Summary
טכניקת הדמיה למעקב אחר שינויים אפשריים בממברנה עם רזולוצית המשנה מיקרומטר מרחבית ותת זמנית האלפית השנייה מתוארת. הטכניקה, המבוססת על ליזר עירור של צבעי מתח רגישים, מאפשרת מדידות של אותות באקסונים וטחונות האקסון, סניפי מסוף דנדריטיים, וקוצים הדנדריטים בודדים.
Abstract
הבנת מאפייני biophysical והארגון תפקודי של תאי עצב בודדים וכיצד הם מעבדים מידע הוא יסוד להבנה כיצד המוח עובד. תפקידו העיקרי של כל תא עצב הוא לעבד אותות חשמליים, בדרך כלל ממקורות מרובים. תכונות חשמליות של תהליכים עצביים הן מורכבות מאוד, דינמיות, ובמקרה הכללי, אי אפשר לחזות בהעדר מדידות מפורטות. כדי להשיג מדידה אחת כזו היית, באופן אידיאלי, רוצה להיות מסוגל לפקח, במספר רבים של אתרים, אירועי subthreshold כשהם נוסעים מאתרים של מקור בתהליכים עצביים וsummate במקומות מסוימים כדי להשפיע על ייזום פוטנציאל פעולה. מטרה זו לא הושגה בכל תא עצב בשל מגבלות טכניות של מדידות שמעסיקות אלקטרודות. כדי להתגבר על חסרון זה, רצוי מאוד כדי להשלים את גישת תיקון-אלקטרודה עם שיטות הדמיה המאפשרות recordin המקביל הנרחבGS מכל חלקי תא עצב. כאן, אנו מתארים טכניקה כזו - הקלטה אופטית של הארעיים פוטנציאליים קרום עם צבעים אורגניים מתח רגישים (V-m הדמיה) - מאופיינים בתת האלפית השני ורזולוצית המשנה מיקרומטר. השיטה שלנו מבוססת על עבודתו החלוצית בבדיקות מתח רגישות מולקולריות 2. היבטים רבים של הטכנולוגיה הראשונית שופרו ברציפות במשך כמה עשורים 3, 5, 11. בנוסף, עבודה קודמת תעדה שני מאפיינים מהותיים של V-מ 'הדמיה. ראשית, אותות קרינה הם ליניארי יחסיים לפוטנציאל קרום מעל הטווח הפיזיולוגי כל (-100 mV ל100 mV; 10, 14, 16). שנית, הנוירונים טעינה עם לצבוע מתח הרגיש משמש כאן (JPW 3028) אין לו השפעות תרופתיות לזיהוי. נרשמה רחבה של ספייק במהלך טעינת צבע היא הפיכה לגמרי 4, 7. בנוסף, עדות ניסויית מראה כי ניתן להשיגמספר משמעותי (עד מאה) של הקלטות לפני כל השפעות גילוי phototoxic 4, 6, 12, 13. כרגע, אנחנו מנצלים את הבהירות והיציבות המעולות של מקור אור ליזר באורך גל קרוב לאופטימלי למקסם את הרגישות של טכניקת V-מ 'ההדמיה. הרגישות הנוכחית מאפשרת הקלטות אופטיות אתרים מרובות של הארעיים V מ 'מכל חלקי הנוירון, כולל אקסונים וטחונות האקסון, סניפים הדנדריטים מסופים, וקוצים הדנדריטים בודדים. המידע שנרכש על אינטראקציות אותות ניתן לנתח כמותית כמו גם ישירות דמיין בצורה של סרט.
Protocol
1. התקנת ציוד
שלב 1.1. התקנת הדמיה
המפתח להקלטת אותות צבע רגיש מתח הוא עיצוב התקנה מתאימה. אנו משתמשים במיקרוסקופ זקוף (BX51WI אולימפוס או Zeiss AxioExaminer) מצויד בשלוש מצלמות. ההתקנה נועדה לנוירונים מאיר בודדים בפרוסות מוח על ידי גירוי אור בעלית פלואורסצנטי, מצב מיקרוסקופי שדה רחב המשתמשים בניקון 60X/1.0 NA NA או מי 63X/1.0 Zeiss יעדי טבילה. המיקרוסקופים שלנו מוברגים לשולחן בידוד רעידות ומצוידות בשלבים ממונעים מטלטלין. כל מיקרוסקופ מצויד בשלוש יציאות מצלמה. יציאת מצלמה אחד יש מצלמה רגילה ברזולוציה מרחבית גבוהה CCD עבור וידאו מיקרוסקופי (IR-1000, Dage MTI, ארה"ב) דסק"ש אינפרא האדום. יציאת המצלמה השנייה יש מצלמת רכישה נתונים מהירה (עד 20 במסגרת שיעור קילוהרץ) עם רזולוציה מרחבית נמוכה יחסית (80 80 פיקסלים) אבל טווח דינמי יוצא דופן (14 סיביים) ובמיוחד לקרוא נמוכהרעש (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). יציאת המצלמה השלישית יש מצלמת CCD ברזולוציה מרחבית גבוהה (PixelFly, 1392x1024 פיקסלים; PCO AG, גרמניה) רכובה על סורק דיסק ספינינג confocal (CSU-10, Yokogawa, יפן) המשמש לאיסוף-z ערימות של תמונות confocal עבור שיקום מורפולוגי מפורט של התא המוכתם. דיודה-שאובה תדירות הוכפלה-Nd: ליזר YVO4 רציף גל (400 MW) פולט ב532 ננומטר (MLL-III/400 mW; CNI, צ'אנגצ'ון, סין) היא מקור אור עירור. קרן 2 מ"מ קוטר הליזר המגודרת על ידי תריס (LS6; Associates וינסנט) מופנה למדריך אור מצמיד מיקרוסקופ באמצעות קבל epifluorescence אחת יציאות (עד Photonics GmbH, Grafelfing, גרמניה), שנועד ימלא יותר מדי את הצמצם האחורי של אובייקטיבי ולספק ליד התאורה אחידה של מטוס האובייקט. אור הליזר משמש במקום של מנורת קשת קסנון קונבנציונלית כדי למקסם את הרגישות של V-m הדמיה על ידי: (1) שימוש לשעבר מונוכרומטיאור צל"ש באגף האדום של ספקטרום הספיגה למקסם את רגישות V מ 'של 9 הצבע, 10 ו (2) הגדלת עוצמת אור העירור מעבר לרמה שניתן להשיג על ידי קשת מנורה. אור העירור השתקף להכנה על ידי מראה Dichroic עם אורך גל של 560 ננומטר מרכזי ואור פלואורסצנטי המוקלט שעבר 610 ננומטר מחסום מסנן (שוט RG610). ההשפעה המשולבת של עלייה בעוצמת אור והשימוש באורכי גל עירור קרבה אופטימלית מונוכרומטי הייתה שיפור דרמטי ברגישות של הדמית מתח בפקטור של כ 50 בהשוואה למדידות קודמות 6.
שלב 1.2. התאם לתאורה אחידה
השתמש בשקופית סטנדרטית פלואורסצנטי (עירור ירוק / פליטה אדומה). הכנס מסננים מתאימים ניטראליים צפיפות בנתיב קרן הליזר כך שCCD הוא לא רווי. התמקד אובייקטיבי על פני השטח שלהשקופית. כוון את המיקום בצד מקבל של אור מדריך קוורץ מול אובייקטיבי משגר הליזר, ולהתאים את המיקום של סוף הפלט של מדריך האור המחובר למיקרוסקופ באמצעות מפעילים מתאימים בקבל עלית פלואורסצנטי להשיג ממוקד ואחיד תאורה של שדה הראייה.
שלב 1.3. קבע רעש רטט
מציב סימן דיו שחור קטן על פני השטח של שקופית פלואורסצנטי. עוצמת אור עם שיא NeuroCCD במצב ההקלטה הרציפה. התמקד אובייקטיבי על שולים כהים של הסימן דיו השחור. רשום את עוצמת האור לכ 100 אלפית שני בקצב פריימי kHz 2. להציג את הממוצע המרחבי של עקבות החלקיות עוצמת האור (ΔF / F) מ ~ 20 פיקסלים המקבלות אור מהאזור המואר בצורה אחידה ומ ~ 20 פיקסלים לאורך הקצה של סימן הדיו. הרעש העודף בהקלטות מפיקסלים עם קצות ניגודיות גבוהות משקף את רעש הרטט בהמערכת.
שלב 1.4. בידוד רעידות
זה חובה לצמצם את התנודות באמצעות טבלת רטט בידוד לרמה נמוכה מרעש הירייה בעוצמות אור דומה לתנאי הקלטה ניסיוניות. התאם את שולחן בידוד הרעידות עד רעש הרטט בעוצמת האור מפיקסלים מכסים את הקצה החד של התמונה הוא זניח. אף אחד מהמכשירים עם חלקים נעים (תריסים, מאווררים מכאניים) יכול להיות מותקן על השולחן. את הכבלים מהציוד על השולחן הצמוד לרכיבים אחרים שאינם מבודדים מהרטט חייבים להיות משוחרר, כך שהם אינם מעבירים תנודות מכאניות למיקרוסקופ.
2. בחירת Neuron המתאים לV מ-Imaging
שלב 2.1. בחירה של נוירונים
הפוך פרוסות מוח על פי נהלים רגילים. השתמש בקו עכבר מביע EGFP בתאי עצב בודדים של interest. עם מערכת confocal דיסק ספינינג, לדמיין EGFP נוירונים שכותרתו בפרוסה. בחר נוירונים לV מ-הדמיה עם עצים שלמים הדנדריטים / אקסונלית, ועם תהליכים רצים במקביל וקרוב לפני השטח של הפרוסה. זה לא יכול להתבצע בעכברי סוג פראי בגלל אקסונים ודנדריטים הדקים, על פי רוב, אינם גלויים במצב מיקרוסקופיה DIC.
3. הנוירונים טוענים עם דאי מתח רגיש
שלב 3.1. מילוי של פיפטה התיקון
מלא pipettes תיקון זכוכית מהקצה עם פתרון תאי לצבוע חופשי על ידי הפעלת לחץ שלילי של כ 15 עד 2/3 מלהתחדד אלקטרודה. הפתרון החופשי לצבוע בקצה הוא הכרחי כדי למנוע הדליפה של צבע על גבי הפרוסה המגבירה את קרינת הרקע ומפחית באופן דרמטי יחס אות לרעש. גב למלא את האלקטרודה בתמיסה המכילה את צבע קרום impermeant מתח הרגיש JPW3028 המומס בפתרון תאי (0.8 מ"מ).
JPW3028, בדיקת המתח המצליחה ביותר ליישום תאי, הוא אנלוגי כפליים טעון חיובי של סדרת ANEP של צבעי styryl lipophilic שעדיין מספיק מסיס במים המשמשים לmicroinjection. האנלוגי di-אתיל של הצבע הזה יש מאפיינים זהים כמעט (כולל מתח רגישות) והוא זמין באופן מסחרי כJPW1114 (ראה טבלה 1). אנחנו מכינים פתרון מנייה 20 מ"מ בH 2 O. המזוקק 50 aliquots μl של פתרון המניות נשמרים קפוא ב -20 ° C. לריכוז הצבע הסופי של 0.8 מ"מ, 2 μl מפתרון המנייה מומסת ב50 μl של פתרון תאי ביום של הניסוי. הפתרון לצבוע המנייה הוא יציב ויכול להישמר בטמפרטורת חדר במשך כמה חודשים. לכן, אנחנו ממשיכים aliquot μl 1 50 בטמפרטורת חדר עד שהוא בשימוש למעלה.
שלב 3.2. להקים גיגה חותם מהירות
ss = "jove_content"> תיקון נוירון נבחר בעבר ולאפשר דיפוזיה חופשיה של הצבע מפיפטה תיקון סומטי לסומא בתצורה כל התא ל20-45 דקות. זה חיוני כדי להשיג חותם מהר ככל האפשר, כך שהסכום של פתרון לצבוע חופשי בקצה יכול להיות כל זמן קטן. התחל על ידי תרגול תיקון מהיר מבלי לצבוע באלקטרודה. בשלב בא, תיקון בפועל וטעינת נוירונים עם הצבע במטרה להשתמש בכמות מינימאלית של פתרון לצבוע חופשי בקצה מבלי לזהם את הרקמה שמסביב. בעזרת תרגול, ניתן להקים חותם בתוך 1-2 דקות.
שלב 3.3. לפקח על הרמה של הכתמה
במהלך הפעפוע לצבוע בתצורה כל התא, לפקח על המצב הפיזיולוגי של הנוירון על ידי הקלטת פוטנציאלי פעולה עוררו במצב-מהדק נוכחי. בנוסף, לפקח על כמות הכתמה על ידי הקלטת עוצמת אור המנוחה (RLI) מתא הסומא במסגרת שיעור של 2 k הרץ ובשבריר של אור בעצמה מלאה מותאמים עם מסנני צפיפות ניטראליים (אנו משתמשים 0.04% מעוצמת תאורת הליזר מ400 mW ליזר). המשך תהליך טעינת הצבע עד פוטנציאל הפעולה מתחיל להרחיב, בדרך כלל לאחר 20-40 דקות, תלוי בגודל אלקטרודה וההתנגדות.
הרחבה של ספייק היא לחלוטין הפיכה ובשל השפעת עומס קיבולים של הריכוז הרווי של הצבע בקרום הגופני סבירה ביותר. צורת הגל של העלייה החדה בתשוחזר במלואו לאחר ריכוז הצבע הוא מתאזן לאורך תא העצב.
שלב 3.4. הסר את האלקטרודה הצבע
בסוף תקופת ההכתמה, מושך בזהירות פיפטה התיקון מהסומא בתצורת מהדק מתח להבטיח כי מעבר מכל תאים לתצורת תיקון מחוץ-out מושג בתהליך.
שלב 3.5. חכה לדיפוזיה צבע
אף אוזן גרון "> דגירה פרוסה ל1.5-2 שעות נוספות בטמפרטורת חדר, כדי לאפשר לצבוע מתח הרגיש להתפשט לתוך תהליכים עצביים. אחרי כמות משמעותית של צבע מתמוסס מסומה לתהליכים דנדריטיים ואקסונלית, צורת הגל של AP משוחזר לגמרי.4. הקלטה אופטית
שלב 4.1. בחר תא סלולרי להדמיה
אתר את הסומא של נוירון המוכתם תחת פלואורסצנטי אור הנמוך ורמה מחדש תיקון נוירון עם אלקטרודה סטנדרטית (ללא צבע) תיקון תחת דסק"ש. דמיינו תהליכים עצביים תחת אור רמה נמוכה במסגרת שיעור של 10-40 הרץ במצב ההקלטה הרציפה של CCD למתח הדמיה. הפחת את רמת האור במסנני צפיפות ניטראליות למינימום הנדרש כדי לחזות את האובייקט של עניין. אנו משתמשים 0.01% בעוצמת 400 mW הליזר במיצוב של נוירון המוכתם. שימוש בבמת XY, למקם את התהליך העצבי של עניין בtהוא אמצע תחום ההדמיה. הגן סומא מן אור העירור באמצעות קשתית תחנת השדה הסגור חלקית של המיקרוסקופ. מיגון הסומא מן אור עירור בעצמה גבוהה באופן משמעותי להפחית את הניזק פוטודינמי במהלך הקלטה.
שלב 4.2 אותות אופטיים שיא הקשורים לעוברי קרום פוטנציאליים
להקליט אותות אופטיים הקשורים לנקודתי גישת backpropagated בענפים הדנדריטים בודדים. להקליט אותות אופטיים הקשורים לנקודתי גישה באקסון. להקליט אותות אופטיים הקשורים לbackpropagating נקודתי גישה בקוצים הדנדריטים. השתמש במסגרת שיעורים מתאימים לשחזור מדויק של צורת גל אות ולשמור על תקופות הקלטה והחשיפה לאור בעצמה גבוה עירור קצר ככל האפשר כדי למזער את הצבע הלבן וניזק פוטודינמי. לדוגמה, בדיקת הרצף של ייזום והתפשטות של פוטנציאל פעולה בודד באקסון דורשת תקופות הקלטה של אלפית 5-10. עירור האור intensity במהלך ההקלטה הוא פשרה בין יחס אות לרעש ביד אחת ואת המידה של צבע הלבנה וניזק פוטודינמי מצד השני. אנו משתמשים 100% מעוצמת ליזר 400 mW בהקלטה מקטעים ארוכים של האקסונים כאשר שטח של 300 מיקרומטר בקוטר הוא מואר. כאשר אור העירור ממוקד לאזור קוטר 30 מיקרומטר להדמית עמוד שדרה הדנדריטים, אנו משתמשים 10-25% מעוצמת אור הליזר. המשך הנדרש של הקלטה הוא גורם חשוב לעוצמת אור העירור האופטימלית; תקופות קצרות יותר מאפשרות הקלטת עוצמות אור גבוהות יותר. עוצמת התאורה האופטימלית נקבעה באופן אמפירי הטוב ביותר עבור כל הכנה והגדרות מדידה.
5. ניתוח נתונים
שלב 5.1. לתקן את נתוני הגלם לשגיאות ידועות
הניתוח וההצגה של נתונים בוצעו באמצעות תכנית NeuroPlex (RedShirtImaging) נכתבה בIDL (ITT החזותי המידע solutיונים בבולדר, קולורדו) ושגרה של Visual Basic מותאם אישית. בתנאים של רמות אור נמוכים, קרינת הרקע הופכת קובע משמעותי של גודל אות ΔF / F. הנתונים הגולמיים תוקנו ראשון להשפעה זו על ידי הפחתת עוצמת קרינת הרקע הממוצעת נקבעת מאזור כתם על הפרוסה. לאחר מכן, תוכנת יישור האות שמשה לתיקון ריצוד זמני בAP ייזום, כמו גם לתנועות קטנות אפשריות של ההכנה במהלך הממוצע. בתחום הזמני, אותות AP היו מיושרים על ידי מתאם צלב של נקודתי הגישה נרשמו חשמלי בכל ניסוי לאות ההפניה רכשה בתחילת המיצוע (1B איור). בתחום המרחבי, תמונות היו מיושרות בשני ממדים מחוברים על ידי מתאם צלב תמונה כדי לפצות על תנועות קטנות לרוחב אפשריות של ההכנה. המיקוד הנכון של התמונה בZ-הממד אומת לפני כל ניסוי פרט; smal התאמות l היו לעתים קרובות יש צורך. האותות המיושרים מרחב ובזמן היו ממוצעים כפי שמוצגים בתרשים 1B. שינויים איטיים בעוצמת אור בשל הלבנה לצבוע תוקנו על ידי חלוקת הנתונים על ידי פונקציה מעריכית כפולה מתאימה נגזרת מניסויי ההקלטה ללא גירוי (1B איור). צורת הגל של אות AP שוחזרה מסדרה של נקודתי נתונים באמצעות אינטרפולציה Spline העוקבת, עקומה רציפה piecewise עוברת דרך כל נקודת נתונים. כדי לוודא שהאות לצבוע מתח הרגישה עוקבת פוטנציאל קרום ללא עיוות משמעותית בסולם הזמן האלפית השני, אות AP החשמל מסומה הושוותה לאות AP האופטית מתלולית האקסון הסמוכה כפי שמוצג באיור 3 ב. שני האותות להרכיב מקרוב מאוד, מה שמאפשר לרעש הירייה בהקלטה אופטית.
les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg "/>
איור 1. ניתוח נתונים (אנימציה). () פנל עליון: תמונת confocal רזולוציה גבוהה של נוירון מוכתם עם האקסון בעמדת הקלטה. האלקטרודה הקלטה מצורפת לסומה והאלקטרודה מגרה תאית הסמוכה לדנדריט הבזליים הראה סכמטי. פוטנציאל פעולה שמעורר גירוי תאי, הסינפטי. פנל תחתון: תמונה ברזולוציה מרחבית נמוכה קרינה של האקסון מתקבל על ידי CCD משמש להדמית V מ '(ב') הקלטות אלקטרודה מסומה (עקבות שחורות), הקלטות אופטיות מ-AIS (עקבות אדומות), ומצומת של Ranvier (עקבות ירוקות). . עקבות מובילות: נתונים גולמיים מ9 ניסויים מראים ריצוד זמני בAP חניכה. שורה השנייה של עקבות: מיושר אותות בזמן. שורה שלישית של עקבות: אות ממוצעים. השורה הרביעית של עקבות: תיקון אקונומיקה. עקבות תחתונות: אינטרפולציה שגם מעוקב עם מעבר אחד של החלקה זמנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרוסקופיה confocal המוצלחת צריכה לאפשר זיהוי ברור של תהליכים עצביים שלמים שהם קרובים אל פני השטח של הפרוסה וממוקמים במישור אחד של פוקוס. הבחירה של תאי עצב המתאימים להדמית מתח לפני הטעינה לצבוע מתח רגיש היא קריטית. דוגמה לתמונות confocal של נוירונים פירמידליים L5 מבטאים EGFP בפרוסת קליפת מוח (קו העכבר המהונדס Crym) מוצגת באיור 2. האקסונים של נוירונים בודדים הם נראים בבירור. תאים עם אקסונים שלמים ארוכים (חצים לבנים) במישור אחד של מוקד קרוב לפני השטח של הפרוסה נבחרו.
איור 2. בחירה של נוירונים בקליפת מוח L5 לV מ-הדמיה של אותות AP מאקסונים. (מימין) תמונות נמוכות (משמאל) וגבוהות גדלה של אותו אזור הפרוסה; 488 ננומטר באמצעות עירור Yokogawaספינינג סורק דיסק.
הדפוס המרחבי של אשכולות Na ערוצים במגזר הראשוני האקסון (AIS) משחק תפקיד קריטי בכוונון חישובים ושינויים בחלוקת Na ערוצים עצביים הוכח לתווך צורות חדשות של פלסטיות עצבית באקסון. עם זאת, נתוני immunocytochemical על ערוץ הפצה לא יכולים ישירות לחזות מאפייני חלל ובזמן של ייזום פוטנציאל פעולה, וצעדים לפני אלקטרופזיולוגים הם או עקיפים (תאיים) או חוסר רזולוציה מרחבית מספיקה (תאי) ישירות כדי לאפיין את אזור גירוי ספייק (ט"ז). שיפור המתודולוגי קריטי ברגישות של טכניקת הדמית פוטנציאל קרום המתואר כאן מאפשר קביעה ישירה של המיקום ואת אורך TZ ספייק כהגדרתו במונחים פונקציונליים. דוגמה להקלטת אותות AP ברזולוציה מרחבית גבוהה זמנית ומוצגת באיור 3. 3B האיור ממחיש כיהרגישות הזמינה של V-m הדמיה הייתה מספיקה לניטור מדויק של שלילת קוטביות subthreshold קדמה לאות AP רגנרטיבית. בנוסף, ההשוואה של את אותות AP האופטיים מ הסומא / האקסון תלולית ומצומת דיסטלי יותר Ranvier אשרה כי נקודתי גישה יש דינמיקה שונה במידה ניכרת בשני המקומות האלה 8, 15, שניהם upstroke והיורד של AP היה מהירים יותר ב צומת של Ranvier. לפרטים אודות מגבלות רזולוצית חלל ובזמן במדידות של הגודל והמיקום של TZ ספייק ראו איורים 3 ו 5 בפופוביץ' et al. (2011).
איור 3. אותות פוטנציאל פעולה מהאקסון. () פנל עליון: תמונה ברזולוציה גבוהה confocal של נוירון קורטיקלי L5 העמוס לצבוע מתח הרגיש עם האקסון בעמדת הקלטה; ההקרנה frאום Z-ערימה של תמונות confocal. הקלטה / גירוי אלקטרודה טלאי המחוברת לסומא. פנל תחתון: תמונה ברזולוציה מרחבית נמוכה קרינה של האקסון מתקבל על ידי CCD משמש לV-מ 'הדמיה. (ב) אותות הקשורים AP נרשמו בקצב פריימים של 10 קילוהרץ. עקבות על ימין: AP ארעי משלושה אתרים: הקלטה 1-האלקטרודה מסומא; הקלטה 2-אופטית מתלולית האקסון; הקלטה 3-אופטית מהצומת הראשונה של Ranvier. עקבות תחתונות: גבי אות מאותם השלושה מקומות.
האינטראקציה אינה ליניארי בין הפוטנציאלים המעוררים postsynaptic (EPSPs) וbAPs בדנדריטים שהוא אחראי לאינדוקציה של LTP לא מובנת לחלוטין. אינטראקציה זו תלויה באופן קריטי על המשרעת של שני האותות וחייבת, לפיכך, להיות מרחבית לא אחיד. הבדיקה הניסיונית של תחזית זו מחייבת מדידות החליטו מרחבית גם שלא ממושו כי ענפים הדנדריטים של קוטר קטן הם לאccessible למדידות אלקטרודות. טכניקת הדמית פוטנציאל הקרום המתואר כאן מאפשרת ניטור של איתות חשמלית ממיקומים מרובים בסוכה הדנדריטי כולו, כפי שמוצג באיור 4. דפוס פעילות באפ בסוכת הדנדריטים מאופיין בקוצי נתרן הנוכחיים שלטו באזורים הפרוקסימלי שהפכו בהדרגה לסידן נוכחי ממושך שלט depolarizing אירועים בדנדריטים הדיסטליים.
איור 4. אותות פוטנציאל פעולה ממקומות מרובים בסוכת הדנדריטים של נוירון קורטיקלי L5. פנל שמאלי: תמונה ברזולוציה גבוהה של נוירון קורטיקלי L5 העמוס לצבוע מתח רגיש; הקרנת Z-ערימה של תמונות confocal. לוח ימני: פרץ של 4 AP יזם ב 100 הרץ ידי פולסים קצרים depolarizing שוטפים (עקבות תחתונות) נמסרו לסומא. Backpropagatingאותות ction פוטנציאליים משישה מיקומים נבחרים (1-6) לאורך הדנדריטים apical ומשופעים. עקבות 1 עד 3 התקבלו מהקלטת משפט אחד. עקבות 4 הן ממוצע ניסיון של ארבעה, ואילו עקבות 5 ו 6 הן 16 ממוצעי משפט.
ההשערה שקוצים יש תפקיד חשמלי של שינוי יעילות הסינפטית שבבסיס פלסטי ואולי למידה ומנגנוני זיכרון קבל תשומת לב רבה לאחרונה בשל ההשלכות הקריטיות שלו לתפקוד המוח (יוסטה, 2010). יש, עם זאת, ראיות ניסיוניות ישירות מעט מאוד בעד או נגד השערה זו. חוסר הוודאות בפרשנות של תוצאות עקיפות והיעדר ראיות ישירות על התנהגות חשמלית של קוצים הדנדריטים הן בעיקר בשל מגבלה המתודולוגית - קוצים קטנים ולא נגישים לשיטות קונבנציונליות של אלקטרו. לכן, מנסה לחקור את השאלה הזאת בהיעדר נתונים ניסיוניים הסתמכו עלהדמיות מחשב עם אומדנים של פרמטרים חשמליים המבוססות על מורפולוגיה עמוד שדרה ונכסי diffusional של צוואר עמוד השדרה. גישת מתח ההדמיה המתוארת כאן מאפשרת לעקוב אחר אותות פוטנציאל פעולה ואותות הסינפטיים פוטנציאליים בקנה המידה המרחבי של קוצים הדנדריטים בודדים עם רגישות גבוהה. הניסויים עכשיו יכולים להיות מעוצבים באופן ישיר כדי לבחון את התחזיות התיאורטיות הבסיסיות אודות התנהגות חשמלית של קוצים הדנדריטים. דוגמה לאותות אופטיים הקשורים לנקודתי גישה בשדרת backpropagating הדנדריטים פרט ודנדריט ההורה שלו מוצגת באיור 5.
איור 5. אותות פוטנציאל פעולה מעמוד שדרה הדנדריטים פרט. לוחות שמאל: micrographs העליון - שחזורים אנטומיים המתקבלים מערימה של תמונות confocal ספינינג דיסק. micrographs הנמוך - flתמונות uorescence של אותו האזור שהושגו עם מצלמת CCD לV-מ 'הדמיה. לוח ימני: עוצמת קרינה עוקבת מקבילה לבאפ ממקומות 1-3 המפורטים בתמונות CCD. ממוצעים זמניים של 9 ניסויים. עקבות תחתונות: הקלטות אלקטרודה מסומה. שים לב שעקבות 3 משטח בלי עמוד שדרה אין אות detectible המציין רמה נמוכה של פיזור אור בשכבה השטחית של הפרוסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר שיטת הקלטה לצבוע מתח רגישה לניטור פעילות חשמלית של תאי עצב בודד ב- מיקרומטר משנה ורזולוצית המשנה האלפית השנייה חלל ובזמן. עירור ליזר באורך גל קרוב לאופטימלי (לגבי גודל אות) שפר את הרגישות של הקלטה בפקטור של ~ 50 על גישות קודמות. הרגישות הנוכחית מאפשרת ניטור אותות חשמליים מכל חלקי נוירונים בודדים, כולל דנדריטים, אקסונים, טחונות האקסון ומסופי האקסון כמו גם קוצים הדנדריטים בודדים. ברגישות בהווה, הקלטות של עוברים פוטנציאליים קרום יכולות להתבצע במסגרת שיעורים של עד 20 קילוהרץ. מיצוע אות צנוע (4-25 משפטים) יכול בקלות לשפר את הרגישות של הקלטה לידי ביטוי את יחס אות לרעש בפקטור של 2-5. המגבלה העיקרית של הדמית מתח היא היעדר כיול פשוט של אותות אופטיים ממקומות רבים בקנה מידת מתח מוחלט. בהכנת חלקשל זו ניתן לפתור על ידי מציאת אות פוטנציאל קרום שיש משרעת ידוע בכל המקומות. אותות AP באקסון ודנדריטים בכמה חמומים המוח באופן מלא 6 לספק סטנדרטי כיול מצוין.
שלבים קריטיים ביישום של מתודולוגיה זו הם:
- מזעור תופעות פיזור אור על ידי הגבלת ההקלטות לתאי עצב הממוקמים בקרבת פני השטח של פרוסות מוח החריפות (<30 מיקרומטר). זה נדרש ייעול הליך החיתוך להשיג אחוז גבוה של תאי עצב בריאים בשכבה העליונה של הפרוסה 1.
- אופטימיזציה של כמות הפתרון ברור בקצה האלקטרודה לאספקת הצבע כדי להבטיח טעינה מהירה של תאי עצב.
- ביטול רטט מכאני של ההכנה שיכולה להיות מקור לרעש עודף בהקלטה אופטית.
- רעש נמוך העסקת גל (CW) לייזרים רציפים עם רעש RMS של משרעת <0.5% כמקור לאקסאור צל"ש.
- שליטת ניזק פוטודינמי ידי בחירת עוצמת אור עירור מתאימה ביחס לאורכה של תקופת הקלטה ועל ידי הפרדת הקלטות רצופות בתקופות אפלות. תקופות הקלטה עוד דורשות עוצמות אור נמוכות כדי למנוע ניזק פוטודינמי.
דוגמאות ההקלטה המוצגות לעיל מצביעות נקודה מפנה בעמוד שדרה ופיזיולוגית האקסון. הקלטות אלה חושפות את הכח המדהים של להיות מסוגל להקליט ישירות לאירועים חשמליים שרק יכול להיות מנותח על בסיס תיאורטי בעבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
דז'אן Zecevic מצהיר כי הוא בעלים משותפים של RedShirtImaging LLC., חברה המתמחה במצלמות במהירות גבוהה, רעש נמוכות CCD משמשות בהקלטה לצבוע מתח רגישה. כל הכותבים האחרים דיווחו שאין אינטרסים כלכליים או פוטנציאל לניגודי עניינים הקשורים למחקר הנוכחי.
Acknowledgments
אנו מודים למשתפי הפעולה שלנו הקנוט Holthoff, ארתור Konnerth ומרק Canepari שהשתתף בפיתוח הראשוני של טכניקה זו, כמו גם לסלי מ 'לייב למתן צבעים חביבים. נתמך על ידי מענק NSF IOS-0817969, מענקי NIH NS068407 וM136043 ועל ידי מכון קאוולי למדעי המוח באוניברסיטת ייל.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss Axi–xaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).
- Cohen, L. B. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -Y., Cohen, L. B. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. Mason, W. T. , Academic. New York. 389-404 (1993).
- Yuste, R. Dendritic Spines. , MIT Press. (2010).
