Summary
동물 모델은 자주 뼈에 암 전이를 공부하는 활용하고 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 뼈 전이 연구에 대한 종양 접종의 일반적인 두 가지 방법을 설명하고 간략하게이 모델을 모니터링하고 정량화하기 위해 이용 분석의 일부를 설명합니다.
Abstract
뼈 metastases 유방, 전립선 및 폐 등 여러 malignancies에서 일반적으로 발생합니다. 일단 뼈 년에 설립 된, 종양이 중요한 병적 상태와 사망률 1 책임이 있습니다. 따라서, 뼈에 종양의 설립, 성장과 활동을 제어하는 분자 메커니즘을 이해하는 중요한 필요가있다. 생체 모델의 일부는이 사건을 연구하기 위해 설립 각은 특정 혜택과 제한 사항이 있습니다되었습니다. 가장 일반적으로 사용되는 모델은 직접 athymic (누드) BalbC 마우스의 동맥 혈액 공급에 종양 세포의 intracardiac 접종을 활용합니다. 이 절차는 여러 가지 종양 유형 (PC-3 전립선 암, 폐 암, 및 마우스 유방 지방 패드의 종양 포함)에 적용 할 수 있지만,이 원고에서 우리는, MDA-MB-231 유방암 모델에 초점을 맞출 것이다. 이 모델에서 우리는 원래 산 안토니오 (San Antonio) 2 박사 Mundy의 그룹에 파생 매우 뼈 선택 클론을, 활용이 H이후 GFP를 표현 transfected과 그룹 3 다시 복제되고 있습니다. 이 클론은 osteotropism의 높은 속도와 폐, 간, 또는 부신 분비에 거의 전이가있는 전이성 뼈 변형입니다. intracardiac 주사가 가장 일반적으로 특정 경우에 뼈 전이 2, 연구에 사용하고 있지만 4 intratibial 또는 유방 지방 패드 주사가 더 적합합니다. , 뼈에 체포 생존, 세포 분열 따위에 의해 번식, 암 유발 뼈 질환으로 발전 종양을 설정하는 데, 특히 암 세포의 능력을 전이 이후 단계를 모니터링의 목적으로 인간의 종양 세포를 사용하는 경우 Intracardiac 주사는 일반적으로 수행됩니다. 종양이 설립 전이성 뼈 질환에 약 상호 뼈에 metastasized 한 후 암 세포와 뼈의 관계에 초점을 경우 Intratibial 주사가 수행됩니다. 색전증 및 항목도 이러한 모델 recapitulates의 전이성 과정에서 초기 단계 이전순환에 종양 세포의. 뼈에 기본 사이트에서 차 종양의 성장이나 전이를 모니터링한다면, 유방 지방 패드의 예방 접종은 일반적으로 선호되지만, 거의 종양 세포 라인은 지속적으로, 4T1 뼈 우대 클론과 함께 주요 사이트에서 뼈 유방 마우스를 metastasize합니다 암, 예외 5,6된다.
이 원고 내용을 접종 절차 및 게시물 접종 분석의 주요 키 단계. 특히, 그것은 세포 배양, intracardiac 및 intratibial 예방 접종에 대한 종양 세포 접종 절차뿐만 아니라 X 선, 형광 및 histomorphometric 분석하여 매주 모니터링에 대한 간략한 정보가 포함되어 있습니다.
Protocol
1. 셀 유지 보수
- MDA-MB-231의 많은 뼈 전이성 subclones는 뼈 식민과 성장을위한 변수 성향을 가지고 그 존재합니다. 실험을 위해 우리는 UTHSCA 2 개발 GFP 태그 MDA-MB-231에서 파생 된 복제를 사용합니다. 이 특정 하위 클론이 사주의 희생으로 약 3 주 후 접종에서 볼 수 osteolytic 뼈 병변을 형성합니다.
- DMEM이 5~8% 2 7 CO에서 37 ° C 10 % FBS와 0.1 MG / ML 페니실린 - 스트렙토 마이신을 포함하는으로 세포를 유지하고 있습니다.
- 1시 10분 희석에 80-90%의 합류와 재 판의 항로 세포 (이 세포 유형과 크기 판에 따라 다릅니다. T-75의 MDA-MB-231 세포의 경우이 약 6x10 5), 그 대략 72 시간입니다.
- MDA-MB-231 세포는 수많은 pseudopodia와 일반적으로 fibroblastic을 유지합니다. 모든 반올림는 인구 과잉 또는 기타 바람직하지 않은 스트레스를 나타내는,이 때문에 피해야한다생체 내 전이성 잠재력에 영향을 미칠 수 있습니다.
- 이상적으로, 세포가 접종 (우리가 미만 한 주를 추천하거나 실험에 충분한 세포를 때까지) 전에 만 간략하게 문화에 유지해야하고, 라운딩 또는 세포 성장 속도의 변화가 발생할 경우 새 유리 병은 해동해야합니다.
2. 셀 준비
- 0.15 %로 80-90%의 합류에서 세포를 Trypsinize 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (PBS에 0.5 % Gibco 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1시 2분을 희석). 이 농도는 빠른 분리 (<2 분)을 허용하고 세포의 거리며 걷게 줄일 수 있습니다.
- 즉시 10 ML 얼음처럼 차가운 DMEM 5 분 200 XG 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 10% FBS, 피펫을 포함하는으로 접시에서 세포를 제거합니다.
- 25 ML 얼음처럼 차가운 PBS (CA와 MG 제외) 수가 50 ML 원뿔 튜브에 Resuspend 펠릿.
- 다시 펠렛에 원심 분리기 및 ML (intracardiac) 당 10 6 셀이나 얼음처럼 차가운 PBS에서 250,000 cells/10 μl (intratibial)에 resuspend. 온도PBS의 진짜야은 세포와 주사 후 후속이 심 하셔서 거리며 걷게되지 않도록하는 것이 중요합니다. 세포 현탁액 주사를 수행하는 동안 얼음에 남아 있어야하며 가능한이어야하며 30 분에 해제 clumped 유지됩니다. 필요한 플레이트의 정확한 수는 조사자의 조사자에 따라 다를 수 있지만, 우리는 일반적으로 8-10 마우스 사이에 한 T-75을 사용합니다.
3. Intracardiac 접종
- 4~6주 세 여성 (Foxn 뉴 - / - : 할렌)도 될 수있는 다른 면역 - 손상된 생쥐 (- - RAG2 - / SCID, XID, 등 RAG1-/)이 있지만 마우스가이 실험에 사용되는 인간의 암 세포 실험에 사용.
- 분사 절차에서 사망률을 감소, 및 이미징 절차에 배경 형광을 줄이기 위해 주입 전에 누드 마우스는 먹이 Teklad 2920x 다이어트 5~10일해야 (음식은 알팔파 무료이기 때문에).
- 뉴 / 뉴 이외의 다른 마우스를 사용하는 경우, 복부 복부 AR에 면도기 나 Nair을 (우리의 경험 Nair 더 효과적)를 사용하여 머리를 제거절차를 시작하기 전에 EA.
- 또는 다른 선호 마취 (우리의 경험에서 isoflurane은 intracardiac 예방 접종에 대한 용납 최고) : isoflurane vaporizer (2-3 L / 분 O 2 2.5 % ISO)를 사용하여 격리 챔버에 마우스를 마취.
- 스테인레스 스틸 통풍 후드 내부의 마취 기계의 코 콘에 한 번에 하나의 마우스를 이동합니다.
- 가슴가 직면와의 뒷면에 각 마우스를 배치합니다.
- 2 번을 반복, 70 % 에탄올에 이어 10 % povidone / 요오드 면봉 / 솔루션 가슴을 씻는다.
- 분사에 대한 마크 마우스의 가슴 (멸균 마커를 사용하거나 주사 사이트 무균 유지 측면에 약간 표시). 우리는 가슴의 마크 위치 흉골 노치와 xyphoid 과정의 상단 중간, 그리고 약간 왼쪽 (해부학)을 사용합니다. 300 μl 28g ½ 인슐린 주사기의 플런저와 초승달 모양 사이의 공간을 (심장 펄스를 보는 것이 중요)을 만들 주사기에 공기의 작은 거품을 그릴, 그리고세포의 100 μl를 그린다.
- 수직 바늘세요. 다른 손으로 긴장 마우스의 피부를 누른 상태에서 바늘을 삽입합니다.
- 왼쪽 심장 심실에 성공 삽입 주사기에 혈액의 독특한 밝은 빨간색 펄스가 발생해야합니다. 이 깊이에서주의 깊게 가슴에 고인에 가슴이나 흘리고 세포를 펑 쳐링 피하기 위해 바늘의 뚜렷한 움직임없이 주사기의 플런저 (100 μl 볼륨을) 꺾다.
- 세포 주입 후, 가슴에 고인에 세포의 물이 뚝뚝 떨어지는 감소 부정적인 압력의 적은 양을 만들 수 플런저를 약간 올려.
- 심장의 안감을 찢어과 출혈을 일으킬 수 제거, 동안 기울이기 바늘을 사용하지 않아야하면서 곧바로 가슴 바늘을 당겨.
- 출혈을 줄이기 위해 주사 사이트를 통해 가슴에 부드러운 압력을 적용합니다.
- 코 콘에서 마우스를 제거하고 약 1 분을위한 빛 압력을 적용하고 있습니다.
- 완전 사기꾼까지 가열 패드로 마우스를 이동scious.
- 마우스가 스핀 또는 복구 후 경련하기 시작하면, 원인은 색전증이다. 혈관 저항을 감소하는 반면 혈액 흐름과 심장 출력을 높이기 위해 케타민의 80-120 밀리그램 / kg으로 intraperitonally 마우스를 주입. 이 마우스가 응고를 통과하는 데 도움이됩니다. 이 문제가 발생하면이 세포 거리며 걷게을 나타냅니다로는, 세포 준비를 변경하는 것이 가장 좋습니다. 우리는 약 8 쥐 한 후 셀 준비를 변경하거나 30 분.
4. Intratibial
- Buprenex (0.1 밀리그램 / kg) 또는 즉시 절차를하기 전에 유사한 승인 진통제와 마우스를 주입.
- isoflurane 사용 마우스를 마취 한 다음 코 콘으로 이동 마취를 유지합니다.
- 10 % povidone / 요오드와 다리를 청소 면봉 / 솔루션, 2 번 반복, 에탄올이 나타납니다. 이전 모피 존재한다면 청소 털을 뽑다 다리 (Nair 또는 이와 유사한 제품과).
- 부드럽게 측면 malleolus, 중간 malleolus, 그리고 집게 손가락과 일이있는 경골의 아래쪽 절반을 파악umb 다음 굽힘 다리 (무릎이 표시 및 액세스 것과 같은 굴곡과 측면 회전의 조합.
- 독특한, 두꺼운 흰색 줄에 표시됩니다 patellar 인대를, 하부의 가시성을 높이기 위해 70 % EtOH로 피부를 축축하고. 단단히 28g 마우스 삽입 ½ 바늘 슬개골 아래 patellar 인대의 중간을 통해의 발목 / 다리를 쥐었고, 그리고 경골의 상단에있는 앞 intercondylar 지역에 있지만.
- 경골에 바늘을 삽입 할 때 약간의 시추 작업과 꾸준한, 회사 압력을 사용하여 성장 판을 통해 신중 안내.
- 정강 성장 플레이트의 침투 후, 바늘이 현저히 적은 저항을 발생합니다.
- 바늘은 경골과 성장 판을 통해을 보장하기 위해 바늘의 부드러운, 측면 운동을 사용합니다. 바늘은 경골 내에서 적절한 위치에있는 경우 이동이 제한됩니다.
- 천천히 셀 솔루션 10 μl를 주입하는 플런저를 우울하게. 더 저항 리틀는이 시점에서 생각해야합니다.
- SLOwly 바늘의 압축을 풉니 다.
- 동일한 절차 후, PBS의 10 μl를 삽입 옆 다리로 진행합니다.
- 마취에서 마우스를 제거하고 회복 될 때까지 가열 패드 계속.
- 24 시간 동안 마우스를 모니터링하고 동물이 고통의 흔적을 보여 계속하면 추가 Buprenex으로 매 12 시간을 투입.
5. 이미징 시간 코스
- 루시 페라 제 이미징 : 해당, 루시 페라 영상이 칠일에 후 종양 세포 접종 (대부분의 뼈 전이 모델에서하지만, 가까운 일 14 감지)부터 활용해야 곳. 마우스는 150 밀리그램 / kg luciferin, anesthetized과 intraperitoneally을 주입하고, IVIS 장비 8을 사용 주입 후 8 분 몇 군데 있습니다.
- GFP 이미지 : 일반적으로 GFP-표현 종양 마에스트로 영상 장비 (CRi) 9를 사용 intracardiac 실험에 대한 intratibial 주사하고 16-21에 대해 하루에 10-14 주위에 감지 할 시작합니다. 간단히, 쥐 isoflurane과 anesthetized 아르 (3 %)과 마에스트로 이미징 챔버에서 코 콘을 통해 마취하에 유지. 우리 eGFP - 표현 세포의 경우 우리는 10 nm의 단계 500 밀리 초 노출에서 파란색 필터 세트를 (eGFP를위한 498 excitation/515 방출)을 사용합니다.
- Faxitron (X-레이) : X-선은 주간 14 일 7 사이에 시작 이동합니다. 병변은 일 21시 intracardiac 모델에 볼 수 있으며 일주일 만 일찍 intratibial 주사 3 것입니다. 예를 생체 및 생체에서의 방사선 투과 데이터가 노출 8 초 동안 35 KV에서 Faxitron LX-60을 사용하여 획득 한 것입니다.
- 기타 이미징 : 이미징 modalities는 완전히 특정 연구를 기반으로합니다. 위의 방법 외에도 3D 마이크로 계산 된 단층 촬영 (μCT), 마이크로 양전자 방출 단층 촬영 (μPET) 및 기타 modalities 10,11에 따라 실제 동물 영상 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다.
6. 마우스 희생
- 각 모델은 약간 다른 시간 코스가 있습니다. MDA-MB-231 셀 마우스는 보통 21 35 일 이내 일 28 주변 (IT는 21-28일 사이 쥐를 주입) 사이에 cachectic 또는 하반신 마비 환자가된다.
- 한 번에 여러 쥐 대뇌 피질의 뼈를 부러 하반신 마비 환자가, 또는 몸무게의 10~20% 사이에 자궁 경부 전위 (또는 다른 IACUC 승인 방법)과 xylazine / 케타민 과다 복용을 사용하여 연구의 모든 쥐를 희생 잃게하기 시작 병변을 개발할 수 있습니다.
- 버퍼 4% 포르말린에 진학하여 저장에 필요한 뼈를 제거합니다.
- 가슴 종양이있는 쥐들이 놓친 주사의 징조이며, 연구 대상에서 제외됩니다.
7. 예를 생체 분석
- μCT : 70 % EtOH로 검색 같은 뼈 표본에서 측정 할 구조 및 조직 학적 매개 변수를 할 수 있습니다.
- 윤곽과 개별 실험 설계 및 제공 장비 (10)에 따라 분석 할 수 있습니다. 우리의 데이터는 12 μM 해상도를 사용하여 Scanco μCT 40 얻은 것입니다.
- Histomorphometry : 원하는 조직 학적 방법을 사용하여 프로세스 표본 및 Hematoxylin / Eosin 7 얼룩
8. 대표 결과
종양 세포의 intracardiac 또는 intratibial 접종 (그림 1)에 따라 마우스가 이크 스 선 촬영법 및 형광 (또는 발광)에 의해 매주 모니터링됩니다. 그들은 모델 (그림 2)에 따라, 2 주간 초부터 형광 및 발광에 의해 표시 될 수 있습니다 동안 병변은 보통, 주 2, 3 사이에 X 선에 의해 명백하게된다. 병변은 뼈의 어두운 구멍으로 볼 수 있습니다, 시간 (그림 3)를 강조된다. 병변은 radiographs의 Metamorph 분석을 사용하여 정량되었고 형광은 마에스트로 (CRi) 영상 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하여 정량되었다. 병변 성장하기 시작하면, 쥐 자주 cachectic된다. 쥐가 자신의 초기 몸무게의 10~20% 사이에 분실했을 때 희생이 필요합니다. 의 상태 마우스는 빠르게 변경할 수 있으며 하루 동안 여러 번 모니터링해야합니다. 3-4주 사이에 마우스 하나 또는 두 다리를 모두 드래그하기 시작하고 전체 연구가 희생되었다. 이미지는 희생 전에 촬영 된 것입니다. 마취 과다 복용하면 혈액은 뼈 매출 또는 기타 요인에 마커를 측정하기 위해 수집되었습니다. 자궁 경부 전위 후, 피부 excised 마우스와 뼈에서 제거되었으며, 최소 7 일 이전에 생체 이미징 기술에 비해 종양 foci의 시각화를 허용합니다 예 생체 이미징 (그림 3)에 대한 청소. 일단 영상이 완성 된 뼈는 표시 카세트에 배치하고 고정 및 추가 조직 학적 처리 또는 μCT 분석을위한 포르말린에 저장되었습니다. μCT는 뼈 파괴의 양 (그림 4) 수량화하기 위해 경골에서 수행 된 후 조직 형태 측정은 종양 부담과 BV / TV을 표시하는 샘플에 수행되었다.
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1 그림. 분사의 적절한 배치. 복부 radiographical보기 (A) 4 회 갈비 공간과 intracardiac의 접종에 대한 좌심실에 바늘의 적절한 배치를 보여주는 성인 마우스 가슴의. 해부학 적 랜드 마크 흉골 (흰색에 명시된)에서 수평 점선으로 표시됩니다. 마우스의 피부에 흉골 노치와 xyphoid 과정은 랜드 마크 역할을하고, 바늘은 가슴의 왼쪽 약간 삽입됩니다. 복부 radiographical보기 (B) condyles 사이에 정렬, 근위 경골에 바늘의 적절한 배치를 보여주는 성인 마우스 다리. 측면 관점에서 바늘의 끝은 정강 tuberosity와 epiphyseal 플레이트에 깊은 뒤에 배치됩니다. 분사에 대한 이상적인 위치는 흰색 원으로 표시됩니다.
그림 2. 뼈 전이 모델의 시간 코스입니다. CA의 진행ncer 유도 뼈 질환은 X-레이와 GFP가 표시 + 종양의 형광 이미지를 intratibial 주사 (A)와 intracardiac 주사 (B)에서 생체 인치
그림 3. . MDA-MB-231의 intracardiac 주입 후 일 0, 14, 21, 28에서 GFP 형광을 보여주는 예 생체 이미지 : intracardiac MDA-MB-231 모델 상위 행의 시간 코스입니다. 일 14 종양 foci는 부드러운 조직 제거 후 예 생체에서만 볼 수 있다고합니다. 아래 행 : osteolytic 뼈 병변을 도시 같은 femora의 예를 생체 방사선 투과 이미지. 뼈 파괴 3 주 심장 주입이 끝날 때까지 일반적으로 표시되지 않습니다.
4 그림. tibi의 마에스트로 이미징 전 생체의 시각화 등의 뼈 전이성 진행. GFP의 정량화는 + 종양비 종양 베어링 마우스 (A) 그리고 4 주 MDA-MB-231 subclone (B)를 표현 GFP의 intracardiac 주입 후 마우스 AE. 종양 foci가 Faxitron (D)에 의해 그림과 같이 뼈 파괴의 분야와 연관 종양 (C)없이 뼈를 비교했다. microCT 측정의 뼈 구조와 미네랄 데이터는 건강한 뼈 (E)와 종양 베어링 뼈 (F) 뼈 파괴의 영역을 무효 영역으로 표시됩니다의 3D 이미지로 렌더링됩니다. 또한 뼈와 종양 세부는 해당 H & E 스테인드 조직 학적 부분 (G & H)에서 볼 수있다.
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Discussion
종양 유발 뼈 질환의 연구 가장 일반적으로 사용되는 두 intracardiac 및 intratibial 예방 접종되어있는 여러 동물 모델에 의존하고 있습니다. 대부분의 경우 intracardiac이 뼈에 전이를 공부를위한 최선의 방법입니다, 그러나, 전체 전이성 과정을 의미하지 않으며, 따라서 유방 지방 패드 나 다른 orthotopic 주사가 이상적으로 그 끝으로 사용해야합니다. 종양 세포는 인간의 세포를 사용하여 대부분의 연구의 기본 사이트에서 쉽게 metastasize하지 않으며,이 경우 사람들은 주로 폐에 metastasize. 4T1 세포의 일부 변종은 뼈 5,6에 metastasize되지만, 병변이 정할 더 어렵습니다, 작은 있으며, 세포가 아니라 인간보다 손쥐 있습니다. 또한 GFP 표현은 4T1 클론이 자주 장기 전이 연구 12을 복잡하게 할 수 사용되는 면역 능력이 모델에서 면역 반응을 유도 할 수 있습니다. 종양 유발 뼈 질환의 다른 모델은 골수종과 같은 꼬리 정맥 inj을 활용ections 13. 그러나,이 방법은 고체 종양 전이 연구에 대해 작동하지 않습니다는 폐에 씨앗 종양을 쥐가 뼈 metastases을 개발하기 전에 폐 질환으로 죽는 원인이 압도적됩니다 있습니다. Intratibial 주사는이 전이의 모델을 나타내는 것이 아니라 설립 전이성 뼈 질병의 진행하지 않기 때문에 일반적으로 덜 우호적 다른 방법보다 볼하고 있으며, 사출 사이트에서 염증을 일으킬 수 있습니다. 그럼에도 불구하고,이 절차의 최종 단계 암 유발 뼈 질환에 직접적인 효과를 초기 전이성 단계와 설립을 분리하는 데 유용합니다. 또한, 많은 전립선 종양 모델의 경우는 뼈 4 일관 종양의 성장을 허용하는 유일한 방법이다.
모니터링 뼈 질환 기술의 선택은 중요하고 접종의 경로로 연구에 따라 달라집니다. 우리 그룹에서 우리는 t, 연구에 따라 다양한 기술을 활용그 중 가장 일반적인 그는 X 선, 형광 및 조직학 있습니다. 많은 그룹 루시 페라 영상으로 전환하고 있지만, 우리는 우리가 루시 페라-transfected 세포와 우리는 형광 이미징 및 X-레이와 쉽게 공동 현지화에 더 해부학을 상세하게 그 적은 뼈 metastases을 것으로 나타났습니다. 또한, modalities 사이의 직접 비교는 뼈의 조기 발견을위한 루시 페라 제 이미지에 상당한 이점을 얻을 수 없습니다. 그러나, 이러한 실험을 수행 할 각 그룹은 연구 각 접근 방식의 유틸리티를 평가해야합니다.
또한,하지만 다른 많은 모델에 활용, 자세한 예를 생체 분석 기술은 뼈와 관련이 있습니다. 우리는 일반적으로 μCT에 의해 뼈 손실을 분석 할 수 있습니다. 정상적인 뼈를 분석 연구와 비슷하게 수행하지만, 종양 - 베어링 뼈의 분석은 마커로 성장 플레이트의 자주 손실 또는 마비로 복잡합니다. 조직 학적 분석은 다소 종양에 nuanced 아르베어링 뼈는 비 종양 베어링 뼈와 부드러운 조직을 위해 개발 프로토콜에 비해. 이 프로토콜에서 우리는 가장 일반적으로 우리의 그룹에 의해 활용 사람들에게 초점을 유지하기 위해 전 생체 분석의 설명을 제한하고 있습니다. 생체 분석에서와 마찬가지로, 각 그룹은 접근 방식이 연구에 가장 적합한 결정해야합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
P01CA040035 (FE / JAS)과 VA 경력 개발 상 (JAS) : 저자는 다음과 자금 소스를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 human breast cancer cells | Originally ATCC-Internally cloned and selected | ||
| DMEM | GIBCO | 11885 | |
| PBS | Mediatech Inc | 21-040-CV | |
| FBS | Atlas Biological | F-0050a | |
| Trypsin | GIBCO | 15400 | |
| Faxitron | Faxitron | ||
| Maestro | CRi | ||
| μCT scanner | Scanco | ||
| Athymic Nude Mice | Harlan | Fox nu -/- | |
| Insulin Syringes (300 μl, 28.5 g) | Becton Dickinson | 309300 | |
| IVIS | Caliper | ||
| Irradiated Rodent Diet | Teklad | 2920x |
References
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