עשיר μl, ולוודא אין בועות אוויר השאיר בתוך הערוץ.
- חבור את המכשיר, החדרת הצינורות אל פתחי הכניסה המתאימים ולהתחיל זרימת מדיה. תדאג שלא בועות אוויר הוכנס למכשיר כמו אלה יכולים להיות מסובכים להסרה, וזאת ניתן להשיג על ידי ניתוק כניסה או יציאה ועדינות קשה על המכשיר שבו הבועות, נזהר שלא לשבור את coverslip הזכוכית.
- מקום תחת מיקרוסקופ ולמצוא נקודתי הדמיה מתאימות בכל אחד גם.
- לשמור על התאים תחת זרימה בינונית עשירה ל1 שעות או יותר כדי לאפשר התאוששות במידת צורך.
- התחל את הניסוי: אנו משתמשים זרימה מתמדת מכל אחת משתי משאבות המזרק כדי למנוע זרימה חוזרת של התקשורת, שינוי ספיקות יחסי כרצונך. הגדרת משאבת A ל 0.8 מ"ל / שעה והמשאבה B ל -0.2 תוצאות מ"ל / שעה במדיום זורם מעל 80% מרוחב התעלה (איור 4). זה יכול להיות דינאמי גנתלה על ידי שינוי שתי הספיקות. התנאים החדשים לייצב בתוך שניות לאורך כל אורכו של הערוץ 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את ההפרדה בין זנים שונים שצלמנו שני זני שמרים הנבדלים בבארות חלופיות. הדמית בארות מלאות לא מראות זליגת תא בין הבארות (איור 5 א, ב). שני הזנים יש MSN2 גורם השעתוק תויג YFP. כדי לבחון את ההשפעה של שינויים בתנאי סימולטני באופן דינמי, שהחלפנו את הספיקות בשני הערוצים, יצירת צעד של מדיום לא גלוקוז, אשר הביא בלוקליזציה של Msn2-YFP לגרעין (האיור 5c, ד). התגובה נמדדה בכל הבארות התרחשה באותו הזמן, מראה את המכשיר יכול לשמש ליישום של תנאים דינמיים במקביל לבארות מרובות.
איור 1. עיצוב מכשיר. המכשיר מורכב מcoverslip, שכבה דקה "ולס" ושכבה "זרימה" כדי שצינור הוא connected.
איור 2. עיצוב שכבת זרימה. עובש ויסקי קלטת נעשה לשכבה זו. כאן נקטתי בשני ערוצים Y בצורה של כיוונים מנוגדים.
איור 3. שכבת ולס. השכבה הדקה של PDMS עם חבטה את הבארות היא דבקה coverslip זכוכית. אז ConA יוצב בכל באר ולהתייבש. אז תאים נטענים ל10 הבארות.
איור 4. סיקור ערוץ מבוקר. על ידי שליטה על קצב הזרימה היחסית של שתי כניסות של Y ערוץ, חלק מסוים של רוחבו מכוסה במדיום לעומת בינוני ב '(א) שמאל chann אל: זורם ב0.8ml/hr (אדום) ותוצאות 0.2 מ"ל / שעה (ברור) בכיסוי 80/20%%. ערוץ ימני: זורם שתי התקשורת ב0.5 תוצאות מ"ל / שעה בכיסוי של 50% / 50%. (ב) תמונות של המכשיר עם 10% / 90%, 50% / 50% ו 90% / 10% ספיקות.
איור 5. ניסוי דינמי עם זני שמרים מרובים. (ב ',) תמונות שלמות גם של בארות המכילות תאי שמרים עם (ב) או בלי (א) תיוג HTB2-Mcherry, לא מראה זליגת תא בין הבארות. (ג, ד) תגובה של התאים בשתי בארות לצעד ללא סוכר בזמן t = 0. Msn2-YFP localizes לגרעין באותו הזמן בעקבות הצעד, הוכחת שינויים בתקשורת בו זמנית בשתי הבארות. (ה) זמן רצועות של רמות גרעיניות Msn2-YFP בתאים בודדים נתחו מהאחת הבארות ב( ג, ד)./ Ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה אנו מציגים שיטה פשוטה ליצירת benchtop מכשיר microfluidic המאפשר בו זמנית מספר זני שמרים הבאים בתנאים דינאמיים. לאחר מספר זנים בערוץ אחד מספק כלי אמין להשוואה בין דינמיקה של תגובות תא בודדות בזנים מרובים. אחד יתרונות של הגישה שלנו הוא היכולת להמציא את המכשיר בטכניקות פשוטות ללא צורך בחדר נקי. למעשה, יש לנו גם בצע את פרוטוקול דילוג על פעולות טיפול בפלזמה (בצעדים 2.9 ו -3.6) וקבל תוצאות טובות, ולכן ללא כל ציוד מעבדות פלזמה עדיין יכולות לבצע את הפרוטוקול.
על ידי זריעה כל אחד מהזנים השונים בעצמו גם אנו נמנעים מתא הערבוב במהלך רכבת ההתקן, תוך שהוא מאפשר זרימה בינונית להגיע לתאים במהלך הניסוי. נקודה קריטית בפרוטוקול זה לא נותנת את התאים יתייבשו לפני reflowing הבינוני מעליהם (צעדים 3.4-3.6). מתייבשגרם מתוך השלכות חמורות על יכולת הקיום של התאים, בעת שניסתה לסגור את המכשיר עם יותר מדי בינוני בכל תוצאות גם בבעיות ההידבקות בין שתי שכבות PDMS. אילוצים אלה מחייבים אותנו להשאיר את שכבת הבארות במכשיר, ולא לאחר מכן לקלף אותו לאחר שהתאים התיישבו במקום שלהם. שכבת הבארות, ולכן, צריכה להיות עמוק מספיק כדי להכיל את האגל הראשוני של תאי זרעם, אלא כדק ככל האפשר, ולכן היחס של הבארות מאפשר זרימה בינונית להגיע התחתון שלהם והתאים מקבלים אותות חיצוניים באמצעות זרימה ישירה.
המכשיר כפי שאנו מתארים כאן מוגבל לכ 5 זנים לכל ערוץ. אנחנו באופן שגרתי ליצור מכשירים עם שני ערוצי Y סמוכים בdirectionalities המנוגד (איור 2). אמנם זה יכול להיות מורחב לכמה ערוצים נוספים, או עוד כמה בארות בכל ערוץ, זה עדיין לא כמו תפוקה גבוהה כחלק מהמכשירים בסגנון VLSI 7, שעד כה לא הוחל על תאי חיים.יש לציין, עם זאת, כי מכיוון שהמטרה העיקרית של המכשיר הזה היא להכפיף את זנים שונים כדי בדיוק מאותם תנאים ואילו תגובות ההדמיה שלהם, יש מגבלות להדמיה מקבילה שנובע ממספר הזנים צלמו, ללא קשר ליישום ההתקן: ב הגדלה גבוהה, זנים צריכות להיות צלמו ברצף, ולכן ככל שיותר זנים צלמו, הגדול יותר הם הבדלי הזמן של הדמיה בין המתח הראשון והאחרון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
י.ג. נתמך על ידי מלגה מאי.די. בי. לפי הוא בחור אלון ועמית סגל של אדמונד י . ספרא לביואינפורמטיקה באוניברסיטת תל אביב . מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומי למדע המענק 1499/10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ||
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 | |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) | |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 | |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 | |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2" |
References
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).
- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters. Chips & Tips. , (2010).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
