En Microfluidic enhet for Studerer Flere Tydelig Stammer

Summary

Vi presenterer en enkel metode for å produsere microfluidic enheter i stand til å anvende lignende dynamiske forhold til flere distinkte stammer, uten behov for et rent rom eller myk litografi.

Abstract

Studiet av celle responser til miljømessige endringer stiller mange eksperimentelle utfordringer: cellene trenger for å bli fotografert under skiftende forhold, ofte i et komparativt måte. Multiwell plater er rutinemessig brukt til å sammenligne mange forskjellige stammer eller cellelinjer, men tillate begrenset kontroll over miljøet dynamikk. Microfluidic enheter, på den annen side, tillater utsøkt dynamisk kontroll over de omkringliggende forhold, men det er utfordrende å bilde og skille mer enn noen få stammer i dem. Her beskriver vi en metode for å enkelt og raskt produsere en microfluidic enhet stand til å anvende dynamisk skiftende forhold til flere forskjellige gjærstammer i én kanal. Enheten er designet og produsert av enkle midler uten behov for myk litografi. Det består av en Y-formet strømningskanal festet til et andre lag harboring mikrobrønner. Stammene er plassert i separate mikrobrønnene, og avbildes under nøyaktig samme dynamiske forhold. Vi demoennstrate bruken av enheten for måling protein lokalisering svar på pulser av næringssalter endringer i forskjellige gjærstammer.

Introduction

Cellene er stadig reagerer på en dynamisk skiftende miljø, ved å endre sin metabolisme, transcriptional profil og cellulære funksjoner. Å studere disse fenomenene, er metoder som kan kvantifisere slike endringer er nødvendig. En type avlesning for slike responser er endringen i lokalisering av stressrelaterte transkripsjonsfaktorer i respons til ernæringsmessig stress.

Microfluidic enheter ¹ har blitt brukt til å dynamisk manipulere miljøforholdene celler ^2-4. De presenterer flere fordeler for live cell imaging: miljøet av cellene kan kontrolleres nøyaktig og dynamisk endret; celler kan være live-avbildes til enhver tid, også under manipulering av ytre forhold, og minimale reagensvolumene er nødvendig. En meget enkel konstruksjon for en microfluidic enhet, slik alternering mellom to tilstander, er en Y-formet enhet ^2. Vi rutinemessig bruk Y-formede microfluidic enheter som tillateranvendelse av dynamiske endringer i cellene i kanalen. Vi bruker denne enheten for å følge lokalisering endringer av fluorescently merket stress relaterte transkripsjonsfaktorer i gjærceller. Vi følger disse endringene under skiftende ernæringsmessige forhold. For eksempel kan vi gi en puls (eller serie av pulser) av glukose-inneholdende medium innenfor en periode av ikke-glukose medium, til en svært fin tidsoppløsning. Ofte i slike eksperimenter, er en interessert i å sammenligne responsene av forskjellige cellestammer (for eksempel ulike mutanter, eller forskjellige wild isolater). Y-formet kanal er begrenset til en belastning i hver kanal - hvis mer enn en stamme blir brukt, er det ingen enkel måte å skille mellom de stammer. For å overvinne dette, kan forskjellige kanaler benyttes. Hvis vi ønsker å bruke de samme dynamikk vilkår som flere stammer, vil vi gjerne kombinere Y-kanalen konsept med flere kanaler. Det er to utfordringer i å implementere denne løsningen: Det kan være vanskelig å bruke than samme betingelser samtidig til alle kanaler, og det er en geometrisk begrensning til antall Y-kanaler som kan monteres i en enhet. Vi var derfor på utkikk etter en måte for visning flere stammer i én kanal under dynamiske forhold.

Her beskriver vi en todelt microfluidic enhet beregnet for imaging flere stammer i en kanal under de samme dynamiske forhold. Det nederste laget består av tynne PDMS med en rekke hull. Dette laget er festet til dekkglass skape brønner inn som vi vil plassere de forskjellige stammer, overholde dem med Concanavalin A til glasset. Det andre laget er en Y-formet microfluidic enhet opprettet med plasteret metoden ^5. Etter å ha plassert de påkjenningene i brønnene det andre laget er raskt justert og festet til den første, skaper en kanal med flere brønner som inneholder de forskjellige stammer. Denne siste enheten kan følge flere stammer i én kanal, hvor allestammer er utsatt for de samme forhold på nøyaktig samme tid. Hele design og produksjon prosessen kan gjøres på laboratoriet, ved hjelp av enkle midler, uten myk litografi.

Protocol

1. Opprette en Scotch-tape Master ⁵

1. Tegne eller skrive ut ønsket microchannel layout, for å skalere, på papir. I vårt tilfelle utformingen består av to Y-formede kanaler, hver 3 mm bred (Figur 2).
2. Dekk et glass-slide med lag av scotch tape. Antall lag vil bestemme høyden av kanalen (ca 60 um per lag). Vi brukte tre scotch tape lag.
3. Plasser layout design på et flatt underlag. Juster gli over utformingen mønster. Skjær forsiktig tapen på glass-slide med en skalpell i henhold til oppsettet.
4. Ta av teip fra alle regioner av glass-slide unntatt de i utformingen av microchannel.
5. Plasser lysbildet i en oppvarming ovn ved 65 ° C i 2-3 min. Rengjør forsiktig med etanol.

2. Fabrikere en PDMS Microfluidic Device

1. Bland base og herding komponenter av PDMS som anbefalt av produsenten. Vi bruker en 10:1forholdet base til herdemiddel. Hell ca 30 ml PDMS blandingen i en petriskål med en høyde på ~ 0,5 cm. Degas the PDMS i vakuum hvis nødvendig. Senk glass lysbilde i PDMS med mønstrede Scotch tape opp. Plassere mønsteret etter PDMS hindrer dannelsen av luftbobler mellom raset og parabol bunnen. Cure i 48 timer ved 65 ° C, noe som gjør at parabolen er horisontal ved hjelp av en vater.
2. I et nytt 90 mm petriskål pour 3 ml PDMS blanding, som resulterer i et lag omtrent 0,5 mm dype. (Hvis en spin belegningsinnretning er tilgjengelig, kan den brukes for dette trinn).
3. Degas og kurere som i 2.1.
4. Forsiktig kutte ut microfluidic enheten til ønsket størrelse med en skalpell. Dette laget vil bli kalt den "flyt lag".
5. Skjær ut en tilsvarende størrelse stykke tynt lag PDMS fra andre petriskål. Dette vil bli kalt den "brønnene lag".
6. Bruk en passende biopsi puncher (Vi bruker 1,2 mm ID) til hull for innløp og utløp i flyten laget. Plasser brønnene lag på en tykt glass lysbilde over design layout og punch ut brønner, med 2 mm ID biopsi puncher, i tråd med microchannels på bordet.
7. Rengjøre både PDMS lag samt en 24 mm x 60 mm dekkglass med etanol. Lufttørke og holde rent.
8. Plasma behandle både dekkglass og brønnene lag PDMS hjelp enten standard plasma etcher (for ikke-reversibel binding) eller en håndholdt corona treater ⁶ for reversibel binding. Nøye plassere brønnene lag på toppen av dekkglasset å forårsake adhesjon (Figur 3). Forsiktig gni ut luftbobler (hvis nødvendig).

3. Cell Imaging Experiment

1. Kontroller at du har de ønskede media klar i egnede sprøyter knyttet til fleksible plastrør med innvendig diameter på 0,02 "(Tygon) i sprøytepumpe.
2. Grow S. cerevisiae stammer til den ønskede fase i flytende YPD. Vortex grundig og sted 300 μl av hver stamme i en mikrosentrifugerør.
3. Forsiktig plassere 1 ul Concanavalin A (Sigma) 2 mg / ml i hver brønn. Vaske ut overflødig Concanavalin A fra hver brønn to ganger ved å forsiktig pipettering vann.
4. Mens Concanavalin A er tørking, vask stammer to ganger med 300 ul SC medium mangler glukose. Vasking gjenværende glukose fra celleveggene hjelper skikkelig tilslutning til Concanavalin A.
5. Vortex celler grundig. Pipetter 0,75 pl eller mindre av hver cellesuspensjon inn egen brønn (fig. 3). Vask forsiktig ut gjenværende celler med rik medium. De neste to trinn må utføres raskt for å hindre at celler fra å tørke opp.
6. Plasma behandle chip og brønnene grundig via den håndholdte corona treater, være forsiktig med å treffe brønnene direkte. Forsiktig plassere brikken på brønnene, vier oppmerksomhet til plasseringen mellom de to (dette trinnet kan gjøres under en stereoscope). Trykk forsiktig å overholde de to lagene av PDMS. Fyll sakte enheten helt med ca 50 ul rik medium, slik at ingen luftbobler er igjen inne i kanalen.
7. Koble til enheten, setter rørene i de aktuelle viker og starte media flyt. Pass på at ingen luftbobler blir introdusert inn i enheten som disse kan være vanskelig å fjerne, og dette kan oppnås ved å koble et innløp eller utløp og forsiktig trykke på enheten der boblene er, være forsiktig med å bryte dekkglass.
8. Plassere under mikroskopet og finne hensiktsmessige bildebehandling poeng i hver brønn.
9. Hold celler under rik medium flow for en time eller lenger for å tillate utvinning hvis nødvendig.
10. Starte forsøket: vi bruker konstant strømning fra hver av de to sprøyte pumper for å forhindre tilbakestrømning av mediet, endre relative strømningshastigheter som ønsket. Innstilling pumpe A til 0,8 ml / time og pumpe B til 0,2 ml / time resulterer i medium A flyter over 80% av bredden av kanalen (figur 4). Dette kan være dynamisk chengt ved å endre de to strømningshastigheter. De nye forholdene stabilisere innen sekunder langs hele lengden av kanalen ^2.

Representative Results

For å demonstrere avstanden mellom forskjellige stammer vi avbildes to skjelnes gjærstammer i alternative brønner. Imaging full brønner viser ingen celle lekkasje mellom brønner (figur 5a, b). Begge stammer har transkripsjonsfaktor MSN2 merket med YFP. For å teste den samtidige virkning av dynamisk endrede betingelser, vi byttet strømningshastighetene i de to innganger, skaper et trinn av nei-glukose medium, noe som resulterte i lokalisering av MSN2-YFP til kjernen (figur 5c, d). Responsen måles i alle brønnene oppstått på samme tid, som viser enheten kan brukes til påføring av samtidige dynamiske forhold til flere brønner.

Figur 1. Device motivet. Enheten består av et dekkglass, en tynn "Wells" lag og et "Flow" lag som slangen er connected.

Figur 2. Flow lag design. En Scotch-tape Formen er laget for dette laget. Her har vi brukt to Y-formede kanaler motstridende retninger.

Figur 3. Brønner laget. Tynt lag PDMS med utstansede brønner er overholdt et dekkglass. Deretter ConA plasseres i hver brønn og tillates å tørke. Celler blir så lastet med de 10 brønner.

Figur 4. Kontrollert Kanaldekning. Ved å kontrollere de relative strømningshastighetene for de to innganger av en Y-kanal, en spesifikk fraksjon av sin bredde er dekket med medium A g. middels B. (a) Venstre CHANN el: Flowing på 0.8ml/hr (rød) og 0,2 ml / t (klar) resulterer i 80% / 20% dekning. Høyre kanal: Flowing begge mediene på 0,5 ml / hr resultater i 50% / 50% dekning. (B) Fotografier av anordningen med 10% / 90%, 50% / 50% og 90% / 10% strømningshastigheter.

Figur 5. Dynamisk eksperiment med flere gjærstammer. (A, b) Hel-brønners bilder av brønner inneholdende gjærceller med (b) eller uten (a) HTB2-Mcherry tagging, viser ingen celle lekkasje mellom brønner. (C, d) Reaksjon av cellene i to brønner på en nei-glukose trinn ved t = 0. MSN2-YFP lokaliserer til kjernen på samme tid etter trinnet, demonstrere samtidige medier endringer i de to brønner. (E) Time-spor av kjernefysiske MSN2-YFP nivåer i enkeltceller analysert fra en av brønnene i (c, d)./ Ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

Discussion

I denne artikkelen presenterer vi en enkel Borstemmaskin metode for å lage en microfluidic enhet som lar følgende flere gjærstammer samtidig under dynamiske forhold. Etter flere stammer i en kanal gir en pålitelig verktøy for å sammenligne dynamikk encellete responser i flere stammer. En fordel med vår tilnærming er evnen til å dikte enheten med enkle teknikker uten behov for et rent rom. Faktisk har vi også utført protokollen hoppe plasma behandling operasjoner (i trinn 2,9 og 3,6) og fikk gode resultater, så laboratorier uten plasma utstyr kan fortsatt utføre protokollen.

Ved såing hver av de forskjellige stammer i egen brønn vi unngå celle blande under sammenstillingen av enheten, og som samtidig gir middels flyt å nå cellene under eksperimentet. Et kritisk punkt i denne protokollen er ikke å la cellene tørke ut før reflowing medium over dem (trinn 3.4 til 3.6). Drying ut påvirker sterkt levedyktigheten av cellene, mens du prøver å lukke enheten med for mye medium på hver brønn resultater i heftproblemer mellom de to PDMS lag. Disse begrensningene tvinge oss til å forlate brønnene lag i enheten, heller deretter skrelle den av etter at cellene har slått seg ned i deres sted. Brønnene laget derfor må være dypt nok til å inneholde den første dråpe seeded celler, men så tynn som mulig, slik at sideforholdet brønnene tillater middels flyt til å nå sin bunn og cellene få eksterne signaler gjennom direkte strømning.

Enheten som vi beskriver her er begrenset til ca 5 stammer per kanal. Vi rutinemessig opprette enheter med to tilstøtende Y kanaler på motstridende directionalities (figur 2). Selv om dette kan utvides til noen flere kanaler, eller noen flere brønner per kanal, er det fortsatt ikke så høy gjennomstrømning som noen av de VLSI stil enheter ^7, som så langt ikke har vært brukt på levende celler.Vi legger likevel merke til at siden det viktigste formålet med denne enheten er å utsette ulike stammer til nøyaktig samme forhold mens bildebehandling sine svar, er det begrensninger til samtidige avbildning som stammer fra antall stammer fotografert, uavhengig av enheten implementering: på stor forstørrelse, stammer må avbildes sekvensielt, derfor flere stammer avbildes, dessto større er tidsforskjellene for bildebehandling mellom første og siste belastning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS- SYLGARD 184	Dow Corning USA
Vacuum desiccator	Nalgene	5310-0250
Biopsy punchers	Ted Pella Inc.	Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm)
Syringe pumps	Chemyx	Fusion 200
Corona treater	Electro-technic products	BD-20
Tygon tubing	Tygon	S-54-HL
Concanavalin-A	Sigma	C7275
Scotch tape	3M Scotch	Transparent Tape 1/2"