Summary
पशु मॉडल अक्सर हड्डी करने के लिए कैंसर मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है. इस प्रोटोकॉल में हम अस्थि मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए दो ट्यूमर टीका के आम तरीकों का वर्णन और संक्षिप्त करने की निगरानी और इन मॉडलों यों का उपयोग विश्लेषण के कुछ का वर्णन है.
Protocol
1. सेल रखरखाव
- एमडीए MB-231 के कई हड्डी metastatic subclones मौजूद कि हड्डी उपनिवेशवाद और विकास के लिए चर प्रवृत्ति है. अपने प्रयोगों के लिए हम एक क्लोन से व्युत्पन्न GFP टैग UTHSCA 2 में विकसित एमडीए MB-231 का उपयोग करें. यह विशेष रूप से उप क्लोन 4 सप्ताह में बलिदान के साथ लगभग 3 सप्ताह बाद टीका में दिखाई में osteolytic हड्डी घावों, बनेगी.
- DMEM 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-8% 7 2 सह में 10% FBS और 0.1 मिलीग्राम / एमएल पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त में कोशिकाओं को बनाए रखने.
- 80-90% और एक 1:10 कमजोर पड़ने पर फिर से प्लेट संगम पर बीतने कोशिकाओं (सेल प्रकार और आकार प्लेट के आधार पर भिन्न होता है एमडीए MB-231 कोशिकाओं में एक T-75 के लिए इस 6x10 लगभग 5.) है, जो लगभग हर 72 घंटे है.
- एमडीए MB-231 कोशिकाओं कई pseudopodia साथ एक आम तौर पर तंतुप्रसू संबंधी उपस्थिति बनाए रखने के लिए. कोई गोलाई भीड़भाड़ या अन्य अवांछनीय तनाव का संकेत है, और इस के बाद से परहेज किया जाना चाहिएvivo में metastatic क्षमता को प्रभावित कर सकता है.
- आदर्श रूप में, सेल संस्कृति में बनाए रखा जाना चाहिए, केवल संक्षिप्त टीका (हम कम से कम 1 विकेटकीपर की सलाह देते हैं या जब तक आप प्रयोग के लिए पर्याप्त कोशिकाओं) से पहले और एक नई शीशी अगर गोलाई या सेल वृद्धि दर में परिवर्तन हो thawed किया जाना चाहिए.
2. सेल तैयारी
- 80-90% के संगम पर 0.15% के साथ कोशिकाओं Trypsinize trypsin / EDTA (0.5% पीबीएस में Gibco ट्रिप्सिन EDTA 01:02 जलमिश्रित). यह एकाग्रता तेजी टुकड़ी (<2 मिनट) के लिए अनुमति देता है और कोशिकाओं के clumping को कम कर देता है.
- तुरंत थाली से 10 मिलीलीटर DMEM ठंडा 15 मिलीलीटर शंक्वाकार और 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 10% FBS, विंदुक युक्त कोशिकाओं को हटाने.
- 25 मिलीलीटर ठंडा (सीए और एम.जी. के बिना) PBS और गिनती में एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में Resuspend गोली.
- फिर से गोली अपकेंद्रित्र, और 10 6 कोशिकाओं में प्रति मिलीलीटर (intracardiac) या ठंडा पीबीएस में 250,000 cells/10 μl (intratibial) resuspend. टेम्पेरेकोशिकाओं और इंजेक्शन के बाद बाद दिल का आवेश के रोकने के लिए पीबीएस की संरचना के लिए महत्वपूर्ण है. सेल निलंबन बर्फ पर रहते हुए इंजेक्शन का प्रदर्शन करना चाहिए और व्यवहार्य हो सकता है और रहेगा 30 मिनट के लिए संयुक्त राष्ट्र के clumped. जबकि आवश्यक प्लेटों की सही संख्या अन्वेषक से अन्वेषक के लिए भिन्न होगा, हम आम तौर पर 8-10 चूहों के बीच 1 T-75 के लिए उपयोग करें.
3. Intracardiac टीका
- 4-6 सप्ताह पुराने महिला (में Foxn परमाणु / -: Harlan) चूहों इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाता है, हालांकि अन्य प्रतिरक्षा समझौता चूहों (RAG1 / -, RAG2 / -, SCID, XID, आदि) और भी हो सकता है मानव कैंसर कोशिका प्रयोगों के साथ प्रयोग किया जाता है.
- नग्न चूहों खिलाया Teklad 2920x आहार 5-10 दिनों के इंजेक्शन से पहले इंजेक्शन प्रक्रिया से मृत्यु दर को कम करने के लिए, और इमेजिंग प्रक्रियाओं में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम करना चाहिए (के बाद से एक प्रकार का पौधा जो पशुओं के चारे के काम में आता है मुफ्त भोजन है).
- / परमाणु परमाणु के अलावा अन्य चूहों का उपयोग अगर, हजामत बनाने का काम या उदर पेट की गिरफ्तारी पर नायर (हमारे अनुभव नायर बेहतर काम करता है) का उपयोग कर से बालों को हटाप्रक्रिया शुरू होने से पहले ea.
- या अन्य पसंदीदा संज्ञाहरण (isoflurane intracardiac inoculations के लिए सहन हमारे अनुभव में सबसे अच्छा है): एक अलग कक्ष में एक isoflurane (2-3 एल / मिनट 2 हे 2.5% आईएसओ) vaporizer का उपयोग माउस anesthetize.
- एक स्टेनलेस स्टील हवादार हुड के अंदर संज्ञाहरण मशीन की नाक शंकु के लिए एक समय में एक माउस ले जाएँ.
- छाती का सामना करना पड़ के साथ अपनी पीठ पर प्रत्येक माउस की स्थिति.
- एक 10% झाड़ू / povidone आयोडीन समाधान / 70% इथेनॉल के द्वारा पीछा किया, 2 बार दोहराने के साथ सीने में धो लें.
- इंजेक्शन के लिए मार्क माउस छाती (एक बाँझ मार्कर का उपयोग कर या पक्ष को थोड़ा अंकन इंजेक्शन साइट बाँझ रखने). हम sternal पायदान और xyphoid प्रक्रिया के शीर्ष स्थान के बीच एक निशान बीच, और थोड़ा छोड़ दिया उरोस्थि के (शरीर रचना) का उपयोग करें. सिरिंज में हवा का एक छोटा बुलबुला ड्रा सवार और meniscus के बीच एक 300 μl 28 साढ़े छ इंसुलिन सिरिंज के अंतरिक्ष (कार्डियक नाड़ी देखने के लिए महत्वपूर्ण) बनाने के लिए, औरकोशिकाओं के 100 μl आकर्षित.
- सुई सीधा रखें. जबकि दूसरे हाथ से तना हुआ माउस की त्वचा पकड़े, सुई डालने.
- बाएं हृदय निलय में सफल प्रविष्टि सिरिंज में खून की एक विशिष्ट लाल उज्ज्वल नाड़ी में परिणाम चाहिए. इस गहराई में, ध्यान से सिरिंज के सवार (100 μl मात्रा) सीने गह्वर में दिल या spilling कोशिकाओं puncturing से बचने के लिए सुई की महत्वपूर्ण आंदोलन के बिना, दबाना.
- के बाद कोशिकाओं को इंजेक्ट कर रहे हैं, थोड़ा सवार पर नकारात्मक सीने गह्वर में कोशिकाओं के टपकता को कम दबाव की एक छोटी राशि बनाने खींच.
- सुई सीधे सीने से बाहर खींच जबकि हटाने, जो दिल की परत आंसू और खून बह रहा पैदा कर सकता है के दौरान झुकाव सुई से बचने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है.
- इंजेक्शन स्थल पर छाती कोमल दबाव लागू करने के लिए खून बह रहा कम.
- नाक शंकु से माउस निकालें और के बारे में 1 मिनट के लिए प्रकाश दबाव लागू करने के लिए जारी है.
- हीटिंग पैड के लिए पूरी तरह से चुनाव तक माउसscious.
- अगर माउस स्पिन करने के लिए या वसूली के बाद चिकोटी शुरू होता है, संभावित कारण एक दिल का आवेश है. माउस intraperitonally / ketamine के 80-120 किलो मिलीग्राम के साथ रक्त के प्रवाह को बढ़ाने के लिए और कार्डियक आउटपुट जबकि संवहनी प्रतिरोध कम इंजेक्षन. यह माउस थक्का पारित करने के लिए मदद करनी चाहिए. इस के बाद होता है, यह सबसे अच्छा है करने के लिए सेल की तैयारियाँ बदलने, के रूप में यह इंगित करता है कि कोशिकाओं को clumping रहे हैं. हम लगभग 8 चूहों के बाद सेल तैयारियाँ बदलने के लिए, या 30 मिनट.
4. Intratibial
- Buprenex (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) या इसी तरह की प्रक्रिया से पहले तुरंत मंजूरी दे दी एनाल्जेसिक के साथ माउस इंजेक्षन.
- माउस anesthetize isoflurane का उपयोग करते हुए, तो नाक शंकु के लिए ले जाने के लिए और संज्ञाहरण बनाए रखने.
- 10% povidone / आयोडीन के साथ दोनों पैरों को साफ झाड़ू / समाधान, इथेनॉल द्वारा पीछा किया, 2 बार दोहरा. फर अगर वर्तमान में सफाई करने से पहले बाल हटाना पैर (नायर या इसी तरह के उत्पाद के साथ).
- धीरे पार्श्व malleolus, औसत दर्जे का malleolus, और तर्जनी और वें साथ टिबिया के निचले आधे समझUMB, तो पैर मोड़ (घुमाव और पार्श्व रोटेशन के संयोजन, जैसे कि घुटने दिखाई और सुलभ है.
- 70% EtOH साथ त्वचा गीला patellar बंधन है, जो एक अलग, मोटी, सफेद लाइन के रूप में दिखाई जानी चाहिए अंतर्निहित की दृश्यता में वृद्धि. जबकि टखने / 28g माउस डालने साढ़े वुटने की चक्की के तहत सुई patellar बंधन के बीच के माध्यम से की पैर मजबूती लोभी, और टिबिया के शीर्ष में पूर्वकाल intercondylar क्षेत्र में.
- जब टिबिया में सुई डालने, ग्रोथ प्लेट के माध्यम से ध्यान गाइड स्थिर, मामूली ड्रिलिंग कार्रवाई के साथ फर्म दबाव का उपयोग.
- Tibial ग्रोथ प्लेट के प्रवेश पर, सुई स्पष्ट रूप से कम प्रतिरोध का सामना करेंगे.
- एक सौम्य, सुई के पार्श्व आंदोलन का प्रयोग सुनिश्चित करने के लिए सुई टिबिअ में और विकास प्लेट के माध्यम से है. आंदोलन सीमित हो जाएगा अगर सुई टिबिया के भीतर उचित जगह में है.
- धीरे सवार दबाना सेल समाधान के 10 μl इंजेक्षन. इस बिंदु पर कोई प्रतिरोध करने के लिए कम महसूस किया जाना चाहिए.
- SloWLY सुई निकालने के.
- एक ही प्रक्रिया के बाद, अगले चरण के लिए आगे बढ़ने के लिए पीबीएस की 10 μl इंजेक्षन.
- संज्ञाहरण से माउस निकालें और हीटिंग पैड पर रखने के लिए जब तक बरामद.
- अगले 24 घंटे में चूहों की निगरानी और अतिरिक्त Buprenex के साथ हर 12 घंटा इंजेक्षन अगर पशुओं के लिए संकट के लक्षण दिखाने के लिए जारी है.
5. इमेजिंग टाइम कोर्स
- Luciferase इमेजिंग: जहां लागू हो, luciferase इमेजिंग 7 दिनों के बाद ट्यूमर सेल टीका (हालांकि सबसे अस्थि मेटास्टेसिस मॉडल में, 14 दिन के करीब detectable) शुरू किया जाना चाहिए. 150 मिलीग्राम / किग्रा Luciferin, anesthetized के साथ माउस intraperitoneally इंजेक्ट किया जाता है, और IVIS 8 उपकरण का उपयोग इंजेक्शन के बाद 8 मिनट imaged.
- GFP इमेजिंग: आमतौर पर GFP-व्यक्त ट्यूमर के लिए 10-14 दिन के आसपास intratibial intracardiac Maestro इमेजिंग उपकरण (CRI) 9 का उपयोग करते हुए प्रयोगों के लिए इंजेक्शन के लिए 16-21 detectable हो शुरू. संक्षेप में, चूहों isoflurane साथ anesthetized (3%) और Maestro इमेजिंग कक्ष में एक नाक शंकु के माध्यम से संज्ञाहरण के अंतर्गत रखा गया है. हमारे EGFP-व्यक्त कोशिकाओं के लिए हम 500 एनएम 10 चरणों में एमएस जोखिम में नीला फिल्टर सेट (EGFP 498 excitation/515 उत्सर्जन) का उपयोग करें.
- Faxitron (एक्स - रे): एक्स - रे लिया जाता है साप्ताहिक 14 से 7 दिन के बीच शुरू. घावों 21 दिन में intracardiac मॉडल में दिखाई और एक सप्ताह में intratibial इंजेक्शन 3 पहले. पूर्व vivo के लिए और vivo में हमारे radiographic डेटा में जोखिम का 8 सेकंड के लिए 35 केवी एक Faxitron LX-60 का उपयोग कर लिया था.
- अन्य इमेजिंग: इमेजिंग तौर तरीकों को पूरी तरह से विशिष्ट अनुसंधान पर आधारित होगा. उपर्युक्त विधियों के अलावा, जीवित पशुओं पर आधारित 3 डी सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी (μCT), सूक्ष्म पोजीट्रान उत्सर्जन tomography (μPET), और अन्य रूपरेखा 10,11 इमेजिंग बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं.
6. माउस बलिदान
- प्रत्येक मॉडल एक से थोड़ा अलग समय पाठ्यक्रम है. एमडीए MB-2 के साथ31 कोशिकाओं को चूहों आमतौर पर 21 और 35 दिन है और आमतौर पर 28 दिन के आसपास (21-28 दिनों के बीच चूहों अंतःक्षिप्त) के बीच क्लांत या paraplegic हो गया है.
- एक बार कई चूहों घावों कि cortical हड्डी के माध्यम से तोड़ने, paraplegic हो, या खो शरीर के वजन के 10-20% के बीच, इस अध्ययन में सभी चूहों / ketamine xylazine ग्रीवा अव्यवस्था (या अन्य IACUC मंजूरी दे दी विधि) के साथ जरूरत से ज्यादा का उपयोग कर बलिदान शुरू विकसित करना.
- आगे और buffered 4% formalin में अध्ययन की दुकान के लिए आवश्यक हड्डियों निकालें.
- सीने में ट्यूमर के साथ चूहे एक चूक इंजेक्शन का संकेत कर रहे हैं और अध्ययन से बाहर रखा जाना चाहिए.
7 पूर्व vivo विश्लेषण
- μCT: 70% EtOH में स्कैनिंग संरचनात्मक और histological मापदंडों के लिए अनुमति देता है एक ही हड्डी नमूना पर मापा जा.
- समोच्च और व्यक्तिगत प्रयोगात्मक डिजाइन और 10 उपकरण उपलब्ध के अनुसार का विश्लेषण. हमारे डेटा SCANCO 40 μCT साथ 12 सुक्ष्ममापी संकल्प का उपयोग कर प्राप्त किया गया था.
- Histomorphometry: प्रक्रिया नमूनों वरीय histological तरीकों का उपयोग और Hematoxylin / 7 लाल भामसान रंग के साथ दाग
8. प्रतिनिधि परिणाम
ट्यूमर कोशिकाओं के intracardiac या intratibial टीका (1 चित्रा) के बाद चूहों रेडियोग्राफी और प्रतिदीप्ति (या luminescence) द्वारा साप्ताहिक निगरानी कर रहे हैं. घावों सामान्य एक्स - रे द्वारा स्पष्ट सप्ताह दो और तीन के बीच हो गई, जबकि वे दो सप्ताह के रूप में जल्दी के रूप में प्रतिदीप्ति और luminescence द्वारा दिखाई हो, (चित्रा 2) मॉडल के आधार पर हो सकता है. घावों हड्डी में छेद अंधेरे के रूप में दिखाई दे रहे हैं, और समय (3 चित्रा) के साथ और अधिक स्पष्ट हो जाते हैं. घावों Metamorph radiographs के विश्लेषण का उपयोग मात्रा निर्धारित किए गए थे और प्रतिदीप्ति Maestro इमेजिंग (CRI) अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा निर्धारित किया गया था. के रूप में घावों के लिए विकसित करने के लिए शुरू, चूहों अक्सर क्लांत हो. जब चूहों अपने प्रारंभिक शरीर के वजन के 10-20% के बीच खो दिया है बलिदान की आवश्यकता है. की हालत चूहों तेजी से बदल सकते हैं और दिन के दौरान कई बार नजर रखी जाना चाहिए. चूहों के लिए 3-4 सप्ताह के बीच एक या दोनों हिंद अंग खींचें शुरू हुआ और पूरे अध्ययन बलिदान था. छवियाँ पहले ले जाया गया बलिदान करने के लिए. संज्ञाहरण अधिमात्रा के बाद रक्त के हड्डी कारोबार या अन्य कारकों के मार्कर को मापने के लिए एकत्र किया गया था. अव्यवस्था के बाद गर्भाशय ग्रीवा, त्वचा excised माउस और हड्डियों से छीन लिया गया था और पूर्व vivo इमेजिंग (3 चित्रा) जो ट्यूमर foci के दृश्य कम से कम 7 दिनों से vivo इमेजिंग तकनीक में पहले की अनुमति देगा के लिए साफ. एक बार जब इमेजिंग पूरा किया गया हड्डियों लेबल कैसेट में रखा गया और निर्धारण और आगे histological प्रसंस्करण या μCT विश्लेषण के लिए formalin में संग्रहित है. Histomorphometry नमूने पर प्रदर्शन किया गया था के बाद ट्यूमर बोझ और BV / टीवी संकेत μCT एक टिबिअ पर प्रदर्शन किया था हड्डी विनाश की राशि (4 चित्रा) यों.
4260/4260fig1.jpg / "/>
चित्रा 1. इंजेक्शन के उचित स्थान वेंट्रल radiographical दृश्य (ए) वयस्क चूहे में 4 वें पसलियों के बीच अंतरिक्ष और intracardiac टीका के लिए बाएं वेंट्रिकल में सुई के उचित स्थान दिखा छाती की. शारीरिक स्थलों उरोस्थि (सफेद में उल्लिखित) पर क्षैतिज धराशायी लाइनों के साथ दिखाया जाता है. माउस त्वचा पर sternal पायदान और xyphoid प्रक्रिया स्थलों के रूप में सेवा करने के लिए, और सुई थोड़ा छोड़ा उरोस्थि से डाला जाता है. वेंट्रल radiographical दृश्य (बी) वयस्क माउस समीपस्थ टिबिअ में सुई के उचित स्थान दिखा, पैर condyles के बीच गठबंधन की. एक पार्श्व नजरिए से सुई की नोक tibial गाठदारपन और epiphyseal थाली गहरी के पीछे रखा गया है. इंजेक्शन के लिए आदर्श स्थान सफेद वृत्त द्वारा दिखाया गया है.
चित्रा 2. अस्थि मेटास्टेसिस मॉडलों के समय पाठ्यक्रम सीए की प्रगति.एक्स - रे और GFP साथ ncer प्रेरित हड्डी रोग दिखाया + इंजेक्शन के intratibial (A) और intracardiac इंजेक्शन (B) से vivo में ट्यूमर के चित्र फ्लोरोसेंट.
चित्रा 3. समय पूर्व vivo दिन 0, 14, 21, और 28 में एमडीए MB-231 के intracardiac इंजेक्शन के बाद GFP प्रतिदीप्ति दिखा छवि intracardiac मॉडल एमडीए MB-231 शीर्ष पंक्ति के पाठ्यक्रम. ध्यान दें कि 14 दिन में ट्यूमर foci नरम ऊतक को हटाने के बाद ही पूर्व vivo में दिखाई दे रहे हैं. नीचे पंक्ति: पूर्व vivo radiographic छवियों ही osteolytic हड्डी घावों illustrating जाँघ की लंबी हड्डी जो ऊपर कूल्हे की हड्डी से तथा नीचे टिबिया एवं टेला से जुड़ी होती है. ध्यान दें कि हड्डी विनाश आमतौर पर दिखाई 3 सप्ताह के हृदय इंजेक्शन के बाद जब तक नहीं है.
चित्रा 4. हड्डी metastatic प्रगति GFP. की मात्रा Maestro Tibi इमेजिंग पूर्व vivo द्वारा visualized रूप में ट्यूमरAE असर गैर ट्यूमर (A) माउस और एक माउस के एक एमडीए MB-231 (बी) subclone व्यक्त GFP की intracardiac इंजेक्शन के बाद 4 सप्ताह के. ट्यूमर foci हड्डी विनाश के क्षेत्रों के साथ सहसंबंधी रूप Faxitron (D) द्वारा दिखाया ट्यूमर (सी) के बिना एक हड्डी की तुलना में. MicroCT माप से अस्थि संरचनात्मक और खनिज डेटा एक स्वस्थ (ई) की हड्डी और एक ट्यूमर असर हड्डी (एफ) जहां हड्डी विनाश के क्षेत्रों शून्य क्षेत्र के रूप में दिखाया जाता है 3 डी छवियों के रूप में प्रदान की गई है. इसके अलावा हड्डी और ट्यूमर विस्तार इसी एच ई कलंकित histological वर्गों (जी और एच) में देखा जाता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ट्यूमर प्रेरित हड्डी रोग के अध्ययन के कई पशु मॉडल है जो दो सबसे अधिक इस्तेमाल किया intracardiac और intratibial inoculations पर भरोसा करते हैं. कई मामलों में intracardiac हड्डी मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए सबसे अच्छा विकल्प है, तथापि, यह पूर्ण metastatic प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व नहीं करता है और इसलिए स्तन वसा पैड या अन्य orthotopic इंजेक्शन आदर्श कि अंत की ओर इस्तेमाल किया जाना चाहिए. ट्यूमर कोशिकाओं को आसानी से सबसे मानव कोशिकाओं का उपयोग करते हुए अध्ययन में प्राथमिक साइट से metastasize नहीं करते हैं, और यदि ऐसा है तो, वे मुख्य रूप से फेफड़ों के लिए metastasize. 4T1 कोशिकाओं के कुछ उपभेदों 5,6 हड्डी metastasize, लेकिन घावों छोटे, अधिक मुश्किल मात्रा ठहराना करने के लिए कर रहे हैं, और कोशिकाओं मानव बजाय murine हैं. इसके अतिरिक्त, GFP अभिव्यक्ति प्रतिरक्षा सक्षम मॉडल में एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना कर सकते हैं जहां 4T1 क्लोनों अक्सर है कि लंबी अवधि के मेटास्टेसिस अध्ययन 12 को जटिल बना सकता है के लिए उपयोग किया जाता है. ट्यूमर प्रेरित हड्डी रोग के अन्य मॉडल myeloma तरह, पूंछ नस inj का उपयोग13 ections. हालांकि, इस दृष्टिकोण ठोस ट्यूमर मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए काम नहीं करेगा के रूप में यह भारी फेफड़ों ट्यूमर बीज, चूहों के फेफड़ों के रोग के हड्डी metastases के विकास से पहले मरने के लिए पैदा होगा. Intratibial इंजेक्शन आम तौर पर अन्य तरीकों की तुलना में कम कृपापूर्वक देखा जाता है, के रूप में यह मेटास्टेसिस के एक मॉडल का प्रतिनिधित्व नहीं करता, बल्कि स्थापित metastatic हड्डी रोग की प्रगति, और इंजेक्शन स्थल पर सूजन पैदा कर सकता है. बहरहाल, इस प्रक्रिया के अंतिम चरण के कैंसर प्रेरित हड्डी रोग पर प्रत्यक्ष प्रभाव से अलग प्रारंभिक metastatic कदम और स्थापना के लिए उपयोगी है. इसके अलावा, कई प्रोस्टेट ट्यूमर मॉडल के मामले में, यह केवल दृष्टिकोण है कि 4 हड्डी में लगातार ट्यूमर के विकास के लिए अनुमति देता है.
हड्डी रोग की निगरानी के लिए तकनीक के विकल्प के रूप में महत्वपूर्ण और टीका के मार्ग के रूप में अध्ययन करने के लिए विशिष्ट है. हमारे समूह में हम कई अलग अलग अध्ययन के आधार पर, टी तकनीकों का उपयोगवह जिसमें से सबसे सामान्य एक्स - रे, प्रतिदीप्ति और ऊतक विज्ञान हैं. जबकि कई समूहों luciferase इमेजिंग transitioned है, हमने पाया है कि हम कम luciferase ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ और हम बेहतर फ्लोरोसेंट इमेजिंग और आसान करने के लिए एक्स - रे के साथ सह - स्थानीयकरण के साथ शारीरिक विस्तार मिलता है कि हड्डी metastases मिलता है. इसके अलावा, तौर तरीकों के बीच प्रत्यक्ष तुलना हड्डी में जल्दी पता लगाने के लिए luciferase इमेजिंग के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ उपज नहीं था. हालांकि, प्रत्येक समूह इन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए अपनी पढ़ाई के लिए प्रत्येक दृष्टिकोण की उपयोगिता का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होगी.
इसके अतिरिक्त, हालांकि कई अन्य मॉडलों में उपयोग, विस्तृत पूर्व vivo विश्लेषण तकनीक हड्डी के लिए विशिष्ट हैं. हम सामान्यतः μCT द्वारा हड्डी हानि का विश्लेषण. जबकि सामान्य हड्डी का विश्लेषण करने के अध्ययन के लिए इसी तरह प्रदर्शन, ट्यूमर असर हड्डियों के विश्लेषण अक्सर या एक मार्कर के रूप में विकास की थाली के नुकसान के विघटन से जटिल है. Histological विश्लेषण भी कुछ ट्यूमर में सूक्ष्मअसर हड्डियों के रूप में गैर - ट्यूमर असर हड्डियों और कोमल ऊतकों के लिए विकसित करने के लिए प्रोटोकॉल तुलना. इस प्रोटोकॉल में हम पूर्व vivo विश्लेषण का वर्णन सीमित है क्रम में उन लोगों के लिए सबसे अधिक हमारे समूह द्वारा उपयोग ध्यान बनाए रखने के लिए. साथ vivo विश्लेषण में, प्रत्येक समूह के लिए निर्धारित दृष्टिकोण क्या उनके अध्ययन के लिए सबसे अच्छा काम करने के लिए की आवश्यकता होगी.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
P01CA040035 (FE JAS /) और VA कैरियर विकास पुरस्कार (JAS): लेखकों निम्नलिखित धन स्रोतों को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 human breast cancer cells | Originally ATCC-Internally cloned and selected | ||
| DMEM | GIBCO | 11885 | |
| PBS | Mediatech Inc | 21-040-CV | |
| FBS | Atlas Biological | F-0050a | |
| Trypsin | GIBCO | 15400 | |
| Faxitron | Faxitron | ||
| Maestro | CRi | ||
| μCT scanner | Scanco | ||
| Athymic Nude Mice | Harlan | Fox nu -/- | |
| Insulin Syringes (300 μl, 28.5 g) | Becton Dickinson | 309300 | |
| IVIS | Caliper | ||
| Irradiated Rodent Diet | Teklad | 2920x |
References
- Sterling, J. A., Edwards, J. R., Martin, T. J., Mundy, G. R. Advances in the biology of bone metastasis: how the skeleton affects tumor behavior. Bone. 48, 6-15 (2011).
- Yoneda, T., Sasaki, A., Mundy, G. R. Osteolytic bone metastasis in breast cancer. Breast Cancer Res. Treat. 32, 73-84 (1994).
- Johnson, R. W. TGF-beta promotion of Gli2-induced expression of parathyroid hormone-related protein, an important osteolytic factor in bone metastasis, is independent of canonical Hedgehog signaling. Cancer Res. 71, 822-831 (2011).
- Li, X. Loss of TGF-beta Responsiveness in Prostate Stromal Cells Alters Chemokine Levels and Facilitates the Development of Mixed Osteoblastic/Osteolytic Bone Lesions. Mol. Cancer Res. , (2012).
- Yoneda, T. Actions of bisphosphonate on bone metastasis in animal models of breast carcinoma. Cancer. 88, 2979-2988 (2000).
- Rose, A. A. Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone. Mol. Cancer Res. 5, 1001-1014 (2007).
- Sterling, J. A. The hedgehog signaling molecule Gli2 induces parathyroid hormone-related peptide expression and osteolysis in metastatic human breast cancer cells. Cancer Res. 66, 7548-7553 (2006).
- Lu, X. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging alpha4beta1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20, 701-714 (2011).
- Oyajobi, B. O. Detection of myeloma in skeleton of mice by whole-body optical fluorescence imaging. Mol. Cancer Ther. 6, 1701-1708 (2007).
- Johnson, L. C. Longitudinal live animal micro-CT allows for quantitative analysis of tumor-induced bone destruction. Bone. 48, 141-151 (2011).
- Sterling, J., Johnson, R. Imaging Techniques for the Detection and Examination of Breast Cancer Metastasis to Bone. 46, Nova Science Publishers. (2011).
- Steinbauer, M. GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice. Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).
- Oyajobi, B. O. Dual effects of macrophage inflammatory protein-1alpha on osteolysis and tumor burden in the murine 5TGM1 model of myeloma bone disease. Blood. 102, 311-319 (2003).
