Summary
Ein bildgebendes Verfahren zur Überwachung des Membranpotentials Änderungen mit sub-Mikrometer-räumlichen und Sub-Millisekunden zeitlicher Auflösung beschrieben. Die Technik, auf Laseranregung von Spannungs-sensitiven Farbstoffen, ermöglicht Messungen von Signalen in Axonen und Axon Kollateralen, Terminal dendritische Äste, und einzelne dendritischen Dornen.
Abstract
Das Verständnis der biophysikalischen Eigenschaften und funktionelle Organisation der einzelnen Neuronen und wie sie Informationen verarbeiten ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis, wie das Gehirn funktioniert. Die primäre Funktion einer beliebigen Nervenzelle ist, um elektrische Signale, in der Regel von verschiedenen Quellen verarbeiten. Elektrische Eigenschaften neuronaler Prozesse sind außerordentlich komplex, dynamisch und in der allgemeinen Fall unmöglich, in Abwesenheit von detaillierte Messungen vorauszusagen. Um eine solche Messung würde man erhalten, idealerweise gerne in der Lage zu überwachen, an mehreren Standorten, unterschwelligen Ereignisse, wie sie von den Websites der Herkunft auf die neuronale Prozesse und summieren an bestimmten Orten zu Aktionspotential Einleitung beeinflussen reisen. Dieses Ziel wurde in keiner Neuronen aufgrund technischer Einschränkungen von Messungen, die Elektroden beschäftigen erreicht worden. Um diesen Nachteil zu überwinden, ist es höchst wünschenswert, um den Patch-Elektrode Ansatz mit bildgebenden Verfahren, die umfangreiche parallel recordin ermöglichen ergänzengs von allen Teilen eines Neurons. Hier beschreiben wir eine solche Technik - optische Aufzeichnung des Membranpotentials Transienten mit organischen spannungsabhängigen Farbstoffen (V m-imaging) - gekennzeichnet durch Sub-Millisekunden-und Sub-Mikrometer-Auflösung. Unsere Methode basiert auf bahnbrechenden Arbeiten zur Spannungs-sensitive molekulare Sonden 2 basiert. Viele Aspekte der anfänglichen Technologie wurden kontinuierlich über mehrere Jahrzehnte 3, 5, 11 verbessert. Zusätzlich früheren Arbeiten zwei wesentliche Merkmale von V m-imaging dokumentiert. Erstens sind Fluoreszenzsignale linear proportional zu Membranpotentials über den gesamten physiologischen Bereich (-100 mV bis +100 mV, 10, 14, 16). Zweitens, Be-Neuronen mit der Spannung-empfindlichen Farbstoff welche hier (JPW 3028) nicht nachweisbare pharmakologische Wirkungen. Die aufgezeichneten Verbreiterung der Spitze während der Farbstoff Laden ist vollständig reversibel 4, 7. Zusätzlich zeigt experimentelle Hinweise, dass es möglich ist, zu erhalteneine beträchtliche Anzahl (bis zu hundert) von Aufnahmen vor nachweisbare phototoxische Effekte 4, 6, 12, 13. Derzeit nutzen wir die hervorragende Helligkeit und Stabilität einer Laserlichtquelle bei nahezu optimale Wellenlänge, um die Empfindlichkeit des V m-Bildgebungstechnik zu maximieren. Die aktuelle Sensitivität ermöglicht mehreren Standorten optische Aufnahmen von V m Transienten aus allen Teilen eines Neurons, einschließlich Axonen und Axon Sicherheiten, Terminal dendritischen Zweigen, und einzelne dendritische Dornen. Die erfassten Informationen zu Signals Wechselwirkungen kann quantitativ als auch direkt visualisiert in Form eines Films analysiert werden.
Protocol
Ein. Aufstellbedingungen
Schritt 1.1. Imaging Setup
Der Schlüssel zur Aufzeichnung Spannung Farbstoff Signale entsprechende Setup-Design. Wir verwenden eine aufrechte Mikroskop (BX51WI Olympus oder Zeiss AxioExaminer) mit drei Kameras ausgestattet. Das Setup wird für die Beleuchtung von einzelnen Neuronen in Hirnschnitten von Anregungslicht in Auflicht-Fluoreszenz, Weitfeldmikroskopie-Modus entweder mit Nikon 60X/1.0 NA oder Zeiss 63X/1.0 NA Wasser Eintauchen Ziele entwickelt. Unsere Mikroskope sind eine Schwingungsisolierung Tisch verschraubt und mit motorisierten beweglichen Stufen. Jedes Mikroskop ist mit drei Kamera-Anschlüssen ausgestattet. Eine Kamera Port verfügt über eine Standard-hohe räumliche Auflösung CCD-Kamera für die Infrarot DIC Video-Mikroskopie (IR-1000, Dage MTI, USA). Die zweite Kamera Port verfügt über eine schnelle Datenerfassung Kamera (bis zu 20 kHz Bildrate) mit relativ geringer räumlicher Auflösung (80 x 80 Pixel), sondern herausragende Dynamik (14 Bit) und außergewöhnlich niedrigen lesenRauschen (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). Die dritte Kamera Port verfügt über eine CCD-Kamera mit hoher Ortsauflösung (pixelfly, 1392x1024 Pixel, PCO AG, Deutschland) auf einem Spinning-Disc konfokalen Scanner (CSU-10, Yokogawa, Japan) verwendet werden, um z-Stacks konfokaler Bilder für sammeln montiert detaillierte morphologische Rekonstruktion des gefärbte Zelle. Ein frequenzverdoppelter diodengepumpten Nd: YVO4 Dauerstrichlaser (400 mW) Emission bei 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, China) ist die Quelle des Anregungslichts. Das 2 mm Durchmesser Laserstrahls gated durch einen Verschluss (LS6; Vincent Associates) mit einem Lichtleiter, der mit dem Mikroskop über einen Single-Port Epifluoreszenz Kondensator (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Deutschland) entwickelt, um die hintere Öffnung des überfüllen gerichtet Ziel und sorgen für eine nahezu gleichmäßige Beleuchtung der Objektebene. Das Laserlicht wird an Stelle eines herkömmlichen Xenon-Bogenlampe, die Empfindlichkeit der V m-Bildgebung durch Maximierung verwendet: (1) unter Verwendung eines monochromatischen exEntgegenhaltung Licht am roten Flügel des Absorptionsspektrums zu V m Empfindlichkeit des Farbstoffes 9, 10 und (2) Erhöhung der Intensität des Anregungslichtes hinter der Ebene, die durch eine Bogenlampe erreicht werden kann maximieren. Das Anregungslicht war der Vorbereitung durch einen dichroitischen Spiegel mit einer zentralen Wellenlänge von 560 nm und die aufgezeichneten Fluoreszenzlicht wurde durch ein 610 nm-Sperrfilter (a Schott RG610) geleitet reflektiert. Die kombinierte Wirkung einer Erhöhung der Lichtintensität und der Verwendung von nahezu optimalen monochromatischen Anregungswellenlängen eine dramatische Verbesserung der Empfindlichkeit von Spannung Bildgebung durch einen Faktor von ungefähr 50 gegenüber vorherigen Messungen 6.
Schritt 1,2. Stellen Sie für eine gleichmäßige Ausleuchtung
Verwenden Sie ein Fluoreszenz-Dia-Standard (Grünanregung / rote Emission). Setzen geeigneter Neutralfilter im Laserstrahlengang so dass die CCD nicht gesättigt ist. Konzentrieren Sie sich das Ziel auf der Oberflächeder Schieber. Die Position des empfangenden Ende des Quarz-Lichtleiter vor dem Laser Trägerrakete Ziel, und die Position des Ausgangsendes des Lichtleiters an dem Mikroskop unter Verwendung geeigneter Stellglieder auf der Epi-Fluoreszenz Kondensator zu erreichen zentrierte und gleichmäßige Ausleuchtung des Sichtfeldes.
Schritt 1,3. Bestimmen Vibrationsgeräusche
Legen Sie eine kleine schwarze Tinte Markierung auf der Oberfläche der Fluoreszenz Folie. Rekord Lichtintensität mit NeuroCCD im kontinuierlichen Aufnahmemodus. Konzentrieren Sie sich das Ziel auf einem dunklen Rand der schwarzen Tinte Marke. Aufzeichnung der Lichtintensität für etwa 100 ms bei 2 kHz Bildrate. Anzeigen des räumlichen Durchschnitt der fraktionierten Lichtintensität Spuren (AF / F) von ~ 20 Pixel Empfangen von Licht von dem gleichförmig beleuchteten Bereich und von ~ 20 Pixel entlang der Kante der Tintenmarkierung. Der Überschuss Rauschen in Aufnahmen von Pixel mit hohem Kontrast Kanten spiegelt die Vibrationsgeräusche indas System.
Schritt 1,4. Schwingungsisolierung
Es ist zwingend erforderlich, um Schwingungen mittels eines vibrationsfreien Isolierungstafel auf ein Niveau unterhalb der Schrotrauschen auf Lichtintensitäten vergleichbar experimentellen Aufnahmebedingungen reduzieren. Einstellen der Schwingungsisolierung Tabelle, bis die Vibrationsgeräusche in der Lichtintensität von Pixeln für den scharfen Rand des Bildes ist vernachlässigbar. Keines der Geräte mit beweglichen Teilen (mechanische Shutter, Lüfter) kann auf dem Tisch montiert werden. Die Kabel von der Ausrüstung auf dem Tisch befestigt zu anderen Bauteilen, die nicht vom Vibrationen isoliert sind, müssen so lose sein, dass sie nicht übertragen mechanische Schwingungen auf das Mikroskop.
2. Die Auswahl eines geeigneten Neuron für V m-Imaging
Schritt 2.1. Auswahl von Neuronen
Machen Hirnschnitten nach Standardverfahren. Verwenden Sie eine Maus exprimiert, EGFP in einzelnen Nervenzellen interest. Mit einer drehenden Scheibe konfokale System, visualisieren EGFP markierten Neuronen in der Schicht. Wählen Neuronen für V m-Bildgebung mit intakten dendritische / axonalen Bäumen und mit Prozessen, die parallel und nahe an der Oberfläche der Scheibe. Dies kann nicht in Wildtyp-Mäusen erreicht werden, da Axonen und Dendriten dünne, zum größten Teil nicht sichtbar sind DIC Mikroskopie Modus.
3. Lädt Neuronen mit Spannung Farbstoff
Schritt 3.1. Füllen des Patchpipette
Füllen Glas Patch-Pipetten von der Spitze mit wasserlöslichen freien intrazellulären Lösung durch Anlegen von negativem Druck für etwa 15 s bis zu 2/3 der Elektrode verjüngt. Der Farbstoff freie Lösung in der Spitze ist notwendig, um den Austritt von Farbstoff auf der Scheibe, die die Hintergrund-Fluoreszenz erhöht und reduziert Signal-Rausch-Verhältnis zu verhindern. Back-füllen die Elektrode mit der Lösung, die die Membran durchdringen kann spannungsempfindlichen Farbstoff gelöst JPW3028der intrazellulären Lösung (0,8 mM).
JPW3028, das erfolgreichste Spannungssonde für intrazelluläre Anwendung ist ein zweifach positiv geladene Analogon des ANEP Serie lipophiler Styrylfarbstoffen, die noch ausreichend wasserlöslich, um für die Mikroinjektion verwendet werden. Die Di-Ethyl analogen dieses Farbstoffs hat praktisch identische Eigenschaften (einschließlich spannungsgesteuerten Empfindlichkeit) und ist im Handel als JPW1114 (siehe Tabelle 1). Wir bereiten 20 mM Stammlösung in destilliertem H 2 O. 50 ul Aliquots der Stammlösung werden eingefroren bei -20 ° C. Für die endgültige Farbstoffkonzentration von 0,8 mM, wurde mit 2 ul der Stammlösung in 50 ul intrazellulären Lösung auf dem Tag des Experiments gelöst. Die Aktie Farbstofflösung ist stabil und kann bei Raumtemperatur für mehrere Monate aufbewahrt werden. So halten wir ein 50 ul Aliquot bei Raumtemperatur, bis es aufgebraucht ist.
Schritt 3,2. Stellen Sie eine Giga-Dichtung schnell
Schritt 3,3. Überwachung des Standes der Färbung
Während Farbstoffdiffusion in der whole-cell-Konfiguration, Überwachung des physiologischen Zustands des Neurons durch Aufzeichnen evozierten Aktionspotentialen im Strom-Clamp-Modus. Außerdem überwachen die Menge der Färbung durch Aufzeichnen des ruhenden Lichtintensität (RLI) vom Zellsoma bei einer Bildrate von 2 k Hz und bei einem Bruchteil des vollen Lichtintensität mit Graufilter (wir verwenden 0,04% der Laserlichtintensität von einem Laser 400 mW) eingestellt. Weiterhin den Farbstoff Ladeprozesses, bis der Aktionspotential startet zu verbreitern, in der Regel nach 20 bis 40 Minuten, je nach Größe der Elektrode und Widerstand.
Die Verbreiterung des Spike ist völlig reversibel und höchstwahrscheinlich auf kapazitive Last Wirkung der gesättigten Konzentration des Farbstoffes in der somatischen Membran. Die Wellenform der Dorn vollständig wiederhergestellt, nachdem die Farbstoffkonzentration während des Neurons äquilibriert.
Schritt 3.4. Entfernen Sie den Farbstoff Elektrode
Am Ende der Färbung Zeitraum vorsichtig das Patch-Pipette entfernt vom Soma in Spannungsklammer Konfiguration sichergestellt wird, dass der Übergang von ganzen Zellen, um Outside-Out-Patch-Konfiguration in dem Verfahren erreicht wird.
Schritt 3.5. Warten Farbstoffdiffusion
ent "> inkubieren Slice für einen zusätzlichen 1,5-2 Stunden bei Raumtemperatur, um die Spannungs-sensitiven Farbstoffs in neuronalen Prozessen zu verbreiten können. Nach einer deutlichen Menge an Farbstoff diffundiert vom Soma in dendritische und axonalen Prozesse, die Wellenform Der AP ist komplett restauriert.4. Optical Recording
Schritt 4.1. Wählen Sie ein zelluläres Kompartiment für die Bildgebung
Suchen Sie die soma des gefärbten Neurons unter Schwachlicht Fluoreszenz und re-patch das Neuron mit einem Standard (kein Farbstoff) Patch-Elektrode unter DIC. Visualisieren neuronalen Prozesse unter Schwachlicht bei einer Bildrate von 10 bis 40 Hz in der kontinuierlichen Aufnahmemodus des CCD für spannungsgesteuerten Bildgebung. Reduzieren Sie die Lichtintensität mit Neutralfilter auf das erforderliche Minimum, um das Objekt von Interesse zu visualisieren. Wir nutzen 0,01% der 400 mW Laser-Intensität während der Positionierung des gefärbten Neurons. Mit einem XY-Tisch, positionieren Sie den neuronalen Prozess der Zinsen in ter Mitte der Bildfläche. Schutz der Soma vom Anregungslicht mit dem teilweise geschlossenen Feldblende Iris des Mikroskops. Abschirmung der Soma aus hoher Intensität Anregungslicht wird deutlich verringern die photodynamische Schäden während der Aufnahme.
Schritt 4,2 Rekord optische Signale in Bezug auf Membranpotential Transienten
Notieren optischer Signale in Bezug auf backpropagated APs in einzelnen dendritischen Verzweigungen. Notieren optischer Signale in Bezug auf APs im Axon. Notieren optischer Signale in Bezug auf backpropagating APs in dendritischen Dornen. Verwenden Bildraten angemessen genaue Rekonstruktion des Signalverlaufs und halten die Aufzeichnungsperioden und Einwirkung hoher Intensität Anregungslicht so kurz wie möglich zu Farbbleichung und photodynamische Schaden zu minimieren. Zum Beispiel prüft der Sequenz von Bildung und Ausbreitung von einzelnen Aktionspotentiale im Axon erfordert Aufzeichnen Perioden von 5-10 msec. Das Anregungslicht intensiviertty während der Aufnahme ist ein Kompromiss zwischen der Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf der einen Seite und dem Grad der Farbbleichung und photodynamische Schäden auf der anderen Seite. Wir verwenden 100% der Intensität des 400 mW Laser Aufnahme von langen Abschnitten der Axone, wenn ein Bereich von 300 um im Durchmesser beleuchtet wird. Wenn das Anregungslicht zu einer 30 um Durchmesser Bereich für dendritische Wirbelsäule Bildgebung fokussiert wird, verwenden wir 10-25% der Laserlichtintensität. Die erforderliche Dauer der Aufnahme ist eine wichtige Determinante des optimalen Anregungslichtintensität, kürzere Erfassungszeiträumen ermöglichen höhere Lichtintensitäten. Die optimale Beleuchtungsstärke wird am besten empirisch für jede Präparation und Messung Einstellungen bestimmt.
5. Data Analysis
Schritt 5.1. Korrigieren Sie die Rohdaten für bekannte Fehler
Die Analyse und Darstellung von Daten wurden unter Verwendung des NeuroPlex Programm (RedShirtImaging) in IDL (ITT Visual Information Solut schriftliche durchgeführtIonen, Boulder, Colorado) und benutzerdefinierte Visual Basic-Routinen. Unter den Bedingungen einer niedrigen Lichtpegeln, wird die Hintergrundfluoreszenz eine wesentliche Determinante des &Dgr; F / F Signalgröße. Die Rohdaten wurden zuerst für diesen Effekt durch Subtraktion der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität Hintergrund aus einem ungefärbten Bereich auf der Scheibe bestimmt korrigiert. Anschließend wurde das Signal Alignment-Software verwendet, um für zeitlicher Jitter in AP Initiation als auch für mögliche kleine Bewegungen der Zubereitung während der Mittelung zu korrigieren. In der Zeitdomäne wurden AP Signale durch Kreuzkorrelation des elektrisch aufgezeichnet APs in jedem Versuch mit dem Referenzsignal am Anfang Mittelung (1B) erworben ausgerichtet. Im räumlichen Bereich wurden Bilder in zwei Dimensionen offline durch Kreuzkorrelation Bild ausgerichtet sind, um für mögliche kleine seitliche Bewegungen der Herstellung zu kompensieren. Die korrekte Fokussierung des Bildes in der z-Dimension wurde vor jedem einzelnen Studie verifiziert; smal l Anpassungen waren oft notwendig. Die räumlich und zeitlich ausgerichteten Signale wurden gemittelt, wie in 1B gezeigt. Langsame Änderungen in der Lichtintensität durch Bleichen des Farbstoffs wurden durch Unterteilen der Daten von einem entsprechenden Dual Exponentialfunktion der Aufzeichnungsgeräte Versuche ohne Stimulierung (1B) abgeleitet korrigiert. Die Wellenform des Signals AP wurde aus einem Satz von Datenpunkten unter Verwendung kubischer Spline-Interpolation, eine stückweise stetige Kurve, die durch jeden Datenpunkt rekonstruiert. Um zu bestätigen, dass die Spannung-empfindlichen Farbstoff Signal Membranpotential spuren ohne wesentliche Verzerrung am Millisekundenbereich wurde die elektrische AP Signal vom Soma zur optischen AP Signal von der benachbarten Axonhügel wie in 3B gezeigt, verglichen. Die beiden Signale sehr eng überlagern, so dass für das Schrotrauschen in optischen Aufzeichnungsmedien.
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Abbildung 1. Datenanalyse (Animation). (A) Oben: hochauflösende konfokale Abbildung eines gefärbten Neurons mit Axon in Aufnahmeposition. Recording Elektrode Soma und extrazellulären Stimulationselektrode neben basalen Dendriten schematisch dargestellt angebracht. Aktionspotentiale durch extrazelluläre, synaptische Stimulation hervorgerufen. Unten: geringe räumliche Auflösung Fluoreszenzbild des Axons durch CCD verwendet für V m Bildgebung (B) Elektrode Aufnahmen von soma (schwarze Spuren), optische Aufnahmen von AIS (rote Kurven) und von Knoten Ranvier (grün Spuren) erhalten. . Top Spuren: Rohdaten aus 9 Studien zeigen zeitlicher Jitter in AP Initiation. Zweite Reihe von Spuren: zeitlich ausgerichteten Signale. Dritte Reihe von Spuren: gemittelte Signal. Vierte Reihe von Spuren: bleach Korrektur. Bottom Spuren: kubische Spline-Interpolation mit einem Pass zeitliche Glättung.
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Representative Results
Erfolgreiche Konfokalmikroskopie ermöglichen sollten eindeutige Identifizierung von intakten neuronalen Prozesse, die nahe der Oberfläche der Scheibe sind und sich in einer Ebene des Fokus. Die Auswahl von Nervenzellen, die geeignet sind für Spannung Bildgebung vor Spannungs-empfindlichen Farbstoff Belastung ist kritisch. Ein Beispiel von konfokalen Bildern von L5 pyramidalen Neuronen exprimieren EGFP in einer kortikalen slice (Crym transgenen Maus-Linie) ist in Abbildung 2 gezeigt. Axone einzelner Neuronen sind deutlich sichtbar. Zellen mit intakten langen Axone (weiße Pfeile) in einer Fokusebene der Nähe der Oberfläche der Scheibe, wurden ausgewählt.
Abbildung 2. Auswahl der L5 kortikalen Neuronen für V m-Bildgebung von AP Signale von Axonen. Low (links) und hoher (rechts) vergrößerte Bilder der gleichen Scheibe Region; 488 nm Anregung mit YokogawaSpinning Disc-Scanner.
Das räumliche Muster von Na-Kanal-Clustering im Axon anfänglichen Segment (AIS) spielt eine kritische Rolle bei der Abstimmung neuronalen Berechnungen und Veränderungen in der Na-Kanal-Verteilung hat sich gezeigt, neuartigen Formen von neuronaler Plastizität im Axon vermitteln. Jedoch können Daten auf immuncytochemische Kanalverteilung nicht direkt vorherzusagen raumzeitliche Merkmale Aktionspotential Initiierung und vor elektrophysiologischen Massnahmen sind entweder indirekter (extrazellulären) oder keine ausreichende räumliche Auflösung (intrazellulären) direkt kennzeichnen die Spike-Trigger (TZ). Ein kritischer methodischen Verbesserung der Empfindlichkeit des Membranpotentials Bildgebungstechnik hier beschrieben ermöglicht die direkte Bestimmung der Lage und Länge der Hohlspitze TZ wie in funktioneller Hinsicht definiert. Ein Beispiel für die Aufzeichnung AP Signale mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ist in Abbildung 3 dargestellt. 3B zeigt, dassdie verfügbare Empfindlichkeit V m-Bildgebung war ausreichend für eine genaue Überwachung der unterschwelligen Depolarisation vor der regenerativen AP Signal. Außerdem bestätigte der Vergleich der optischen Signale von dem AP Soma / Axonhügel und von einem mehr distalen Knoten Ranvier APs dass stark unterschiedliche Dynamik haben an diesen beiden Stellen 8, 15; sowohl der Aufwärtshub und der Abwärtshub des AP war schneller in der Knoten Ranvier. Einzelheiten zur raumzeitlichen Auflösungsgrenzen in den Messungen der Größe und Position des Spike TZ siehe 3 und 5 in Popovic et al. (2011).
Abbildung 3. Aktionspotential Signale von Axon. (A) Oberes Feld: hohe Auflösung der konfokalen Bild einer L5 kortikalen Neuronen mit der Spannung-empfindlichen Farbstoff mit Axon in Aufnahmeposition geladen; Projektion from a z-Stapel von konfokalen Bildern. Aufnahme / Stimulierung Patch-Elektrode an soma. Unteres Feld: geringer räumlicher Auflösung Fluoreszenzbild des Axon durch CCD erhalten für V m-Bildgebung verwendet. (B) AP verwandten Signalen bei einer Bildwiederholrate von 10 kHz aufgenommen. Spuren rechts: AP Transienten von drei Orten: 1-Elektrode Aufnahme von Soma, 2-optischen Aufzeichnung von Axonhügel; 3-optische Aufzeichnung von dem ersten Knoten der Ranvier. Unteren Spuren: Überlagerte Signal von den gleichen drei Stellen.
Die nichtlineare Wechselwirkung zwischen den exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSPs) und BAPS in den Dendriten, die für die Induktion von LTP ist nicht vollständig verstanden. Diese Wechselwirkung hängt entscheidend von der Amplitude beider Signale und müssen daher räumlich ungleichmäßig. Die experimentelle Überprüfung dieser Vorhersage erfordert räumlich gut aufgelöste Messungen, die nicht durchgeführt wurden, weil dendritische Äste von kleinem Durchmesser nicht einccessible zu Elektrode Messungen. Das Membranpotenzial Bildgebungstechnik hier beschrieben ermöglicht die Überwachung von elektrischen Signal von mehreren Orten im gesamten dendritischen Dorn, wie in 4 gezeigt. Das Muster der bAP Aktivität in der dendritischen Dorn ist durch Natrium aktuellen dominiert Spikes in proximalen Regionen, die nach und nach längerer Calcium aktuellen verändert dominiert depolarisierenden Ereignissen im distalen Dendriten gekennzeichnet.
Abbildung 4. Aktionspotential Signale von mehreren Orten auf der dendritischen arbor einer L5 kortikalen Neuronen. Linkes Feld: Bild mit hoher Auflösung eines L5 kortikalen Neuronen mit einer Spannung Farbstoff beladen; Projektion aus einer z-Stapel von konfokalen Bildern. Rechts: ein Burst von 4 AP bei 100 Hz durch kurze depolarisierende Stromimpulse (untere Kurve) geliefert Soma eingeleitet. Backpropagating action potenzielle Signale von sechs ausgewählten Standorten (1-6) entlang der apikalen und schräge Dendriten. Traces 1 bis 3 wurden aus einer Probeaufnahme erhalten. Trace 4 ist ein vier-Studie Durchschnitt, während die Spuren 5 und 6 sechzehn Studie Durchschnitte sind.
Die Hypothese, dass Stacheln eine elektrische Rolle der Modifikation synaptischer Effizienz zugrunde liegende Plastizität und möglicherweise Lernen und Gedächtnis-Mechanismen hat vor kurzem erhebliche Aufmerksamkeit wegen seiner kritischen Auswirkungen auf die Gehirnfunktion (Yuste, 2010) erhalten haben. Es ist jedoch sehr wenig direkten experimentellen Beweis für oder gegen diese Hypothese. Die Unsicherheiten bei der Interpretation der indirekten Ergebnisse und das Fehlen der direkten Beweise über elektrische Verhalten der dendritischen Dornen sind in erster Linie auf eine methodische Einschränkung - Stacheln sind klein und nicht zugänglich zu herkömmlichen Methoden der Elektrophysiologie. So versucht diese Frage in der Abwesenheit von experimentellen Daten stützte sich auf untersuchenComputersimulationen mit Schätzungen der elektrischen Parameter an der Wirbelsäule Morphologie und Diffusionseigenschaften der Wirbelsäule Hals basiert. Die Spannung-imaging hier beschriebene Ansatz erlaubt es, Aktionspotential Signale und Synapsenpotenzial Signale am räumliche Skala von einzelnen dendritischen Dornen mit hoher Empfindlichkeit zu überwachen. Die Experimente können nun entwickelt, um direkt zu testen die grundlegenden theoretischen Vorhersagen über elektrische Verhalten der dendritischen Dornen werden. Ein Beispiel der optischen Signale in Bezug auf backpropagating APs in einem einzelnen dendritischen Wirbelsäule und der übergeordneten Dendriten ist in Abbildung 5 dargestellt.
Abbildung 5. Aktionspotential Signale von einem einzelnen dendritischen Wirbelsäule. Linke Panels: upper Aufnahmen - anatomische Rekonstruktionen aus einem Stapel von Spinning-Disk konfokalen Bildern erhalten. Lower Aufnahmen - fluorescence Bildern derselben Region mit der CCD-Kamera für V m-Bildgebung erhalten wird. Rechts: Fluoreszenzintensität verfolgt entsprechenden bAP von Standorten 1-3 von CCD-Bildern dargestellt. Zeitliche Mittelwerte von 9 Studien. Untere Kurve: Elektrode Aufnahmen aus dem Soma. Beachten Sie, dass Spur 3 aus einem Gebiet ohne Wirbelsäule nicht hat nachweisbaren Signal niedrigen Niveau der Lichtstreuung in der oberflächlichen Schicht der Scheibe.
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Discussion
Dieser Artikel beschreibt ein Spannungs-empfindlichen Farbstoff-Aufnahme Verfahren zur Überwachung der elektrischen Aktivität einzelner Neuronen mit sub-Mikrometer-und Sub-Millisekunden-raumzeitliche Auflösung. Laseranregung bei nahezu optimale Wellenlänge (bezüglich Signalgröße) verbessert die Empfindlichkeit der Aufnahme um einen Faktor von ~ 50 gegenüber früheren Ansätzen. Die aktuelle Empfindlichkeit ermöglicht die Überwachung elektrischer Signale aus allen Teilen der einzelnen Neuronen, einschließlich Dendriten, Axonen, Axon Sicherheiten und Axonterminalen sowie einzelne dendritische Dornen. Mit vorliegenden Empfindlichkeit kann Aufnahmen Membranpotential Transienten bei Bildraten von bis zu 20 kHz durchgeführt werden. Bescheidenen Signalmittelung (4-25 Studien) leicht verbessern die Empfindlichkeit der Aufzeichnung als das Signal-zu-Rausch-Verhältnis um einen Faktor von 2-5 ausgedrückt. Der größte Nachteil bei Spannung Bildgebung ist die fehlende einfache Kalibrierung von optischen Signalen von mehreren Orten auf einer absoluten Skala Spannung. In einiger Vorbereitungs kann dies, indem sie eine Membranpotential Signal, das eine bekannte Amplitude an allen Standorten hat gelöst werden. AP Signale im Axon und in einigen voll erregbaren Dendriten 6 bieten eine ausgezeichnete Kalibrierstandards.
Kritische Schritte in der Anwendung dieser Methode sind:
- Minimierung Lichtstreuungseffekten durch Einschränkung der Aufnahmen auf Neuronen nahe der Oberfläche des spitzen Gehirnschnitte (<30 um) befindet. Dies erforderte Optimierung der Slicing Prozedur, um einen hohen Prozentsatz von gesunden Neuronen in der oberen Schicht der Schicht 1 zu erhalten.
- Optimierung der Menge des klaren Lösung in der Spitze der Elektrode zur Abgabe des Farbstoffs zu schnelles Laden der Neuronen versichern.
- Eliminieren mechanischen Vibration der Zubereitung, die eine Quelle für übermäßiges Rauschen in optischen Aufzeichnungsmedien sein kann.
- Verwendung rauscharmen Dauerstrich (CW)-Laser mit der RMS-Rauschen der Amplitude <0,5% als eine Quelle von exZitat Licht.
- Steuern photodynamischen Schäden durch Auswahl geeigneter Anregungslichtintensität relativ zu der Dauer der Aufzeichnung Periode und durch Abtrennen aufeinanderfolgende Aufnahmen von dunklen Perioden. Längere Aufnahmezeiten Zeiträume erfordern niedrigere Lichtintensitäten zu photodynamische Schäden zu verhindern.
Die Aufnahme gezeigten Beispiele oben zeigen einen Wendepunkt in der Wirbelsäule und Axon Physiologie. Diese Aufnahmen zeigen die bemerkenswerte Seinsmächtigkeit der Lage, direkt elektrische Ereignisse aufzuzeichnen, die nur aus theoretischen Gründen in der Vergangenheit analysiert werden konnte.
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Disclosures
Dejan Zecevic erklärt, dass er ein Miteigentümer RedShirtImaging LLC., Ein Unternehmen im High-Speed-, Low Noise CCD-Kameras in Spannungs-empfindlichen Farbstoff Aufnahme verwendet spezialisiert ist. Alle anderen Autoren berichten keine finanziellen Interessen oder potenzielle Interessenkonflikte im Zusammenhang mit der aktuellen Studie.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, dass unsere Mitarbeiter Knut Holthoff, Arthur Konnerth und Marco Canepari, die in der Anfangsphase der Entwicklung dieser Technik sowie Leslie M. Loew für die freundliche Bereitstellung Farbstoffe teilgenommen. Unterstützt durch NSF IOS-0817969, NIH Zuschüsse NS068407 und M136043 und Kavli Institute for Neuroscience an der Yale University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss Axi–xaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
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