Modeller af knoglemetastaser

Summary

Dyremodeller ofte anvendes til at studere cancermetastase til knogler. I denne protokol vil vi beskrive to almindelige metoder til tumorinoculation for knoglemetastaser undersøgelser og kort beskrive nogle af de analyser, der anvendes til at overvåge og kvantificere disse modeller.

Abstract

Knoglemetastaser er en almindelig forekomst i flere maligniteter, herunder bryst-, prostata og lunge. Når de er etableret i knogler, tumorer er ansvarlige for signifikant morbiditet og mortalitet ^1. Der er således et stort behov for at forstå de molekylære mekanismer, der styrer etablering, vækst og aktivitet af tumorer i knogler. Adskillige in vivo modeller er blevet etableret for at studere disse begivenheder, og hver har særlige fordele og begrænsninger. Den mest almindeligt anvendte model anvender intrakardiale inokulering af tumorceller direkte i den arterielle blodtilførsel af athymiske (nøgne) mus BalbC. Denne procedure kan anvendes på mange forskellige tumortyper (herunder PC-3 prostatacancer, lungecarcinom, og muse mamma fedtpude tumorer), men i dette manuskript vil vi fokusere på brystkræft model, MDA-MB-231. I denne model bruger vi en meget knogle-selektiv klon, oprindeligt stammer i Dr. Mundy gruppe i San Antonio ^2, at hsom siden er blevet transficeret for GFP-ekspression og re-klonet ved vores gruppe ^3. Denne klon er et knogle metastatisk variant med en høj osteotropism og meget lidt metastaser til lunge, lever, eller binyrerne. Mens intrakardiale injektioner er mest almindeligt anvendt til studier af knoglemetastaser ^2, i visse tilfælde intratibial ⁴ eller yverfedt pad indsprøjtninger er mere passende. Intrakardiale injektioner udføres typisk ved anvendelse af humane tumorceller med det formål at overvåge senere stadier af metastaser, især evnen af ​​cancerceller til at standse i knogler, overlever, prolifererer og fastslå tumorer, der udvikler sig til cancer-induceret knoglesygdom. Intratibial injektioner foretages, hvis der fokuseres på forholdet mellem kræftceller og knogler efter en tumor har spredt til knogler, som korrelerer nogenlunde fast metastatisk knoglesygdom. Ingen af ​​disse modeller rekapitulerer tidlige trin i den metastatiske proces forud for emboli og indgangaf tumorceller til kredsløbet. Hvis overvågningen af ​​primær tumorvækst eller metastase fra det primære sted til knogler, derefter bryst-fedtpuden inokulationer foretrækkes normalt, men vil meget få tumorcellelinier konsekvent metastaserer til knogle fra det primære site, med 4T1 knogle-præferentielle kloner, en musemammatumorvirus carcinom, være undtagelsen ^5,6.

Dette håndskrift detaljer inokulering procedurer og fremhæver centrale skridt i efter inokulering analyser. Konkret omfatter det cellekultur, tumorcelle inokulering procedurer for intrakardiale og intratibial vacciner, samt kortfattet information om ugentlig overvågning af x-ray, fluorescens og histomorfometriske analyser.

Protocol

1. Cell Vedligeholdelse

1. Mange knogle metastatiske subkloner af MDA-MB-231 findes der har variable tilbøjelighed til knogle kolonisering og vækst. Til vore eksperimenter anvender vi en klon afledt af GFP-mærkede MDA-MB-231 udviklet på UTHSCA ^2. Denne særlige sub-klon vil danne synlige osteolytiske knoglelæsioner på cirka 3 uger efter inokulering med aflivning efter 4 uger.
2. Opretholde cellerne i DMEM indeholdende 10% FBS og 0,1 mg / ml penicillin-streptomycin ved 37 ° C i 5-8% CO ₂ ^7.
3. Passage-celler ved 80-90% konfluens og re-plade ved en 1:10 fortynding (det varierer afhængigt af celletypen og størrelsen pladen. For MDA-MB-231-celler i en T-75 er ca 6x10 ^5), som er cirka hver 72 timer.
4. MDA-MB-231-celler opretholder en i hovedsagen fibroblastisk udseende med mange pseudopodia. Enhver afrunding er indikativ for overbelægning eller andre uønskede stress, og bør undgås, da dettekan påvirke metastatisk potentiale in vivo.
5. Ideelt set bør celler opretholdes i kultur kun kort før inokulering (vi anbefaler under 1 wk, eller til der er nok celler til forsøget), og et nyt hætteglas skal optøs, hvis afrunding eller ændringer i cellevæksthastigheden forekomme.

2. Cell Preparation

1. Trypsinisér cellerne ved 80-90% konfluens med 0,15% trypsin / EDTA (fortynd 0,5% Gibco trypsin EDTA 1:02 i PBS). Denne koncentration muliggør hurtig frigørelse (<2 min) og reducerer sammenklumpning af cellerne.
2. Straks at fjerne celler fra pladen med 10 ml iskold DMEM indeholdende 10% FBS, afpipetteres i 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 200 x g i 5 min.
3. Resuspender pellet i et 50 ml konisk rør på 25 ml iskold PBS (uden Ca og Mg) og tæller.
4. Centrifugeres på ny pellet og resuspenderes i 10 ⁶ celler pr ml (intrakardiale) eller til 250.000 celler/10 pi (intratibial) i iskold PBS. The temperastilling af PBS er vigtigt at forhindre sammenklumpning af celler og efterfølgende embolisme efter injektion. Cellesuspensionen bør forblive på is, mens de udfører injektioner og vil være levedygtig og forblive un-klumpet i 30 min. Mens det nøjagtige antal af nødvendige plader vil variere fra investigator til investigator, vi generelt bruger 1 T-75 for mellem 8-10 mus.

3. Intrakardiale Inokulation

1. 4-6 uger gamle hun (Foxn Nu-/ -: Harlan) mus anvendes til disse eksperimenter, selv om andre immunsvækkede mus (RAG1-/ -, RAG2-/ -, SCID, XID, og ​​osv.) også kan være anvendes med humane cancercellelinier eksperimenter.
2. De nøgne mus skal fodres Teklad 2920x kost 5-10 dage før injektion for at reducere dødeligheden af ​​injektionsproceduren, og reducere baggrundsfluorescens i billeddannende procedurer (da fødevarer er lucerne free).
3. Hvis du bruger mus end nu / nu, fjerne hår ved barbering eller bruge Nair (i vores erfaring Nair fungerer bedre) på ventral abdominal area før du begynder procedure.
4. Bedøve mus i et isoleret kammer ved hjælp af en isofluran fordamper (2,5% Iso: 2-3 L / min O ₂₎ eller anden foretrukne anæstesi (i vores erfaring isofluran er det bedste tolereret i intrakardiale vaccinationer).
5. Flytte en mus ad gangen til næsekeglen af ​​anæstesiapparatet inde i et rustfrit stål ventileret stinkskab.
6. Placer hver mus på ryggen med brystet opad.
7. Vask brystet med en 10% povidon / iod vatpinden / opløsning efterfulgt af 70% ethanol, gentaget 2 gange.
8. Mark muse bryst til injektion (under anvendelse af en steril markør eller mærkning lidt til siden for at holde injektionsstedet steril). Vi bruger en mark placering midt mellem brystbenet hak og toppen af ​​xyphoid proces, og lidt til venstre (anatomisk) af brystbenet. Trækker en lille boble af luft i sprøjten for at skabe rum mellem stemplet og menisk (vigtigt for at se hjerte-impuls) af en 300 gl 28 g ½ insulinsprøjte, ogudarbejde 100 ul celler.
9. Holde nålen oprejst. Mens du holder huden af ​​mus stram med anden hånd stikkes nålen.
10. Vellykket indsætning i venstre hjerte ventrikel bør resultere i et særskilt klar rød puls blod i sprøjten. I denne dybde, trykkes forsigtigt stemplet for sprøjten (100 ul volumen), uden væsentlig bevægelse af nålen for at undgå punktering af hjertet eller spilde celler ind i brysthulen.
11. Efter celler injiceres, trækkes lidt op på stemplet for at skabe en lille mængde negativt tryk for at reducere dryp af celler ind i brysthulen.
12. Træk kanylen direkte ud af brystet og samtidig være sikker på at undgå at vippe nålen under fjernelsen, som kan rive foring af hjertet og forårsage blødninger.
13. Påfør let tryk på brystet over injektionsstedet for at reducere blødning.
14. Fjern musen fra næsekeglen og fortsat anvende let tryk i omkring 1 min.
15. Flyt musen til varmepude indtil fuldt conbevidst.
16. Hvis musen begynder at spinde eller spjæt efter nyttiggørelse, den sandsynlige årsag er en blodprop. Sprøjt mus intraperitonealt med 80-120 mg / kg af ketamin til at øge blodgennemstrømningen og minutvolumen, mens faldende vaskulær modstand. Dette bør hjælpe med musen passere blodproppen. Efter dette sker, er det bedst at ændre cellepræparater, da det tyder på, at cellerne er sammenklumpning. Vi ændre cellepræparater efter cirka 8 mus, og 30 min.

4. Intratibial

1. Injicere mus med Buprenex (0,1 mg / kg) eller lignende godkendt analgetisk umiddelbart før proceduren.
2. Bedøve mus ved hjælp af isofluran, derefter flytte til næse kegle og vedligeholde anæstesi.
3. Rengør begge ben med 10% povidon / iod vatpinden / opløsning, efterfulgt af ethanol, gentaget 2 gange. Fjerne hår ben (med Nair eller lignende produkt) før rengøring, hvis pels til stede.
4. Klem forsigtigt laterale malleol, mediale malleol og nedre halvdel af tibia med pegefinger og thUMB, derefter bøje benet (blanding af fleksion og lateral rotation, således at knæet er synligt og tilgængeligt.
5. Fugt huden med 70% EtOH at øge synligheden af ​​underliggende patellar ligament, som skal være synlig som en særskilt, tyk, hvid linje. Mens fast greb ankel / ben af ​​muse insert 28g ½ nål under patella, gennem midten af ​​patellar ligament, og ind i det forreste intercondylar område i toppen af ​​skinnebenet.
6. Når du sætter nålen ind skinneben, vejlede grundigt gennem vækst plade ved hjælp af stabil, fast tryk med let boring handling.
7. Efter gennemtrængning af tibial epifyseskive vil nålen støder markant mindre modstand.
8. Bruge en mild, lateral bevægelse af nålen for at sikre nålen er i tibia og gennem vækstpladen. Bevægelse vil være begrænset, hvis nålen er i korrekt sted i tibia.
9. Tryk langsomt stemplet at injicere 10 ul celle løsning. Lidt at ingen modstand bør kunne mærkes på dette punkt.
10. Slowly udtrække nålen.
11. Efter samme procedure, til næste ben videre at injicere 10 ul PBS.
12. Fjern musen fra anæstesi og holde på varmepude indtil inddrives.
13. Overvåg musene over de næste 24 timer og injicere yderligere Buprenex hver 12 timer, hvis dyrene viser fortsat tegn på lidelse.

5. Imaging Tidsforløb

1. Luciferase Imaging: I givet fald, luciferase imaging bør udnyttes begyndende ved 7 dage efter tumorcelle inokulation (dog i de fleste knoglemetastaser modeller, påvises tættere på dag 14). Mus injiceres intraperitonealt med 150 mg / kg luciferin, anæstetiseret, og afbildes 8 min efter injektion ved hjælp IVIS udstyr ^8.
2. GFP billeddannelse: Typisk GFP-udtrykkende tumorer begynder at kunne spores omkring dag 10-14 for intratibial injektioner og 16-21 til intrakardiale forsøg med Maestro imaging udstyr (CRI) ^9. Kort beskrevet mus bedøves med isofluran (3%) Og holdt under anæstesi gennem en næsekegle i Maestro billeddannelse kammeret. For vores EGFP-udtrykkende celler bruger vi den blå filter sæt (498 excitation/515 emission for eGFP) ved 500 ms eksponering i 10 nm trin.
3. Faxitron (X-ray): X-stråler er taget ugentlig starter mellem dag 7 til 14. Læsioner vil være synlige i det intrakardielle model på dag 21 og en uge tidligere i intratibial injektioner ^3. Vores radiografiske data for ex vivo og in vivo blev erhvervet under anvendelse af en Faxitron LX-60 ved 35 kV i 8 sekunders eksponering.
4. Andre Imaging: billeddiagnostiske metoder vil være helt baseret på den specifikke forskning. Ud over de ovennævnte metoder, kan levende dyr billeddannelse baseret på 3D mikro-computertomografi (μCT), mikro-positronemissionstomografi (μPET), og andre modaliteter ^10,11 give værdifulde oplysninger.

6. Mus Sacrifice

1. Hver model har en lidt anderledes tidsforløb. Med MDA-MB-231 celler mus normalt bliver kakektiske eller paraplegiker mellem 21 og 35 dage og normalt omkring dag 28 (IT injicerede mus mellem 21-28 dage).
2. Når flere mus udvikler læsioner, der begynder at bryde igennem den korticale knogle, blevet lammet, eller mister 10-20% af legemsvægten, alle mus i undersøgelsen ved hjælp af ketamin / xylazin overdosering med cervikal dislokation (eller en anden IACUC godkendt metode) ofre.
3. Fjern knogler er nødvendige for yderligere undersøgelse og butik i bufret 4% formalin.
4. Mus med brystet tumorer er et tegn på en forpasset indsprøjtning og burde udelukkes fra undersøgelsen.

7. Ex vivo-analyse

1. μCT: scanning i 70% EtOH giver mulighed for strukturelle og histologiske parametre, der skal måles på samme knogle prøve.
2. Kontur og analysere i henhold til individuelle eksperimentel design og tilgængelige udstyr ^10. Vore data blev opnået med en Scanco μCT 40 under anvendelse af 12 uM opløsning.
3. Histomorphometry: Proces prøver vha. foretrukne histologiske metoder og plette med Hematoxylin / eosin ⁷

8. Repræsentative resultater

Efter intrakardiale eller intratibial inokulering af tumorceller (fig. 1) mus fulgt ugentligt ved radiografi og fluorescens (eller luminescens). Læsioner normalt blive tydelige ved røntgen mellem uge 2 og 3, mens de kan være synlig ved fluorescens og luminescens så tidligt som uge 2, afhængigt af modellen (figur 2). Læsioner er synlige som mørke huller i knoglen, og bliver mere udtalte med tiden (figur 3). Læsioner blev kvantificeret ved anvendelse Metamorph analyse af røntgenbilleder og fluorescens blev kvantificeret ved anvendelse Maestro (CRi) billeddannelses-datafangst-og analysesoftware. Som læsioner begynder at vokse, mus ofte bliver kakektiske. Offer er påkrævet, når mus har tabt mellem 10-20% af deres oprindelige kropsvægt. Tilstanden af mus kan hurtigt ændre sig og skal overvåges flere gange i løbet af dagen. Mellem 3-4 uger mus begyndte at trække den ene eller begge bagben og hele undersøgelsen blev ofret. Billeder blev taget før aflivning. Efter anæstesi overdosis blev blod opsamlet for at måle markører for knogleomsætning eller andre faktorer. Efter cervikal dislokation blev huden fjernet fra mus udskæres og ben og renses for ex vivo-billeddannelse (fig. 3) der tillader visualisering af tumorfoci på mindst 7 dage før in vivo-billeddannelsesteknikker. Når billeddannelse blev afsluttet knogler blev anbragt i mærkede kassetter og opbevares i formalin til fiksering og yderligere histologisk behandling eller μCT analyse. Histomorfometri blev udført på prøverne til at angive tumorbelastningen og BV / TV efter μCT blev udført på et skinneben til at kvantificere mængden af knogledestruktion (fig. 4).

/ 4260/4260fig1.jpg "/>
Figur 1. Korrekt placering af injektionen. Ventral radiographical billede (A) i voksne mus thorax viser korrekt placering af nålen i ^4. interkostale mellemrum, og i den venstre ventrikel for intrakardial inokulering. Anatomiske vartegn er vist med vandrette stiplede linjer på brystbenet (skitseret i hvidt). På musens hud brystbenets hak og xyphoid proces fungere som vartegn, og nålen er indsat lidt til venstre af brystbenet. Ventrale radiographical view (B) i voksne mus ben viser korrekt placering af nålen i den proksimale tibia, tilpasset til hinanden kondyler. Fra en lateral perspektiv spidsen af ​​kanylen er placeret bag den tibiale tuberositas og dyb til epifyseskivernes. Ideel placering til injektion er vist ved hvid cirkel.

Figur 2. Tidsforløb af knoglemetastaser modeller. Progression af cancer-induceret knoglesygdom vist med x-stråler og GFP + fluorescerende billeder af tumorerne in vivo fra intratibial injektioner (A) og intrakardiale injektioner (B).

Figur 3. Tidsforløbet for intrakardialt MDA-MB-231 model Øverste række:. Ex vivo billede, der viser GFP-fluorescens på dag 0, 14, 21, og 28 efter intrakardial injektion af MDA-MB-231. Bemærk, at tumorfoci på dag 14 er kun synlige i ex vivo efter blødt væv fjernes. Nederste række: Ex vivo røntgenbilleder af de samme femora illustrerer osteolytiske knoglelæsioner. Bemærk, at knogledestruktion er normalt ikke synlige, indtil 3 uger efter hjerte-injektion.

Figur 4. Kvantificering af knogle metastatisk progression. GFP + tumor som visualiseret ved Maestro billeddannelse ex vivo for Tibiae af en ikke-tumorbærende mus (A) og en mus 4 uger efter intrakardial injektion af en GFP-udtrykkende MDA-MB-231 subklon (B). Tumorfoci korrelere med områder af knogledestruktion som vist ved Faxitron (D) sammenlignes en knogle uden tumor (C). Bone strukturelle og mineral data fra microCT målinger er gengivet som 3D-billeder af en sund knogle (E) og en tumorbærende ben (F), hvor områder af knoglenedbrydning er vist som ugyldige område. Yderligere knogle og tumor detaljer ses i tilsvarende H & E-farvede histologiske sektioner (G & H).

Discussion

Undersøgelser af tumor-induceret knoglesygdom afhængige af adskillige dyremodeller, hvoraf de to mest almindeligt anvendte er intrakardiale og intratibial vaccinationer. I mange tilfælde intrakardiale er den bedste mulighed for at studere metastaser til knogler, men betyder det ikke repræsentere den fulde metastatisk proces, og derfor yverfedt pad eller andre ortotopisk injektioner bør ideelt set anvendes mod herpå. Tumorceller ikke metastaserer let fra det primære sted i de fleste undersøgelser med humane celler, og i givet fald de primært metastaserer til lungerne. Nogle stammer af 4T1 celler vil metastaserer til knogle ^5,6, men de læsioner er mindre, mere vanskelig at kvantificere, og cellerne er muse snarere end human. Derudover kan GFP-ekspression fremkalde et immunrespons i immunkompetente modeller, hvor 4T1 kloner anvendes ofte som kan komplicere langvarige metastase studier ^12. Andre modeller af tumorinduceret knoglesygdom, såsom myeloma, anvender halevenen injections ^13. Men denne fremgangsmåde ikke arbejde for massive tumormetastase undersøgelser som det vil overvældende frø tumorerne til lungerne, hvilket får musene at dø af lungesygdomme, før udvikle knoglemetastaser. Intratibial injektioner er generelt set ringere end de andre metoder, da den ikke udgør en model for metastase, men udviklingen af ​​etablerede metastatisk knoglesygdom, og kan forårsage inflammation på injektionsstedet. Ikke desto mindre, denne procedure er nyttigt at adskille indledende metastatiske skridt og etablering af de direkte effekter på slutstadiet kræft-induceret knoglesygdom. Desuden er det i forbindelse med mange prostata tumormodeller er det den eneste metode, der giver mulighed for konsekvent tumorvækst i knoglen ^4.

Valget af teknikker til overvågning knoglesygdom er så kritisk og specifikke for undersøgelsen som ruten for inokulering. I vores gruppe har vi udnytte mange forskellige teknikker afhængig af undersøgelsen, than mest almindelige er x-ray, fluorescens og histologi. Mens mange grupper har skiftet til luciferase billeddannelse, har vi fundet, at vi får færre knoglemetastaser med de luciferase-transficerede celler, og at vi får en bedre anatomisk detalje med fluorescerende billeddannelse og lettere co-lokalisering med røntgenstråler. Desuden var direkte sammenligning mellem modaliteter ikke give en betydelig fordel for luciferase billeddannelse til tidlig påvisning i knoglen. Dog vil hver gruppe udfører disse eksperimenter nødt til at evaluere anvendeligheden af ​​hver tilgang til deres studier.

Derudover, selvom anvendes i mange andre modeller, de detaljerede ex vivo analyseteknikker er specifikke for knogler. Vi almindeligvis analysere knogletab ved μCT. Mens udføres på samme måde nogle undersøgelser af normal knogle, er analysen af ​​tumorbærende ben kompliceres af den hyppige tab eller afbrydelse af vækstpladen som markør. Histologiske analyser også noget nuancerede i tumor-Bærende ben i forhold til protokoller udviklet til ikke-tumorbærende knogler og blødt væv. I denne protokol vi har begrænset af beskrivelsen af de ex vivo-analyser for at fastholde fokus på de mest almindeligt anvendte i vores gruppe. Som med in vivo analyser vil hver gruppe skal afgøre, hvilke skridt der virker bedst for deres undersøgelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 human breast cancer cells	Originally ATCC-Internally cloned and selected
DMEM	GIBCO	11885
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
FBS	Atlas Biological	F-0050a
Trypsin	GIBCO	15400
Faxitron	Faxitron
Maestro	CRi
μCT scanner	Scanco
Athymic Nude Mice	Harlan	Fox nu -/-
Insulin Syringes (300 μl, 28.5 g)	Becton Dickinson	309300
IVIS	Caliper
Irradiated Rodent Diet	Teklad	2920x