Modeller for Bone Metastase

Summary

Dyremodeller er ofte brukt til å studere kreft metastasering til beinet. I denne protokollen vil vi beskrive to vanligste metodene for svulst inokulering for bein metastasering studier og kort beskrive noen av analysene benyttes for å overvåke og kvantifisere disse modellene.

Abstract

Skjelettmetastaser er en vanlig forekomst i flere maligniteter, inkludert bryst, prostata og lunger. Gang etablert i bein, svulster er ansvarlig for betydelig sykelighet og dødelighet ^en. Således, er det et betydelig behov for å forstå de molekylære mekanismer som kontrollerer etablering, vekst og aktivitet av svulster i bein. Flere in vivo-modeller er etablert for å studere disse hendelsene og alle har spesifikke fordeler og begrensninger. Den mest brukte modellen benytter intrakardiale inokulering av kreftceller direkte inn i arteriell blodtilførsel av atymiske (naken) BalbC mus. Denne prosedyren kan brukes til mange forskjellige tumortyper (inkludert PC-3 prostatakreft, lungekreft og mus mammary fett pad svulster), men i dette manuskriptet skal vi fokusere på brystkreft modell, MDA-MB-231. I denne modellen benytter vi et svært bein-selektiv klone, opprinnelig hentet i Dr. Mundy gruppe i San Antonio ^2, som hsom siden blitt transfektert for GFP uttrykk og re-klonet av vår gruppe ^3. Dette klone er et bein metastatisk variant med en høy grad av osteotropism og svært lite metastaser til lunge, lever eller binyrene. Mens intrakardiale injeksjoner er mest brukt for studier av bein ² metastaser i enkelte tilfeller intratibial ⁴ eller mammary fett pad injeksjoner er mer hensiktsmessig. Intrakardiale injeksjoner er vanligvis utføres ved bruk humane tumorceller med mål om å overvåke senere stadier av metastaser, spesielt evnen til kreftceller til å arrestere i bein, overleve, spre seg, og etablere svulster som utvikler seg til kreft-indusert bein sykdom. Intratibial injeksjoner utføres dersom fokusere på forholdet mellom kreftceller og bein etter en svulst har spredning til bein, som korrelerer omtrent til etablert skjelettmetastaser. Ingen av disse modellene rekapitulerer tidlig trinn i metastatisk prosessen før emboli og oppføringtumorceller til sirkulasjonen. Om overvåkingen primærtumor vekst eller metastasering fra det primære området til beinet, så mammary fett pad vaksinasjoner er vanligvis foretrukket, men vil svært få tumorcellelinjer konsekvent metastaserer til bein fra den primære nettstedet, med 4T1 bein-fortrinnsrett kloner, en mus mammary karsinom, er unntaket ^5,6.

Dette manuskriptet detaljer inokulering prosedyrer og høydepunkter viktige skritt i Post inokulering analyser. Konkret omfatter det cellekultur, kreftcellelinjer inokulering prosedyrer for intrakardiale og intratibial vaksinasjoner, samt kort informasjon om ukentlig oppfølging av x-ray, fluorescens og histomorphometric analyser.

Protocol

1. Cell Vedlikehold

1. Mange bein metastatisk subkloner av MDA-MB-231 finnes som har variabel tilbøyelighet for bein kolonisering og vekst. For våre eksperimenter bruker vi en klone avledet fra GFP-merket MDA-MB-231 er utviklet ved UTHSCA ^2. Denne spesielle sub-klone vil danne synlige osteolytiske lesjoner på ca 3 uker etter vaksinasjon, med offer i 4 uker.
2. Oppretthold celler i DMEM inneholdende 10% FBS og 0,1 mg / ml penicillin-streptomycin ved 37 ° C i 5-8% CO ₂ ^7.
3. Passasje cellene ved 80-90% konfluens og re-plate på en 1:10 fortynning (dette varierer avhengig av celletype og størrelsen plate. For MDA-MB-231 celler i en T-75 Dette er omtrent 6x10 ^5), som er ca hver 72 time.
4. MDA-MB-231 celler holder et generelt fibroblastic utseende med mange pseudopodia. Eventuell avrunding er indikativ av overbefolkning eller annen uønsket stress, og bør unngås, da dettekan påvirke metastatisk potensiale in vivo.
5. Ideelt, bør cellene holdes i kultur bare kort før inokulering (vi anbefaler mindre enn 1 wk eller til du har nok celler for eksperimentet), og en ny ampulle skal tines dersom avrunding eller endringer i celle vekstrate forekomme.

2. Celleforberedelsen

1. Trypsinize celler ved 80-90% konfluens med 0,15% Trypsin / EDTA (fortynne 0,5% Gibco Trypsin EDTA 1:2 i PBS). Denne konsentrasjonen tillater rask avløsning (<2 min) og reduserer klumping av cellene.
2. Umiddelbart fjerne celler fra plate med 10 ml iskald DMEM inneholdende 10% FBS, pipette inn i 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter.
3. Gjensuspender pellet i en 50 ml konisk rør i 25 ml iskald PBS (uten Ca og Mg), og telle.
4. Sentrifuger for å re-pellet, og resuspender med 10 ⁶ celler pr ml (intrakardial) eller ved 250000 cells/10 pl (intratibial) i iskald PBS. Temture PBS er viktig å hindre klumping av celler og påfølgende emboli etter injeksjon. Cellesuspensjonen bør forbli på isen ved utføring injeksjoner og vil være levedyktige og forbli un-clumped i 30 min. Mens det nøyaktige antallet plater som kreves vil variere fra etterforsker til etterforsker, vi vanligvis bruker en T-75 for mellom 8-10 mus.

3. Intrakardiell Inokulasjon

1. 4-6 uker gammel kvinne (Foxn nu-/ -: Harlan) mus brukes for disse eksperimentene, men andre immun-kompromittert mus (RAG1-/ -, RAG2-/ -, SCID, XID, og ​​etc.) kan også være brukes med menneskelige kreftcelle eksperimenter.
2. De nakne mus skal fôres Teklad 2920x kosthold 5-10 dager før injeksjon for å redusere dødeligheten av injeksjonsprosedyren, og redusere bakgrunnsfluorescens i imaging prosedyrer (siden maten er alfalfa gratis).
3. Hvis du bruker mus enn nu / nu, fjerne hår ved barbering eller bruke Nair (i vår erfaring Nair fungerer bedre) på under magen area før du begynner prosedyren.
4. Anesthetize mus i en isolert kammer ved hjelp av en isofluran vaporizer (2,5% Iso: 2-3 L / min O ₂₎ eller andre foretrukne anestesi (i vår erfaring isofluran er best tolereres for intrakardiale vaksinasjoner).
5. Flytt en mus gangen til nesen kjegle av anestesi maskin inne et rustfritt stål ventilert hette.
6. Plasser hver mus på ryggen med brystet opp.
7. Vask brystet med en 10% povidon / jod vattpinne / løsning etterfulgt av 70% etanol, gjenta 2 ganger.
8. Mark mus bryst for injeksjon (ved hjelp av en steril markør eller merking litt til siden for å holde injeksjonsstedet sterile). Vi bruker et merke beliggenhet midt mellom sternal hakk og toppen av xyphoid prosess, og litt til venstre (anatomiske) av sternum. Tegne en liten boble av luft i sprøyten for å skape mellomrom mellom stemplet og menisken (viktig for å se kardial puls) fra et 300 ul 28 g ½ insulinsprøyte, ogutarbeide 100fil celler.
9. Hold nålen oppreist. Mens du holder huden mus stram med andre hånden stikker nålen.
10. Vellykket innsetting i venstre kardial hjertekammer bør resultere i en distinkt knallrød puls av blod i sprøyten. På denne dybden, nøye trykke stempelet av sprøyten (100 ul volum), uten vesentlig bevegelse av nålen for å unngå punktering av hjertet eller søl celler inn i brysthulen.
11. Etter cellene injiseres, trekke opp litt på stempelet for å skape en liten mengde av undertrykk for å redusere drypping av celler inn i brysthulen.
12. Trekk nålen direkte ut av brystet mens være sikker på å unngå å vippe nålen under fjerning, noe som kan rive slimhinnen i hjertet og forårsake blødninger.
13. Bruke milde press på brystet over injeksjonsstedet for å redusere blødning.
14. Fjern musen fra nesen membran og fortsett å påføre et lett trykk i ca 1 min.
15. Flytt musen til oppvarming pad til fullt conbevisst.
16. Hvis musen begynner å spinne eller nappe etter utvinning, er den sannsynlige årsaken en blodpropp. Injisere mus intraperitonally med 80-120 mg / kg ketamin for å øke blodgjennomstrømningen og blodsirkulasjon samtidig redusere vaskulær motstand. Dette skal hjelpe musa passerer blodpropp. Etter dette skjer, er det best å endre cellepreparater, som det viser at cellene er klumper. Vi endrer cellepreparater etter ca 8 mus, eller 30 min.

4. Intratibial

1. Injiserer mus med Buprenex (0,1 mg / kg) eller tilsvarende godkjent analgetisk umiddelbart før prosedyren.
2. Anesthetize mus med isofluran, og deretter flytte til nese kjegle og vedlikeholde anestesi.
3. Rent begge ben med 10% povidon / jod vattpinne / løsning, etterfulgt av etanol, gjenta 2 ganger. Fjerne håret ben (med Nair eller lignende produkt) før rengjøring hvis pels tilstede.
4. Ta forsiktig tak lateral malleolus, mediale malleolus og nedre halvdel av tibia med pekefinger og thumb, så bøy etappe (kombinasjon av fleksjon og lateral rotasjon, slik at kneet er synlig og tilgjengelig.
5. Fukt huden med 70% EtOH å øke synligheten av de underliggende patellar ligament, som bør være synlig som en distinkt, tykk, hvit linje. Mens godt tak ankel / etappe av mus innsats 28g ½ nål under patella, gjennom midten av patellar ligament, og i fremre intercondylar området i toppen av tibia.
6. Når du setter nålen inn tibia, veilede nøye gjennom vekst plate med jevn, fast trykk med liten boring handling.
7. Ved gjennomtrengning av tibial vekst plate, vil nålen støte markert mindre motstand.
8. Bruk en mild, sideveis bevegelse av nålen for å sikre nålen er i tibia og gjennom vekst plate. Bevegelsen vil være begrenset hvis nålen er i riktig sted i tibia.
9. Langsomt trykkes stempelet for å injisere 10 pl celleløsning. Liten eller ingen motstand skal kjennes på dette punktet.
10. Slowly trekke nålen.
11. Følge den samme fremgangsmåte, fortsett til neste etappe å injisere 10 pl PBS.
12. Fjern mus fra anestesi og holde på varmeputen før bedring.
13. Overvåke musene løpet av de neste 24 timer og injisere ytterligere Buprenex hver 12. time hvis dyr fortsetter å vise tegn på stress.

5. Imaging Tid Course

1. Luciferase Imaging: Hvor aktuelt, luciferase bildebehandling bør utnyttes begynner på 7 dager etter svulst celle inokulering (men i de fleste bein metastasering modeller, detekterbar nærmere dag 14). Mus injiseres intraperitonealt med 150 mg / kg luciferin, bedøvet, og avbildes 8 min etter injeksjon med IVIS utstyr ^8.
2. GFP bildebehandling: Vanligvis GFP-uttrykke svulster begynner å bli synlig rundt dag 10-14 for intratibial injeksjoner og 16-21 for intrakardiale eksperimenter med Maestro bildeutstyr (CRI) ^9. Kort, mus er bedøvet med isofluran (3%) Og vedlikeholdes under anestesi gjennom en nese kjegle i Maestro bildebehandling kammeret. For våre eGFP-uttrykke celler bruker vi den blå filter sett (498 excitation/515 utslipp for eGFP) ved 500 ms eksponering i 10 nm trinn.
3. Faxitron (X-ray): X-stråler er tatt ukentlig starter mellom dag 7-14. Lesjoner vil være synlig i intrakardiale modellen på dag 21 og en uke tidligere i intratibial injeksjoner ^3. Våre radiografiske data for ex vivo og in vivo ble kjøpt med en Faxitron LX-60 på 35 kV i 8 sekunder eksponering.
4. Andre imaging: Imaging modaliteter vil være helt basert på den spesifikke forskning. I tillegg til de ovennevnte metoder, kan levende dyr avbildning basert på 3D mikro-computertomografi (μCT), mikro-positronemisjonstomografi (μPET), og andre modaliteter ^10,11 gi verdifull informasjon.

6. Mus Sacrifice

1. Hver modell har en litt annen tid kurset. Med MDA-MB-231 celler mus blir vanligvis cachectic eller paraplegiker mellom 21 og 35 dager og vanligvis rundt dag 28 (IT injisert mus mellom 21-28 dager).
2. Når flere mus utvikler lesjoner som begynner å bryte gjennom kortikale benet, blir paraplegiker, eller miste mellom 10-20% av kroppsvekten, ofre alle mus i studien bruker ketamin / xylazin overdose med cervical forvridning (eller andre IACUC godkjent metode).
3. Fjern bein som trengs for videre studier og butikk i bufret 4% formalin.
4. Mus med brystet svulster er et tegn på en savnet injeksjon og bør utelukkes fra studien.

7. Ex Vivo analyse

1. μCT: skanning i 70% EtOH tillater for strukturelle og histologiske parametere som skal måles på den samme bein prøven.
2. Kontur og analysere i henhold til individuell eksperimentell design og tilgjengelig utstyr ^10. Våre data ble innhentet med en Scanco μCT 40 bruker 12 pM oppløsning.
3. Histomorphometry: Prosess prøver å bruke foretrukket histologiske metoder og beis med Hematoxylin / Eosin ⁷

8. Representant Resultater

Etter intrakardial eller intratibial inokulering av tumorceller (Figur 1) mus overvåkes ukentlig av radiografi og fluorescens (eller luminescens). Lesjoner normalt bli tydelig ved røntgen mellom uke 2 og 3, mens de kan være synlig ved fluorescens og luminescens så tidlig som uke 2, avhengig av modellen (figur 2). Lesjoner er synlige som mørke hull i beinet, og bli mer uttalt med tiden (figur 3). Lesjonene ble kvantifisert ved hjelp MetaMorph analyse av røntgenbilder og fluorescens ble kvantifisert ved hjelp av Maestro (SFI) bildebehandling oppkjøp og analyse programvare. Som lesjoner begynner å vokse, mus ofte blitt kakektiske. Offer er nødvendig når mus har tapt mellom 10-20% av sin opprinnelige kroppsvekt. Tilstanden til mus kan endres raskt og må overvåkes flere ganger i løpet av dagen. Mellom 3-4 uker mus begynte å dra en eller begge bakbena og hele studien ble ofret. Bildene ble tatt før ofre. Etter anestesi overdose, ble blod oppsamlet for å måle markører for benomsetningen eller andre faktorer. Etter cervikal forvridning, ble huden fjernet fra musen og bein skåret ut og renset på ex vivo avbildning (figur 3) som vil tillate visualisering av tumor foci minst 7 dager tidligere enn in vivo avbildningsteknikker. Gang bildebehandling ble fullført bein ble plassert i merket kassetter og lagres i formalin for fiksering og videre histologisk bearbeiding eller μCT analyse. Histomorphometry ble utført på prøvene for å indikere tumormengden og BV / TV etter μCT ble utført på en tibia å kvantifisere mengden ben ødeleggelse (figur 4).

/ 4260/4260fig1.jpg "/>
Figur 1. Riktig plassering av injeksjon. Ventral radiographical visning (A) av voksen mus thorax viser riktig plassering av nålen i ^4. interkostalrom og inn i venstre hjertekammer for intrakardiale inokulering. Anatomiske landemerker vises med horisontale stiplede linjer på sternum (skissert i hvitt). På musens flå sternal hakk og xyphoid prosessen tjene som landemerker, og nålen er satt inn litt til venstre for sternum. Ventrale radiographical view (B) av voksen mus etappe viser riktig plassering av nålen i proksimale tibia, justert mellom condyles. Fra en lateral perspektiv tuppen av nålen er plassert bak tibial tuberosity og dyp til epiphyseal plate. Ideell beliggenhet for injeksjon er vist med hvit sirkel.

Figur 2. Tidsforløpet av bein metastasering modeller. Progresjon av cancer-indusert bensykdom vist med røntgen og GFP + fluorescerende bilder av svulster i vivo fra intratibial injeksjoner (A) og intrakardial injeksjoner (B).

Figur 3. Tidsforløpet for intrakardial MDA-MB-231-modellen Øverste linje:. Ex vivo bilde som viser GFP fluorescens ved 0 dag, 14, 21, og 28 etter injeksjon av intrakardiale MDA-MB-231. Vær oppmerksom på at tumor foci på dag 14 er bare synlig i ex vivo etter bløtvev fjerning. Nederste rad: ex vivo radiografiske bilder av de samme lårben illustrerer osteolytiske lesjoner. Vær oppmerksom på at bein ødeleggelse er vanligvis ikke synlig før tre uker etter hjertestans injeksjon.

Figur 4. Kvantifisering av bein metastatisk progresjon. GFP + svulst som visualiseres ved Maestro avbildning ex vivo av Tibiae av en ikke-tumor bærende mus (A) og en mus 4 uker etter intrakardiale injeksjon av et GFP uttrykker MDA-MB-231 subklon (B). Tumor foci korrelerer med områder av bein ødeleggelse som vist ved Faxitron (D) sammenlignet et bein uten svulst (C). Bone strukturelle og mineral data fra microCT målinger er gjengitt som 3D bilder av en sunn ben (E) og en svulst peiling bein (F) hvor områdene bein ødeleggelse er vist som ugyldige området. Videre bein og tumor detalj er sett i tilsvarende H & E farget histologiske seksjoner (G & H).

Discussion

Studier av tumorindusert bein sykdom stole på flere dyremodeller som de to mest brukte er intrakardiale og intratibial vaksinasjoner. I mange tilfeller intrakardiell er det beste alternativet for å studere metastaser til beinet, men det gjør ikke representerer hele metastatisk prosess, og derfor mammary fett pad eller andre orthotopic injeksjoner bør ideelt brukes mot at slutten. Kreftceller ikke metastaserer lett fra det primære stedet i de fleste studier med humane celler, og hvis så, de primært metastaserer til lungene. Noen stammer av 4T1 cellene vil metastasere til ben ^5,6, men lesjonene er mindre, mer vanskelig å kvantifisere, og cellene er murine fremfor menneskelig. Tillegg kan GFP uttrykk utløse en immunrespons i immune kompetente modeller der 4T1 kloner er ofte brukt som kan komplisere langsiktige metastasering studier ^12. Andre modeller av tumorindusert bensykdom, som myelom, utnytte halevenen injections ^13. Imidlertid vil denne tilnærmingen ikke fungerer for solide tumormetastase studier som det vil overveldende frø svulstene til lungene og forårsake musene å dø av lungesykdom før utvikle skjelettmetastaser. Intratibial injeksjoner er generelt sett mindre gunstig enn de andre metodene, som det ikke representerer en modell av metastasering, men heller utviklingen av etablerte skjelettmetastaser, og kan føre til betennelse på injeksjonsstedet. Likevel er denne prosedyren nyttig å skille innledende metastatisk trinn og etablering av direkte effekter på slutten scenen kreft-indusert bein sykdom. Videre, i tilfelle av mange prostata tumormodeller, er det det eneste tilnærming som tillater for konsekvent tumorvekst i bein ^4.

Valget av teknikker for overvåkning bensykdom er så kritisk og spesifikk for studien ruten av inokulasjon. I vår gruppe benytter vi mange forskjellige teknikker avhengig av studien, than mest vanlige som er x-ray, fluorescens og histologi. Mens mange grupper har gått over til luciferase bildebehandling, har vi funnet ut at vi får færre skjelettmetastaser med luciferase-transfekterte celler og at vi får bedre anatomiske detaljer med fluorescerende bildebehandling og enklere samlokalisering med x-stråler. Videre gjorde direkte sammenligning mellom modaliteter ikke gi en betydelig fordel å luciferase bildebehandling for tidlig deteksjon i bein. Imidlertid vil hver gruppe utfører disse eksperimentene må evaluere anvendeligheten av hver tilnærming for studiene.

Tillegg, skjønt benyttet i mange andre modeller, de detaljerte ex vivo analyseteknikker er spesifikke til ben. Vi vanligvis analysere bentap ved μCT. Mens utføres på samme måte som studier analysere normale bein, er analysen av tumor-bærende bein komplisert ved hyppig tap eller avbrudd av veksten plate som en markør. Histologiske analyser er også noe nyansert i tumorBærende bein mot protokoller utviklet for ikke-tumor bærende bein og myke vev. I denne protokollen har vi begrenset beskrivelsen av ex vivo analyser for å opprettholde fokus på de vanligst benyttes av vår gruppe. Som med in vivo analyser, vil hver gruppe må finne ut hva tilnærminger fungerer best for sin studie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 human breast cancer cells	Originally ATCC-Internally cloned and selected
DMEM	GIBCO	11885
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
FBS	Atlas Biological	F-0050a
Trypsin	GIBCO	15400
Faxitron	Faxitron
Maestro	CRi
μCT scanner	Scanco
Athymic Nude Mice	Harlan	Fox nu -/-
Insulin Syringes (300 μl, 28.5 g)	Becton Dickinson	309300
IVIS	Caliper
Irradiated Rodent Diet	Teklad	2920x