Summary
En imaging teknik til overvågning af membran potentielle ændringer i sub-mikrometer rumlige og sub-millisekund tidsopløsning er beskrevet. Teknikken, baseret på laser excitation af spændingsfølsomme farvestoffer, tillader målinger af signaler i axoner og axon soeskende terminale dendritiske grene, og individuelle dendritiske spidser.
Abstract
Forståelse af de biofysiske egenskaber og funktionelle organisation af enkelte neuroner, og hvordan de behandle oplysninger er grundlæggende for at forstå, hvordan hjernen fungerer. Den primære funktion af en nervecelle er at behandle elektriske signaler, sædvanligvis fra flere kilder. Elektriske egenskaber neuronale processer er overordentlig kompleks, dynamisk, og, i det generelle tilfælde, umuligt at forudsige i fravær af detaljerede målinger. For at opnå en sådan måling ville man ideelt set gerne være i stand til at overvåge, på flere steder, subtærskel begivenhederne, som de rejser fra de steder, hvor oprindelsen på neuronale processer og summere på særlige steder at påvirke aktionspotentialets indvielse. Dette mål er ikke nået i nogen neuron grund af tekniske begrænsninger af målinger, der beskæftiger elektroder. At overvinde denne ulempe, er det meget ønskeligt at supplere patch-elektrode tilgang med billeddannelsesteknikker, der tillader omfattende parallelle recordings fra alle dele af et neuron. Her beskriver vi en sådan teknik - optisk registrering af membranpotentiale transienter med organiske spændingsfølsomme farvestoffer (V m-imaging) - kendetegnet ved sub-millisekund-og sub-mikrometer opløsning. Vores fremgangsmåde er baseret på pionerarbejde på spændingsfølsomme molekylære prober to. Mange aspekter af den oprindelige teknologi er løbende blevet forbedret gennem flere årtier 3, 5, 11. Derudover tidligere arbejde dokumenteres to væsentlige egenskaber ved V m-billeddannelse. For det første er fluorescenssignaler er lineært proportional med membranpotentialet i hele fysiologiske område (-100 mV til +100 mV, 10, 14, 16). For det andet er loading neuroner med den spændingsfølsomme farvestof anvendt her (JPW 3028) ingen påviselige farmakologiske virkninger. Den registrerede udvidelse af spyddet i løbet af farvestof loading er helt reversibel 4, 7. Derudover eksperimentelle beviser viser, at det er muligt at opnået betydeligt antal (op til hundreder) af optagelser før nogen påviselige fototoksiske effekter 4, 6, 12, 13. I øjeblikket tager vi fordel af den fremragende lysstyrke og stabiliteten af en laserlyskilde ved næsten optimal bølgelængde at maksimere følsomheden for V m-billeddannelsesteknik. Den aktuelle følsomhed tillader flere stedet optiske optagelser af V m transienter fra alle dele af en neuron, herunder axoner og axon soeskende terminale dendritiske grene, og de enkelte dendritiske Torner. Den indhentede information om signal interaktioner kan analyseres kvantitativt og visualiseres direkte i form af en film.
Protocol
1. Opsætning af udstyr
Trin 1.1. Imaging setup
Nøglen til optagelse spænding følsomme farvestof signaler er passende setup design. Vi bruger en opretstående mikroskop (BX51WI Olympus eller Zeiss AxioExaminer) udstyret med tre kameraer. Opsætningen er designet til belysning af individuelle neuroner i hjernen skiver efter excitationslys i epi-fluorescens, wide-field mikroskopi tilstand ved hjælp af enten Nikon 60X/1.0 NA eller Zeiss 63X/1.0 NA vand dyppe mål. Vores mikroskoper er boltet til en vibrationsisolering bord og forsynet med motoriserede bevægelige stadier. Hver mikroskop er udstyret med tre kameraets porte. Et kamera port har en standard høj rumlig opløsning CCD kamera til infrarød DIC video-mikroskopi (IR-1000, Dage MTI, USA). Det andet kamera port har en hurtig datafangst kamera (op til 20 kHz frame rate) med relativt lav rumlig opløsning (80 x 80 pixels), men fremragende dynamikområde (14 bit) og usædvanlig lav læststøj (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). Det tredje kamera port har et CCD-kamera med høj rumlig opløsning (PixelFly, 1392x1024 pixels, PCO AG, Tyskland), monteret på en roterende-disk konfokal skanner (CSU-10, Yokogawa, Japan), anvendes til at indsamle z-stabler af konfokale billeder for detaljeret morfologisk rekonstruktion af den farvede celle. En frekvens-fordoblet diode-pumpet Nd: YVO4 kontinuert bølge laser (400 mW) emitterer ved 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, Kina) er kilden til excitationslys. Den 2 mm diameter laserstråle styres af en skodde (LS6, Vincent Associates) angår en lysleder koblet til mikroskopet via en enkelt-port epifluorescens kondensator (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Tyskland) udviklet til at overfylde den bageste åbning i objektive og levere næsten ensartet belysning af objektplanet. Laserlyset anvendes i stedet for en konventionel Xenon Arc-lamp at maksimere følsomheden af V m-billeddannelse af: (1) anvendelse af en monokromatisk excitation lys i det røde fløj af absorptionsspektret for at maksimere V m følsomhed af farvestoffet 9, 10 og (2) at øge intensiteten af excitationslyset over det niveau, der kan opnås ved en bue-lampe. Det exciterende lys blev reflekteret til fremstillingen af et dikroisk spejl med en central bølgelængde på 560 nm og den registrerede fluorescens lys ledtes gennem et 610 nm barrierefilter (a Schott RG610). Den kombinerede virkning af en forøgelse af lysintensiteten og brugen af tæt optimale monokromatiske excitationsbølgelængder var en dramatisk forbedring i følsomhed spænding billeddannelse med en faktor på omkring 50 i forhold til tidligere målinger 6.
Trin 1.2. Juster til ensartet belysning
Brug en fluorescens slide standard (grøn excitation / rød emission). Angiv pågældende neutralfiltre i laserstrålebanen således at CCD ikke er mættet. Fokus målet på overfladen afdiaset. Justere positionen af den modtagende ende af kvarts lysleder foran laser løfteraket mål, og justere placeringen af udgangsenden af lyslederen er knyttet til mikroskopet under anvendelse af passende aktuatorer på epi-fluorescens kondensator at opnå centreret og ensartet belysning af synsfeltet.
Trin 1.3. Bestem vibrationelle støj
Placere en lille sort blæk mærke på overfladen af fluorescens slide. Optag lysintensitet med NeuroCCD i kontinuerlig optagelsestilstand. Fokus målet på en mørk kant af den sorte trykfarve mærket. Optag den lysintensitet for omkring 100 millisekunder ved 2 kHz billedfrekvens. Viser den rumlige gennemsnit af de fraktionerede lysintensitet spor (bf / F) fra -20 pixels, der modtager lys fra ensartet belyst område og fra -20 pixels langs kanten af blækmærke. Det overskydende støj i optagelser fra pixels med høj kontrast kanter afspejler den vibrationelle støj isystemet.
Trin 1.4. Vibrationsisolering
Det er obligatorisk at reducere vibrationer ved hjælp af en vibration-isolation tabel til et niveau under skud støj ved lysintensiteter kan sammenlignes med eksperimentelle optageforhold. Juster vibrationsisolering bordet indtil vibration støj i lysintensitet fra pixels, der dækker den skarpe kant af billedet er ubetydelig. Ingen af udstyret med bevægelige dele (mekaniske skodder, ventilatorer) kan monteres på bordet. Kablerne fra udstyr på tabellen til andre komponenter, der ikke er isoleret fra vibrationer, skal være løst, så de ikke overfører mekaniske vibrationer til mikroskopet.
2. Valget af et passende Neuron for V m-Imaging
Trin 2.1. Udvælgelse af neuroner
Gør hjerneskiver ifølge standardprocedurer. Brug en mus, som udtrykker EGFP i individuelle nerveceller af interest. Med en roterende skive konfokal system, visualisere EGFP mærkede neuroner i skive. Vælg neuroner for V m-billeddannelse med intakte dendritiske / axonal træer og med processer, der kører parallelt med og tæt på overfladen af skiven. Dette kan ikke ske i vildtypemus fordi axoner og tynde dendritter, for det meste, er ikke synlige i DIC mikroskopi mode.
3. Henter Neuroner med spændingsfølsomme Dye
Trin 3.1. Fyldning af patch-pipetten
Fyld glas patch pipetter fra spidsen med farvestof-fri intracellulær opløsning ved påtrykning af negativt tryk til omkring 15 s til 2/3 af elektroden konus. Farvestoffet frie opløsning i spidsen er nødvendig for at undgå spild af farve på skiven, som forøger baggrundsfluorescensen og dramatisk reducerer signal-støjforhold. Back-fylde elektroden med opløsningen indeholdende membranen impermeabel spænding følsomt farvestof JPW3028 opløsesi intracellulær opløsning (0,8 mM).
JPW3028, den mest succesfulde spænding probe til intracellulær anvendelse, er en dobbelt positivt ladet analog af ANEP række lipofile styrylfarvestoffer, der stadig er tilstrækkeligt vandopløselige til at blive anvendt til mikroinjektion. The di-ethyl-analogen af dette farvestof har praktisk talt identiske karakteristika (herunder spænding-følsomhed), og er kommercielt tilgængelig som JPW1114 (se tabel 1). Vi forbereder 20 mM stamopløsning i destilleret H 2 O. 50 ul alikvoter af stamopløsning holdes frosset ved -20 ° C. Til den endelige farvestof koncentration på 0,8 mM, 2 pl af stamopløsningen opløst i 50 pi af intracellulær opløsning på dagen for forsøget. Bestanden farvestofopløsning er stabil og kan opbevares ved stuetemperatur i adskillige måneder. Således holder vi en 50 ul portion ved stuetemperatur, indtil den er brugt op.
Trin 3,2. Etablere et giga-forsegling hurtigt
Trin 3.3. Overvåge niveauet af farvning
Under farvestof diffusion i helcelle-konfiguration, overvåge fysiologiske tilstand neuron ved at registrere evoked aktionspotentialer i den aktuelle-clamp modus. Derudover overvåge mængden af farvning ved at optage den hvilende lysintensitet (RLI) fra cellen soma med en frame rate på 2 k Hz og på en brøkdel af fuld lysintensitet justeres med neutralfiltrene (vi anvender 0,04% af laserlyset intensiteten fra en 400 mW laser). Fortsæt farvestoffet læsningen indtil aktionspotentialet begynder at udvide, sædvanligvis efter 20-40 minutter, afhængigt af elektroden størrelse og modstand.
Udvidelsen af piggen er fuldstændig reversibel og mest sandsynligt på grund af kapacitiv belastning virkning af den mættede koncentration af farvestoffet i det somatiske membranen. Bølgeformen af spyddet helt er vendt tilbage efter den farvestofkoncentrationen ækvilibreres hele neuron.
Trin 3.4. Fjern farvestoffet elektrode
Ved slutningen af farvning periode, trækkes forsigtigt patch-pipetten væk fra soma i spænding clamp konfiguration sikrer, at overgangen fra hel-celle til uden-out patch konfiguration opnås ved fremgangsmåden.
Trin 3.5. Vente dye diffusion
ent "> inkuberes udsnittet i yderligere 1,5-2 timer ved stuetemperatur for at give mulighed for spændingsfølsomme farvestof spredes i neuronale processer. Efter en signifikant mængde farvestof diffunderer væk fra soma til dendritiske og axonale processer, bølgeformen af AP er fuldstændig restaureret.4. Optisk recording
Trin 4.1. Vælg et cellulært rum til billeddannelse
Lokalisere soma af den farvede neuron under lavt lysniveau fluorescens og re-patch neuronet med en standard (ingen farve) patch-elektrode under DIC. Visualiser neuronale processer under lavt lys niveau på en frame rate på 10-40 Hz i kontinuerlig optagelsestilstand af CCD for spændings-billeddannelse. Reducer lysniveauet med neutralfiltre til det minimum, der kræves for at visualisere genstand for interesse. Vi anvender 0,01% af 400 mW laser intensitet under positionering af farvede neuron. Ved hjælp af en XY-scene, den neuronale proces af interesse i T-positionHan midten af det billeddannende område. Beskyt soma fra det exciterende lys ved hjælp af delvist lukkede felt stopper iris af mikroskopet. Afskærmning af soma fra høj intensitet excitationslys vil reducere den fotodynamiske skade under optagelsen.
Trin 4.2 Record optiske signaler relateret til membranpotentiale transienter
Optag optiske signaler relateret til backpropagated AP'er i de enkelte dendritiske filialer. Optag optiske signaler relateret til APs i Axon. Optag optiske signaler relateret til backpropagating AP'er i dendritiske Torner. Brug frame rates egnede til nøjagtig rekonstruktion af signalbølgeform og holde optagelsestidspunkter og eksponering for høj intensitet excitationslys så korte som muligt for at minimere farvestof blegning og fotodynamisk skader. Eksempelvis kræver undersøgelse af sekvensen af initiering og propagering af enkelte aktionspotentialer i Axon optagelse perioder på 5-10 msek. Excitationslyset intensity under optagelse er et kompromis mellem signal-støjforhold på den ene side og graden af farvestoffet blegning og fotodynamisk skade på den anden side. Vi bruger 100% af intensiteten af den 400 MW laser i optagelse fra lange sektioner af axoner, når et område på 300 um i diameter lyser. Når det exciterende lys fokuseres til en 30 um diameter område for dendritisk rygsøjlen billeddannelse, bruger vi 10-25% af laserlyset intensitet. Den nødvendige varighed af optagelsen er en vigtig faktor for den optimale excitationslys intensitet, kortere optagelsestidspunkter tillader højere lysintensiteter. Den optimale belysningsintensiteten bestemmes bedst empirisk for hvert præparat og måleindstillinger.
5. Dataanalyse
Trin 5.1. Ret de rå data for kendte fejl
Den analyse og visning af data blev udført under anvendelse af NeuroPlex programmet (RedShirtImaging) skrevet i IDL (ITT visuel information solutioner, Boulder, Colorado) og tilpassede Visual Basic rutiner. Under betingelserne for lave lysniveauer, bliver baggrundsfluorescens en væsentlig determinant for bf / F signalstørrelsen. De rå data blev først korrigeret for denne effekt ved at trække den gennemsnitlige baggrundsfluorescens intensitet bestemmes ud fra et ufarvet område på skive. Efterfølgende blev signalet justering software, der anvendes til at korrigere for tidsmæssig jitter i AP initiering og for eventuelle små bevægelser af præparatet i gennemsnit. I tidsdomænet, blev AP signaler tilpasses ved krydskorrelation af det elektrisk registreres APs i hvert forsøg til referencesignalet erhverves fra starten med udjævning (figur 1B). I det rumlige domæne, blev billeder på linie i to dimensioner offline ved billedet krydskorrelation at kompensere for eventuelle små tværgående bevægelser af præparatet. Den korrekte fokusering af billedet i z-dimensionen blev kontrolleret, inden den enkelte retssag; smal l justeringer var ofte nødvendige. De rumligt og tidsmæssigt overensstemmende signaler blev beregnet som vist i fig 1B. Langsomme ændringer i lysintensitet på grund af blegning af farvestoffet blev korrigeret ved at dividere dataene ved en passende dobbelt eksponentialfunktion afledt fra optagemediet forsøg, som ikke stimulering (figur 1B). Bølgeformen af AP-signalet blev rekonstrueret fra et sæt af datapunkter med cubic spline interpolation, en stykvis kontinuert kurve passerer gennem hvert datapunkt. For at bekræfte, at den spændingsfølsomme farvesignal spor membranpotentiale uden væsentlig forvrængning på millisekund tidsrum blev den elektriske AP signal fra soma i forhold til den optiske AP signal fra den tilstødende axon højen som vist i figur 3B. De to signaler oven meget nøje, gør det muligt at skud støj i optisk registrering.
les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg "/>
Figur 1. Dataanalyse (Animation). (A) Øverste panel: høj opløsning konfokal billede af en farvet neuron med axon i indspilning position. Elektrode fastgjort til soma og ekstracellulære stimulerende elektrode siden af basal dendritceller vist skematisk. Aktionspotentialer fremkaldt af ekstracellulært, synaptisk stimulering. Nederste panel: lav rumlig opløsning fluorescens billede af Axon opnået ved CCD bruges til V m imaging (B) Elektrode optagelser fra soma (sorte spor), optiske optagelser fra AIS (røde spor) og fra knudepunkt til Ranvier (grønne spor). . Top spor: rådata fra 9 forsøg, der viser tidsmæssig jitter i AP indvielse. Anden række af spor: tidsmæssigt overensstemmende signaler. Tredje række af spor: midlede signal. Fjerde række af spor: blegemiddel korrektion. Bottom spor: cubic spline interpolation med en passage af tidsmæssig udjævning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket konfokal mikroskopi skal der klart kan skelnes af intakte neuronale processer, som er tæt på overfladen af skiven og ligger i et plan i fokus. Udvælgelsen af nerveceller, der er passende for spænding billeddannelse inden spændingsfølsomme farvestof loading er kritisk. Et eksempel på konfokale billeder af L5 pyramidale neuroner, der udtrykker EGFP i en cortical skive (Crym transgene mus linie) er vist i figur 2. Axoner af individuelle neuroner er tydeligt synlige. Celler med lange intakt axoner (hvide pile) i en fokusplanet tæt på overfladen af skiven blev selekteret.
Figur 2. Udvælgelse af L5 corticale neuroner for V m-billeddannelse af AP signaler fra axonerne. Lav (venstre) og høj (højre) forstørrelse billeder af den samme skive region, 488 nm excitation ved hjælp af Yokogawaspinning disc scanner.
Den rumlige mønster af Na-kanal klynger i axon initial segment (AIS) spiller en kritisk rolle i tuning neuronale beregninger og ændringer i Na-kanal fordeling er blevet vist at mediere hidtil ukendte former af neuronal plasticitet i Axon. Dog kan immuncytokemiske data på kanal fordeling ikke direkte forudsige Spatiotemporal træk ved indsatsen potentiel indvielse, og tidligere elektrofysiologiske foranstaltninger er enten indirekte (ekstracellulært) eller mangler tilstrækkelig rumlig opløsning (intracellulært) til direkte karakterisere spike trigger zone (TZ). En kritisk metodisk forbedring i følsomheden af membranpotentialet imaging teknik beskrevet her giver mulighed for direkte bestemmelse af placering og længden af piggen TZ som defineret i funktionel henseende. Et eksempel på registrering af AP-signaler med høj rumlig og tidsmæssig opløsning er vist i fig. 3. Figur 3B illustrerer, atden tilgængelige følsomhed V m-imaging var tilstrækkelig til nøjagtig overvågning af subthreshold depolarisering forud for regenerativ AP signal. Desuden sammenligning af de optiske AP signaler fra soma / axon høj og fra et mere distalt knudepunkt Ranvier bekræftet, at APs har markant forskellige dynamik på disse to steder 8, 15, både opadgående slag og nedadgående af AP var hurtigere i knudepunktet af Ranvier. For yderligere oplysninger om Spatiotemporal opløsning grænser i målingerne af størrelse og placering af spyddet TZ se figur 3 og 5 i Popovic et al. (2011).
Figur 3. Virkningspotentialet signaler fra axon. (A) Øverste panel: høj opløsning konfokal billede af en L5 cortical neuron fyldt med den spændingsfølsomme farvestof med axon i optagelse position; projektion fron a z-stabel af konfokale billeder. Optagelse / stimulere patch elektrode fastgjort til soma. Nederste panel: lav rumlig opløsning fluorescens billede af Axon opnået ved CCD bruges til V m-billeddannelse. (B) AP relaterede signaler optaget ved en frame rate på 10 kHz. Spor på højre: AP transienter fra tre steder: 1-elektrode optagelse fra soma, 2-optisk optagelse fra axon højen, 3-optisk optagelse fra den første node Ranvier. Nederste spor: Indlagt signal fra de samme tre steder.
Den ulineære vekselvirkning mellem de excitatoriske postsynaptiske potentialer (EPSP'er) og BAPS i dendritter, der er ansvarlig for induktionen af LTP er ikke fuldt forstået. Denne interaktion afgørende grad afhængig af amplituden af begge signaler og skal derfor være rumligt uensartet. Den eksperimentelle test af denne forudsigelse kræver rumligt godt opløste målinger, som ikke er behandlet, fordi dendritiske grene af lille diameter ikke er enccessible til elektrode målinger. Membranpotentialet billeddannelsesteknik beskrevet her tillader overvågning af elektriske signaler fra flere steder i hele dendritiske arbor som vist i fig. 4. Mønsteret af BAP aktivitet i dendritiske arbor er kendetegnet ved natriumstrøm dominerede spidser i proximale regioner, som gradvist ændret til langvarig calcium strøm dominerede depolariserende begivenheder i distale dendritter.
Figur 4. Virkningspotentialet signaler fra flere steder på dendritiske akslen af en L5 cortical neuron. Venstre panel: høj opløsning billede af en L5 cortical neuron læsset med en spændingsfølsomme farvestof; fremskrivning fra et z-stak af konfokale billeder. Højre panel: en byge af 4 AP indledt ved 100 Hz ved korte depolariserende strømimpulser (nederste spor) leveret til soma. Backpropagating enKTION potentielle signaler fra seks udvalgte steder (1-6) langs de apikale og skrå dendritter. Spor 1 til 3 blev opnået fra en enkelt prøveoptagelse. Spor 4 er en fire forsøg gennemsnit, medens spor 5 og 6 er seksten forsøg gennemsnit.
Hypotesen om, at spines har en elektrisk rolle at modificere synaptisk effektivitet der ligger til grund plasticitet og muligvis læring og hukommelse mekanismer for nylig har fået stor opmærksomhed på grund af sine kritiske følger for hjernens funktion (Yuste, 2010). Der er dog meget lidt direkte eksperimentelt bevis for eller imod denne hypotese. Usikkerhederne i fortolkningen af indirekte resultater og manglen på direkte beviser om elektriske opførsel af dendritiske Torner skyldes primært et metodologisk begrænsning - spines er små og ikke tilgængelig for konventionelle metoder for elektrofysiologi. Forsøg på at undersøge dette spørgsmål i fravær af eksperimentelle data påberåbtecomputersimuleringer med estimater af elektriske parametre baseret på rygsøjlen morfologi og diffusionelle egenskaber rygsøjlen hals. Den spændingsdrevne billeddannende fremgangsmåde beskrevet her gør det muligt at overvåge aktionspotentialet signaler og synaptiske potentielle signaler ved den rumlige spredning af individuelle dendritiske spidser med høj følsomhed. Forsøgene kan nu være udformet til direkte teste grundlæggende teoretiske forudsigelser om elektriske opførsel af dendritiske Torner. Et eksempel på optiske signaler relateret til backpropagating AP'er i en individuel dendritisk ryg og dens overordnede dendrit vist i fig. 5.
Figur 5. Virkningspotentialet signaler fra en individuel dendritisk rygsøjlen. Venstre paneler: øvre mikrografer - anatomiske rekonstruktioner opnået fra en stabel af spinning-disk konfokale billeder. Lavere mikrografer - FLuorescence billeder af den samme region opnået med CCD-kameraet for V m-billeddannelse. Højre panel: Fluorescensintensitet spor, der svarer til BAP fra steder 1-3 skitseret på CCD-billeder. Tidsmæssige gennemsnit af 9 forsøg. Bottom spor: elektrode optagelser fra soma. Bemærk, at spor 3 fra et område uden en ryg har nogen påviselig signal, der angiver lavt niveau af lysspredning i de overfladiske lag af den pågældende del.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver en spændingsfølsomme farvestof optagelse metode til overvågning elektriske aktivitet i individuelle neuroner med sub-mikrometer og sub-millisekund Spatiotemporal opløsning. Laser excitation ved næsten optimal bølgelængde (med hensyn til signal størrelse) forbedret følsomhed for registrering med en faktor på ~ 50 i forhold til tidligere fremgangsmåder. Den aktuelle følsomhed gør det muligt at overvåge elektriske signaler fra alle dele af de enkelte neuroner, herunder dendritter, axoner, axon soeskende, og axon terminaler samt individuelle dendritiske Torner. Med denne følsomhed kan optagelser af membranpotentiale transienter udføres ved frame rates på op til 20 kHz. Modest signal gennemsnit (4-25 forsøg) kan let forbedre følsomheden af optagelsen udtrykt som signal-støj-forholdet med en faktor 2-5. Den største begrænsning af spændingen billeddannelse er manglen på simple kalibrering af optiske signaler fra flere steder på en absolut spænding skala. I nogle præparats dette kan løses ved at finde et membranpotentiale signal, der har en kendt amplitude på alle steder. AP signaler i axon og i nogle fuldt exciterbare dendritter 6 giver en fremragende kalibreringsstandard.
Kritiske trin i anvendelse af denne metode er:
- Minimering lysspredende virkninger ved at begrænse optagelserne til neuroner beliggende nær overfladen af akutte hjernesnit (<30 um). Dette kræves optimere udskæring fremgangsmåde til at opnå en høj procentdel af raske neuroner i det øvre lag af skiven 1.
- Optimering af mængden af klare opløsning i spidsen af elektroden til levering af farvestoffet til sikre hurtig lastning af neuroner.
- Eliminere mekaniske vibrationer af præparatet, som kan være en kilde til overskydende støj i optisk registrering.
- Anvender støjsvage kontinuerlig bølge (CW) lasere med RMS støj amplitude <0,5% som en kilde til excitation lys.
- Controlling fotodynamisk skade ved at vælge passende excitation lysintensitet i forhold til varigheden af optagelsen periode og ved at adskille på hinanden følgende optagelser af mørke perioder. Længere optagelse perioder kræver lavere lysintensiteter for at undgå fotodynamisk beskadigelse.
De skrivbare ovenstående eksempler viser et vendepunkt i ryggen og Axon fysiologi. Disse optagelser afslører den bemærkelsesværdige kraft af at være i stand til at optage direkte elektriske begivenheder, som kun kunne analyseres på teoretisk grundlag i fortiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dejan Zecevic erklærer, at han er medejer af RedShirtImaging LLC., Et firma med speciale i high-speed, lavt støjniveau CCD-kameraer, der anvendes i spændingsfølsomme farvestof optagelse. Alle andre forfattere rapporterer ingen finansielle interesser eller potentielle interessekonflikter i forbindelse med den aktuelle undersøgelse.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for vores samarbejdspartnere Knut Holthoff, Arthur Konnerth og Marco Canepari som deltog i den indledende udvikling af denne teknik samt Leslie M. Loew for venligt at give farvestoffer. Støttet af NSF tilskud IOS-0817969, NIH tilskud NS068407 og M136043 og Kavli Institute for Neuroscience ved Yale University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss Axi–xaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).
- Cohen, L. B. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -Y., Cohen, L. B. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. Mason, W. T. , Academic. New York. 389-404 (1993).
- Yuste, R. Dendritic Spines. , MIT Press. (2010).
